雞副嗜血桿菌的分離鑒定

雞副嗜血桿菌的分離與鑒定摘要：雞副嗜血桿菌可以引起雞傳染性鼻炎(IC),以鼻炎和鼻竇發(fā)炎、結(jié)膜炎、流鼻涕、打噴嚏、面部腫脹為主要癥狀。對養(yǎng)禽業(yè)帶來重大的經(jīng)濟損失。本文根據(jù)細菌的分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、血凝試驗、易感動物回歸試驗及PCR鑒定對副嗜血桿菌進行分離與鑒定。關(guān)鍵詞：雞副嗜血桿菌、分離、鑒定自20世紀80年代以來，許多國家和地區(qū)均有爆發(fā)雞副嗜血桿菌病的報道，且近期雞副嗜血桿菌的發(fā)生率呈上升趨勢，它是集約化養(yǎng)雞場中重要的疫病之一。雞副嗜血桿菌可以引起雞傳染性鼻炎(IC)，以鼻炎和鼻竇發(fā)炎、結(jié)膜炎、流鼻涕、打噴嚏、面部腫脹為主要癥狀。本病多見于雛雞群和產(chǎn)蛋雞群，造成淘汰雞數(shù)顯著增加以及產(chǎn)蛋率顯著下降，同時易引起流感或新城疫的并發(fā)，造成雞場的重大經(jīng)濟損失。副雞嗜血桿菌(Haemophilusparagallinamm，Hpg)是一種引起雞急性上呼吸道疾病的致病菌。該呼吸道疾病俗稱雞傳染性鼻炎(Infectiouscoryza，IC)，臨床上以面部水腫、鼻竇炎、流淚為主要特征，可引起產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋量下降，育成雞的生長受阻、開產(chǎn)期推遲，肉雞增重下降，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失［1,2］。1920年，Beach首次對雞傳染性鼻炎進行了報道。1931年，DeBlieck成功分離了病原。自20世紀80年代以來，在我國河北、北京、云南、山東、湖北等省市先后爆發(fā)雞傳染性鼻炎。馮文達于1987年首先在北京分離到1株細菌，證實了副雞嗜血桿菌在我國的廣泛存在⑶。按照Page的分型方法，通過平板凝集試驗可將副雞嗜血桿菌分為A、B和C3個血清型⑷。喬朋波⑸研究表明不同血清型的副雞嗜血桿菌在生長特性、致病性、藥物敏感性和外膜蛋白結(jié)構(gòu)等方面均存在差異。目前，在我國副雞嗜血桿菌以A型和C型菌株的流行為主，部分地區(qū)己經(jīng)有B型株的存在⑹。流行于我國的不同血清型副雞嗜血桿菌的先后有分離與鑒定的報道。研究表明，相同血清型間有交叉保護作用，不同血清型之間無交叉保護作用［7,8］。雞副嗜血桿菌的生物學特征1.1形態(tài)特征和培養(yǎng)特性雞副嗜血桿菌為革蘭氏陰性菌，呈兩極染色特性，無運動性，經(jīng)24h培養(yǎng)，生長成短桿狀或球桿狀，單在、成雙或短鏈，長1?3pm，寬0.4?0.8pm。有毒力的菌株帶有莢膜。本菌在含10%CO2條件下，血瓊脂培養(yǎng)基上于37^培養(yǎng)24?48h，發(fā)育成青灰色、半透明、光滑、邊緣整齊、直徑約0.3mm的針尖狀菌落，不溶血，在斜射陽關(guān)下可見光滑型帶彩虹光和粗糙型無彩虹光型的菌落形態(tài)。本菌為兼性厭氧菌，需要V因子，葡萄球菌在生長過程中產(chǎn)生V因子。把雞副嗜血桿菌與葡萄球菌接種在同一血液瓊脂上，可在葡萄球菌菌落周圍發(fā)現(xiàn)旺盛生長的雞副嗜血桿菌，形似“衛(wèi)星”狀。本菌是唯一不能發(fā)酵海藻糖、半乳糖，有氧化氫酶陰性的嗜血桿菌。1.2抗原性和抵抗力該菌分成A、B、C3個血清型。A和C型有夾膜，致病力較強；B型無夾膜，致病力一般較弱。不同血清型之間無交叉保護力，同一血清型的不同亞型之間有部分交叉保護力。目前，我國分離鑒定的雞副嗜血桿菌主要是A型，其次為C型，B型偶有發(fā)生。副嗜血桿菌在離開雞體后抵抗力非常弱。培養(yǎng)基上的細菌在4°C時能存活2周，在自然環(huán)境中數(shù)小時即死亡；45°C?55°C于2?10min死亡，在真空冷凍條件下可以保存10年。一般消毒藥均能將其殺死。感染雞副嗜血桿菌的流行病學、癥狀與病理變化雞是副嗜血桿菌的自然宿主，病原菌由鼻孔侵入，主要在鼻腔和眶下竇的黏膜上增殖，并隨鼻液排出。