儀器分析色譜法的基本原理

儀器分析色譜法的基本原理第一頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六本章基本要求⒈理解混合物中各組分在色譜柱內(nèi)分離的原因；⒉了解色譜流出曲線和術(shù)語(yǔ)；⒊理解柱效率的物理意義及計(jì)算方法；⒋理解速率理論方程對(duì)實(shí)際分離的指導(dǎo)意義；⒌掌握分離度的計(jì)算方法及影響分離度的色譜參數(shù)。第二頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六2.1

概述2.1.1色譜法發(fā)展史色譜法是俄國(guó)植物學(xué)家Tswett（茨維特）于1903年首先提出的。他把植物色素的石油醚抽提液倒入一根裝有固體碳酸鈣顆粒（固定相）的豎直玻璃管（色譜柱）中，并再?gòu)墓艿纳喜考尤爰兊氖兔眩鲃?dòng)相），任其自由流下。這時(shí)植物色素的抽提液沿玻璃管流動(dòng)，在管內(nèi)形成具有不同顏色的色帶，每個(gè)色帶代表不同的組分。--------“色譜”（色層）因而得名第三頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六胡蘿卜素（橙色）植物色素葉綠素（綠色）葉黃素（黃色）石油醚CaCO3固定相1941年，Martin、Syuge發(fā)明了液－液色譜。1952年，James、Martin發(fā)明了氣相色譜。20世紀(jì)60年代，出現(xiàn)了高效液相色譜。第四頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六⑴色譜法：借助在兩相間分配系數(shù)的差異，而使混合物中各組分獲得分離的技術(shù)稱(chēng)為色譜分離技術(shù)。⑵固定相：填充柱內(nèi)的填料（固體或液體）。⑶流動(dòng)相：攜帶樣品流過(guò)固定相(氣體、液體和超臨界流體)。⑷色譜柱：裝有固定相的柱。色譜分離過(guò)程：當(dāng)流動(dòng)相中攜帶混合物經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，與固定相發(fā)生作用，由于各組分的結(jié)構(gòu)性質(zhì)（溶解度、極性、蒸汽壓和吸附能力等）不同，這種相互作用產(chǎn)生強(qiáng)弱的差異。在同一推動(dòng)力的作用下，不同組分在固定相滯留時(shí)間長(zhǎng)短不同，按先后不同的次序從固定相中流出。幾個(gè)基本術(shù)語(yǔ)：第五頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六

氣相色譜--------用氣體作流動(dòng)相

液相色譜--------用液體作流動(dòng)相由于固定相可分為固體吸附劑和涂在固體擔(dān)體上或毛細(xì)管內(nèi)壁上的液體固定相，故可將色譜法分為下述四類(lèi)：

氣–固色譜氣體固體

流動(dòng)相固定相

液體液體

1、按兩相所處的狀態(tài)分類(lèi)液-固色譜氣-液色譜液–液色譜2.1.2色譜法分類(lèi)第六頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六①柱色譜：固定相裝在柱管內(nèi)。它又可分為填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜。固定相裝在色譜柱（玻璃管或毛細(xì)管）內(nèi)。②紙色譜：用濾紙作固定相或載體，把試樣液體滴在濾紙上，用溶劑將它展開(kāi)，根據(jù)其在紙上有色斑點(diǎn)的位置與大小，進(jìn)行鑒定與定量測(cè)定。③薄層色譜：將固定相研磨成粉末，再涂敷成薄膜。樣品的分離形式類(lèi)似紙色譜。2、按固定相形狀分類(lèi)第七頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六①

吸附色譜（L-S，G-S）：利用吸附劑對(duì)不同組分物理吸附性能的差異進(jìn)行分離。

②

分配色譜（L-L，G-L）：利用不同組分在兩相中分配系數(shù)的不同進(jìn)行分離。在液-液分配色譜中，根據(jù)流動(dòng)相和固定相相對(duì)極性不同，又分為正相分配色譜和反向分配色譜。③

離子交換色譜（L-S）：利用組分離子與離子交換劑的交換能力不同進(jìn)行分離。④

空間排阻色譜（凝膠色譜法，L-S）：用多孔物質(zhì)對(duì)不同大小分子的阻礙作用進(jìn)行分離。固定相是一種分子篩或凝膠，利用各組分的分子體積大小不同而進(jìn)行分離的方法。⑤親和色譜：利用不同組分與固定相的高專(zhuān)屬性親合力進(jìn)行分離的技術(shù)，常用于蛋白質(zhì)的分離。3、按分離過(guò)程的物理化學(xué)原理分類(lèi)第八頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六色譜法的分類(lèi)大致如下：