各種周齡的雞均易感，初產(chǎn)蛋雞最敏感，病程一般為1?2周。傳染源為病雞和隱性帶菌雞，主要通過空氣和塵埃，也可經(jīng)污染的飼料、飲水用具、飼養(yǎng)人員的流動而傳播。本病潛伏期很短，鼻腔接種病雞分泌物24?48h即發(fā)病。自然感染潛伏期為1?3d。最初，病雞無明顯癥狀，僅見鼻中有稀薄水樣鼻液，打噴嚏。幾天后大批雞感染，發(fā)病率可高達90%以上。成雞鼻腔內(nèi)流出漿液性或粘液狀分泌物，堵塞鼻孔而出現(xiàn)呼吸困難和甩頭。隨后面部發(fā)炎，眼腫脹流淚，有膿性干酪樣分泌物堆積。嚴重的整個頭部腫大，失明。雛雞發(fā)病常見張口呼吸，眼瞼粘著，多因覓食和行動困難而饑餓、衰竭死亡，幸存雛雞發(fā)育停滯或增重緩慢，淘汰率一般在30%以上。蛋雞除表現(xiàn)成雞癥狀外，開產(chǎn)期延遲，產(chǎn)蛋量下降。剖檢可見鼻腔、眶下竇和眼結(jié)膜的急性卡他性炎癥變化，面部及肉垂的皮下水腫。病程較長的可在氣囊、腹腔和輸卵管內(nèi)見有乳黃色干酪樣分泌物。產(chǎn)蛋雞卵泡松軟、血腫、壞死或萎縮，腹膜炎，公雞睪丸萎縮。病理組織學檢查，可見鼻腔、眶下竇和氣管黏膜上皮細胞脫落、裂解和增生，黏膜固有層充血、水腫并伴有異染性細胞浸潤。材料與方法含輔酶I的雞肉湯瓊脂平板、兔全血平板、麥康凱瓊脂、巧克力瓊脂平板、革蘭氏染色液等，均為自制；dNTP、PCRburet、TaqDNA聚合酶、DNAMarkerDL2000、均購自生工生物丁程（上海）有限公司；其他試劑，均為分析純。3.2細菌的分離培養(yǎng)和鏡檢用滅菌的棉簽蘸取病雞眼瞼、鼻竇分泌物，接種于血平板，于37qC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后觀察菌落。若出現(xiàn)疑似的單個菌落，進行純化培養(yǎng)。挑取單個菌落進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察細菌的形態(tài)特征。以無菌拭子采集2?4月份急性發(fā)病雞眶下竇分泌物，也可采取氣管或氣囊分泌物，在雞血瓊脂平板上劃線，然后再以葡萄球菌（能產(chǎn)生V因子）作為“飼養(yǎng)菌”在平板上交叉劃線，置于帶螺絲蓋的大光口蠟燭瓶中于37r培養(yǎng)，蠟燭自行熄滅。3.3衛(wèi)星現(xiàn)象觀察⑶取鮮血平板，培養(yǎng)基的平皿，一個劃線接種所分離純化的、疑似副雞嗜血桿菌細菌，并點種分離的金黃色葡萄球菌，于5%CO,培養(yǎng)箱中37r培養(yǎng)48h，觀察其是否在葡萄球菌周圍長出“衛(wèi)星現(xiàn)象”。3.4血凝試驗挑取菌落用生理鹽水稀釋，振蕩均勻后制成菌體懸液。在載玻片的一端，滴加菌體懸液50l，另一端加入50l生理鹽水，兩端再各加入50ll%雞血紅細胞，輕輕晃勻。在溫箱內(nèi)反應3min左右后，觀察結(jié)果。3.5引物設計參考已發(fā)表的副雞嗜血桿菌基因序列⑻，設計并合成1對引物：N1：5’一tgagggtagtcttgcacgcgaat一3’：R1：5，-caaggtategatcgtctctctact一3’，擴增片段大小為464bp。.6PCR鑒定挑取純化培養(yǎng)的單菌落接種于3Inl營養(yǎng)肉湯中，5%CO:培養(yǎng)箱37r培養(yǎng)48h。按照煮沸法，提取菌液DNA為模板，以大腸桿菌DNA為對照，進行PCR。PCR反應體系（251）:mix12.5l，ddH，05.5，Nlll，R1lIxl，DNA模板5l。PCR反應條件為：95r預變性5min:95°C30S，59cc30S，72oC45S，共35個循環(huán)；72C延伸10arin。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。3.7動物回歸試驗從某雞場購買6只90日齡育成雞（無傳染性鼻炎疫苗接種史和發(fā)病史）。3只眶下竇接種分離菌株的肉湯培養(yǎng)物0.1ml（約2X10。個細菌/ml）,另外3只眶下竇接種肉湯作為對照。