根據(jù)以上所述，將色譜法的分類(lèi)總結(jié)于下表中：第九頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六2.2色譜分離原理2.2.1分配系數(shù)和分配比分配系數(shù)：分配比k（又稱(chēng)容量因子）定義：在一定的溫度、壓力下，組分在氣–液兩相間達(dá)平衡時(shí)，分配在液相中的重量與分配在氣相中的重量之比。即s：固定相m：流動(dòng)相k

隨柱溫、柱壓、相體積變化，由組分及固定液的熱力學(xué)性質(zhì)決定β：相比第十頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六進(jìn)樣A＋B＋空氣BAA+B流動(dòng)相BBA流動(dòng)相固定相檢測(cè)和紀(jì)錄2.2.2分離原理例：氣相色譜法——載氣（即流動(dòng)相，是一種不與待測(cè)物作用、用來(lái)載送試樣的惰性氣體，如氮?dú)獾龋┹d著待分離的試樣通過(guò)色譜柱中的固定相，使試樣在兩相中發(fā)生反復(fù)多次的分配，最后使各組分分離，然后分別檢測(cè)，記錄各自的響應(yīng)信號(hào)。第十一頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六2.3色譜流出曲線色譜流出曲線（色譜圖）即色譜柱流出物通過(guò)檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間的曲線圖，其縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為保留時(shí)間。峰高←色譜峰保留時(shí)間（分）響應(yīng)值第十二頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六第十三頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六1、有關(guān)術(shù)語(yǔ)①基線：柱中僅有流動(dòng)相通過(guò)時(shí)，檢測(cè)器響應(yīng)訊號(hào)的記錄值，即圖中O-t線。穩(wěn)定的基線應(yīng)該是一條水平直線。②峰高：色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離，h③標(biāo)準(zhǔn)偏差④峰面積A⑤半峰寬Y1/2

=2.354⑥峰底寬Y=4、Y1/2、Y：區(qū)域?qū)挾鹊谑捻?yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六死時(shí)間tm:

不被固定相吸附或溶解的組分進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度最大值所需的時(shí)間。對(duì)于氣相色譜，常把空氣(TCD)和甲烷(FID)從進(jìn)樣到出峰的時(shí)間稱(chēng)為tm。如圖中O-A’。這種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，其流速與流動(dòng)相的流速接近。測(cè)定流動(dòng)相平均線速度ū時(shí)可用柱長(zhǎng)L與死時(shí)間tm的比值計(jì)算。2、保留值第十五頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六保留時(shí)間tR

試樣從進(jìn)樣開(kāi)始到柱后出現(xiàn)色譜峰極大值所需要時(shí)間。如圖中O-B。它相應(yīng)于樣品到達(dá)檢測(cè)器所需的時(shí)間。

tR=tR′+tm調(diào)整保留時(shí)間tR′

扣除死時(shí)間后的組份保留時(shí)間，即

tR′=tR

tm

組分在色譜柱中的保留時(shí)間tR包含了組分隨流動(dòng)相通過(guò)柱子所需的時(shí)間和組分在固定相中滯留的時(shí)間；tR′實(shí)際上是組分在固定相中滯留的時(shí)間。單位(s)或(cm)。第十六頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六死體積Vm

不能被固定相滯留的（惰性）組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值時(shí)所消耗的流動(dòng)相的體積。死體積可由死時(shí)間與流動(dòng)相體積流速F0（L／min）計(jì)算：

Vm=tm·F0保留體積VR

從進(jìn)樣開(kāi)始到柱后被測(cè)組份出現(xiàn)濃度最大值時(shí)所通過(guò)的流動(dòng)相體積。如下：

VR=tR·F0第十七頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六調(diào)整保留體積VR′

某組份的保留體積扣除死體積后，稱(chēng)該組份的調(diào)整保留體積

VR′=tR′·F0或VR′=VR-Vm相對(duì)保留值α2,1

某組份2與組份1的調(diào)整保留值之比，是一個(gè)無(wú)因次量。α2,1的大小與兩組分的選擇性有關(guān)。α2,1越大，選擇性越好，越容易分離。α2,1只與柱溫及固定相的性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長(zhǎng)、填充情況及流動(dòng)相流速無(wú)關(guān)。因此是色譜法中，特別是氣相色譜法中廣泛使用的定性數(shù)據(jù)。第十八頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六

從色譜流出曲線上，可以得到許多重要信息：①根據(jù)色譜峰個(gè)數(shù)，可以判斷樣品中所含組份的最少個(gè)數(shù)。②根據(jù)色譜峰的保留值（或位置），可以進(jìn)行定性分析。③根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析。④色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾?，是評(píng)價(jià)色譜柱分離效能的依據(jù)。⑤色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相(和流動(dòng)相)選擇是否合適的依據(jù)。第十九頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六在自然科學(xué)上，科學(xué)理論：假設(shè)理論模型(數(shù)學(xué)表達(dá)式)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證修改模型完善1.塔板理論假設(shè)①在每塊塔板上氣液平衡是瞬間建立的。②載氣以脈沖式(塞子式)進(jìn)入色譜柱進(jìn)行沖洗，每次恰好為一個(gè)塔板體積。③所有組分開(kāi)始都加在第零號(hào)塔板上，且不考慮沿色譜柱方向的縱向擴(kuò)散。④在所有塔板上同一組分的分配系數(shù)是常數(shù)，和組分的量無(wú)關(guān)。⑤柱分成幾段，n為理論塔板數(shù)，每段高為H，柱長(zhǎng)為L(zhǎng)，n=L/H。2.4塔板理論第二十頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六假定：K=1Vs/Vm=1k=1n=5進(jìn)樣量w=10.50.50.250.250.250.250.1250.250.1250.12550.250.1250.06250.1880.1880.06250.06250.1880.1880.06250.031250.1250.1880.1250.031250.031250.1250.1880.1250.03125w=1μg1ΔV2ΔV3ΔV4ΔV①分布有一最大，兩邊逐漸減小②最大及整個(gè)分布曲線向后推移③流出曲線方程（塔板理論方程）在此檢測(cè)得到位移隨時(shí)間變化曲線第二十一頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六這一理論得到結(jié)果：1．分布有一最大，兩邊逐漸減??；2．最大及整個(gè)分布曲線向后推移；3．流出曲線方程(也稱(chēng)塔板理論方程)，即數(shù)學(xué)表達(dá)式：C：不同流出體積時(shí)的組分濃度m：進(jìn)樣量VR：保留體積N：塔板數(shù)V：流出體積SV(t,x)被測(cè)物流出色譜柱時(shí)流動(dòng)相中被測(cè)物濃度隨體積(或時(shí)間)的變化曲線：第二十二頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六在氣相色譜柱內(nèi)，理論塔板數(shù)一般達(dá)103～106。塔板數(shù)越多，其流出曲線越接近于正態(tài)分布。根據(jù)塔板理論可以導(dǎo)出N與色譜峰半寬度或峰底寬度的關(guān)系：理論塔板高度H：色譜峰W越小，N越大，H越小，柱效能越高。因此，N和H是描述柱效能的指標(biāo)。在實(shí)際工作中，計(jì)算出來(lái)的N和H值時(shí),有時(shí)并不能充分地反映色譜柱的分離效能，因?yàn)橛胻R計(jì)算時(shí)，沒(méi)有扣除死時(shí)間tm，應(yīng)予扣除。所以用tR′代替tR計(jì)算出來(lái)的N值稱(chēng)為有效理論塔板數(shù)Neff。

第二十三頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六為了準(zhǔn)確評(píng)價(jià)色譜柱效能，宜采用有效塔板數(shù)Neff和有效塔板高度Heff。有效塔板數(shù)Neff和有效塔板高度Heff消除了死體積影響，較真實(shí)的反映了色譜柱的好壞。

有效塔板高度：根據(jù)tR′=tR-tm，k=

tR′/tm，tR=tm(1+k)，可得第二十四頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六⒉塔板理論的成功與局限⑴成功①導(dǎo)出流出曲線數(shù)學(xué)表達(dá)式(模型)；②解釋了流出曲線形狀、濃度極大點(diǎn)；③提出了評(píng)價(jià)柱效的參數(shù)(N)及其計(jì)算公式。⑵局限①僅考慮了熱力學(xué)因素，沒(méi)有考慮動(dòng)力學(xué)因素；②不能說(shuō)明影響柱效的原因及譜帶擴(kuò)張的原理；③不能說(shuō)明流速對(duì)柱效的影響，實(shí)驗(yàn)測(cè)得流速不同時(shí)N和H不同。速率理論第二十五頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六

2.5速率理論1956年荷蘭化學(xué)家VanDeemter等在研究氣-液色譜時(shí)，討論擴(kuò)散傳質(zhì)等與色譜過(guò)程物料平衡和質(zhì)量平衡的關(guān)系，考察溶質(zhì)通過(guò)色譜體系總濃度的變化。他提出了色譜過(guò)程動(dòng)力學(xué)理論—速率理論。隨后Giddings吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴(kuò)散和傳質(zhì)過(guò)程，認(rèn)為把色譜過(guò)程看作分子無(wú)規(guī)則運(yùn)動(dòng)的隨機(jī)過(guò)程，從而在動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)上較好地解釋了影響板高的各種因素。第二十六頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六該理論模型對(duì)氣相、液相色譜都適用。VanDeemter方程的數(shù)學(xué)簡(jiǎn)化式為:式中：u為流動(dòng)相的線速度；A，B，C為常數(shù)A——渦流擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)B——縱向分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)C——傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)（C＝C

s＋C

m)。其中C

s：固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)；C

m：流動(dòng)相傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)。第二十七頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六