然后，每日觀察臨床癥狀，對出現(xiàn)典型癥狀的雞，采集眶下竇分泌物于全血平板上分離培養(yǎng)。結(jié)果與分析.1細菌分離情況病雞鼻竇和眼瞼分泌物在麥康凱瓊脂巧克力瓊脂平板上，均無菌生長。在輔酶I的肉湯瓊脂上和全血平板上生長灰白色、邊緣整齊、表面光滑、有輕度隆起、粘液狀、濕潤、有光澤、不透明的菌落。挑取菌落涂片，染色、鏡檢，可見有大量的單個、成對或短璉的兩極濃染的革蘭氏陰性細小桿菌[9]4.2衛(wèi)星現(xiàn)象在葡萄球菌交叉劃線的固體培養(yǎng)基上，37^培養(yǎng)48h，在葡萄球菌周圍有明顯的“衛(wèi)星現(xiàn)象”。4.3PCR鑒定結(jié)果應用副雞嗜血桿菌特異性引物進行PCR擴增，從分離菌株擴增出464bp大小的條帶，與目的片段大小一致，而大腸桿菌沒有擴增出特異性條帶，證實該分離株為副雞嗜血桿菌。4.4血凝活性經(jīng)觀察，雞血紅細胞未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，該分離株沒有血凝性。這說明分離株為c型副雞嗜血桿菌。雞副嗜血桿菌的3種血清型具有共同抗原，用一種血清型菌株制備的凝集抗原可用于檢測3種血清型的抗體。應用平板或試管凝集試驗，在感染本病后7?14d可檢出副嗜血桿菌凝集素。應用瓊脂擴散試驗，在感染或免疫后2周可檢出抗體并至少持續(xù)11周。應用血凝抑制試驗可檢出與保護性免疫密切相關(guān)的血清型特異的抗原抗體。4.5動物回歸試驗將該株分離菌接種易感雞24h后，3只接種雞均出現(xiàn)食欲減少，臉部和眼瞼部水腫流淚、流水樣鼻汁。從人工感染雞的眶下竇中分離，經(jīng)PCR鑒定為副雞嗜血桿菌。對照組既沒有出現(xiàn)癥狀，也沒有從眶下竇分離到副雞嗜血桿菌。.討論副雞嗜血桿菌是引起雞傳染性鼻炎的致病菌，可引起感染雞群嚴重的上呼吸道疾病。副雞嗜血桿菌和大腸桿菌病原引起的疾病在流行病學、臨床癥狀上較為相似，易混淆[6-10]。一般情況下通過病原的分離與鑒定就可以確定病因，但是副雞嗜血桿菌的生物學特性較為復雜，對培養(yǎng)條件的要求苛刻，在培養(yǎng)過程中需加入輔酶和血清等，常規(guī)生化鑒定操作耗時費力，而且容易污染。根據(jù)細菌的分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、血凝試驗、易感動物回歸試驗及PCR鑒定結(jié)果，初步證實了從疑似雞傳染性鼻炎的病雞分離的菌株為c型副雞嗜血桿菌。，大多種雞場都進行傳染性鼻炎疫苗的免疫，但是商品雞較少進行免疫[11-12]。，分離的副雞嗜血桿菌不具有血凝性，初步確定為C型副雞嗜血桿菌[13]。參考文獻SAIFYM，BARNESHJ，F(xiàn)ADLYAM，eta1.Diseasesofpl~ry[M].1lthedition.Iowa：IowaStateUniversityPress.2003：691一703.POERNOMOS，SUTARMA，RAFIEEM，eta1.CharacterisationofisolatesofHaemophilusparagallinarumfromIndonesia[J].AustVetJ，20OO，78(11)：759—762.馮文達.北京雞傳染性鼻炎病原菌的分離鑒定[J].微生物學通報，1987，(5)：216—219.史麗華.錦州地區(qū)雞傳染性鼻炎的流行病學調(diào)查[J].畜牧與獸醫(yī)，2010，42(6):81—83喬朋波.不同血清型副耆血桿菌差異的比較[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學，201I.朱士盛，王薪.青島地區(qū)雞傳染性鼻炎病原株的分離鑒定與定型研究[J].中國動物檢疫，1994，11(4)：6—8.史雪萍，周國政，馬鳳龍，等?雞傳染性鼻炎的病原診斷與防治[J].萊陽農(nóng)學院學報，2005(3)：213—215.MOUAHIDM，BISGAARDMW，M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