A=2λdP

λ填充不規(guī)則因子dP填充物顆粒的平均直徑。影響A的因素：填充物顆粒大小dP和填充均勻性λ(取決于填充物顆粒的大小分布和裝柱情況）有關(guān),與載氣性質(zhì)、線速和組分無(wú)關(guān)。減小渦流擴(kuò)散提高柱效的有效途徑：使用適當(dāng)?shù)牧６惹翌w粒均勻的擔(dān)體，并盡量填充均勻。AB渦流擴(kuò)散項(xiàng)A第二十八頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u

B=2Dg

固定相填充在柱內(nèi)后使氣體擴(kuò)散路徑變彎曲的因素.Dg組分在氣相中的擴(kuò)散系數(shù)（cm2/s）。填充柱γ=0.5-0.7毛細(xì)管柱γ=1.0分子量大的組分Dg小，Dg反比于載氣密度（分子量）的平方根,故采用分子量較大的載氣可使B項(xiàng)降低。保留時(shí)間長(zhǎng),分子擴(kuò)散項(xiàng)對(duì)色譜峰變寬的影響顯著.第二十九頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六Cgu

--氣相傳質(zhì)阻力項(xiàng)；Cg--氣相傳質(zhì)阻力系數(shù);Clu--液相傳質(zhì)阻力項(xiàng)；Cl--液相傳質(zhì)阻力系數(shù)傳質(zhì)阻力項(xiàng)Cu Cu=Cgu+Clu＝(Cg+Cl)u

氣相傳質(zhì)過(guò)程：氣相傳質(zhì)阻力項(xiàng)與填充物粒度的平方成正比，與組分在載氣流中的擴(kuò)散系數(shù)成反比，因此采用粒度小的填充物和分子量小的氣體作載氣可提高柱效。液相傳質(zhì)過(guò)程：減小液膜厚度，增大組分在液相中的擴(kuò)散系數(shù)，均可提高柱效。第三十頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六⒉速率理論的要點(diǎn)⑴被分離組分分子在色譜柱內(nèi)運(yùn)行的多路徑、濃度梯度所造成的分子擴(kuò)散及傳質(zhì)阻力使氣-液兩相間分配平衡不能瞬間達(dá)到等因素是造成色譜峰擴(kuò)展、柱效下降的主要原因。⑵通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６?、載氣種類(lèi)、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。⑶速率理論為色譜分離和操作條件的選擇提供了理論指導(dǎo)，闡明了流速和柱溫對(duì)柱效及分離的影響。⑷各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴(kuò)散項(xiàng)的影響減小，使柱效提高，但同時(shí)傳質(zhì)阻力項(xiàng)的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加劇了分子擴(kuò)散的影響。因此，選擇最佳條件，才能使柱效達(dá)到最高。第三十一頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六速率理論液相色譜法（P19）第三十二頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六2.6分離度一、定義分離度是兩色譜峰分離的程度。圖中：a）兩色譜峰距離近并且峰形寬。兩峰嚴(yán)重相疊，表示選擇性和柱效都很差。b）兩峰距離拉開(kāi)，但峰形仍很寬，說(shuō)明選擇性好，但柱效低。c）分離最理想，說(shuō)明選擇性好，柱效也高。第三十三頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六tR（2），tR（1）：兩組分保留時(shí)間Y1，Y2：兩組分色譜峰峰底寬度分離度Rs單獨(dú)用柱效或選擇性不能真實(shí)反映組分在色譜柱中分離情況，故需引入一個(gè)綜合性指標(biāo)。分離度是既能反映柱效率又能反映選擇性的指標(biāo)，稱(chēng)總分離效能指標(biāo)。分離度又叫分辨率，它定義為相鄰兩組分色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰底寬總和之半的比值。第三十四頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期六同一色譜柱在相同條件下，不同組分可有不同的Rs值。若峰形對(duì)稱(chēng)且滿(mǎn)足正態(tài)分布條件，當(dāng)Rs=1時(shí)，分離程度可達(dá)到98%；Rs=1.5時(shí)，分離程度可達(dá)到99.7%，通常用Rs=1.5作為相鄰兩色譜峰完全分開(kāi)的標(biāo)志。兩個(gè)相鄰組分達(dá)到完全分離的條件：（1）兩色譜峰間有一定距離；（2）兩色譜峰寬必須窄。Rs=0.75Rs