唾液作為寄生蟲(chóng)病診斷標(biāo)本的研究

唾液作為寄生蟲(chóng)病診斷標(biāo)本的研究

唾液作為標(biāo)本診斷某些疾病已受到很多學(xué)者的重視，在病毒如HIV、HBV、麻疹、風(fēng)疹病毒[1,2,3]和細(xì)菌如百日咳桿菌等病原體引起的感染性疾病中已見(jiàn)實(shí)際應(yīng)用。在寄生蟲(chóng)感染的診斷中雖然目前的研究尚不多見(jiàn)，但因唾液具標(biāo)本收集較為方便、非損傷性、易為病人接受等優(yōu)點(diǎn)，也引起了寄生蟲(chóng)學(xué)界的重視。本文旨在將近年來(lái)國(guó)外有關(guān)唾液標(biāo)本用于寄生蟲(chóng)病診斷的研究進(jìn)展作一簡(jiǎn)要綜述。

1唾液標(biāo)本的組成及收集處理

唾液為口腔中的三對(duì)大唾液腺(腮腺、頜下腺、舌下腺)及分布于上下唇、頰部等處的小唾液腺所分泌的液體，包含有水、糖蛋白、溶菌酶、過(guò)氧化物酶、乳鐵蛋白、碳酸氫鹽和磷酸鹽構(gòu)成的緩沖系統(tǒng)及免疫球等蛋白多種成分。寄生蟲(chóng)病檢測(cè)所有標(biāo)本多為取自口腔的全唾液，其中不僅包括來(lái)自各種誕腺的混合的分泌物，亦包括脫落的上皮細(xì)胞、軟組織的微生物及來(lái)自齦裂內(nèi)的液體等[17]。正常人每日全唾液的分泌量約為1－升，其pH值在－之間，唾液中的蛋白質(zhì)濃度為－1g/100ml，較血漿中低100倍左右。唾液中含有多種免疫球蛋白，主要為由唾液腺局部的漿細(xì)胞產(chǎn)生的分泌型IgA(SIgA)，由血清經(jīng)齦溝滲入口腔的IgG、IgA和少量IgM與IgE[4,5]。每100ml唾液中IgA、IgG與IgM的含量分別為、、，大約為血清濃度的1/10，1/800與1/400[1]。唾液中的免疫球蛋白的含量雖遠(yuǎn)低于血清，但Parry[1]用放射免疫分析(RIA)與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等方法檢測(cè)免疫缺陷病毒、甲型肝炎與風(fēng)疹病毒感染者唾液中的特異性抗體后認(rèn)為，唾液中的抗體的水平已足夠用于一些免疫學(xué)診斷，唾液中的IgG一般多用來(lái)診斷組織及血液內(nèi)的寄生蟲(chóng)。Challacombe將放射性125I標(biāo)記IgG注入恒河猴體內(nèi)，30分鐘后標(biāo)記物便可出現(xiàn)于口腔唾液中，從而證實(shí)唾液中IgG可及時(shí)反應(yīng)體內(nèi)IgG的存在。此外，Ascota發(fā)現(xiàn)無(wú)牙或牙齒較少者唾液中IgG含量下降而牙周病患者中唾液IgG水平上升。對(duì)腸道寄生蟲(chóng)病的診斷多采用檢測(cè)唾液中的SIgA。有研究者發(fā)現(xiàn)腸道粘膜相關(guān)淋巴組織抗原刺激后產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，可表現(xiàn)在全身各粘膜部位，在唾液等處可檢測(cè)的分泌性免疫反應(yīng)物質(zhì)在血液可能缺如。

非刺激性的全唾液的收集可以通過(guò)使唾液從下唇滴入漏斗，然后放進(jìn)刻度管內(nèi)。刺激后唾液的收集，可使受試者咀嚼一些對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)影響的物質(zhì)如橡皮圈等，以刺激唾液的分泌。目前廣泛使用的方法是讓病人將棉花球放入口中，用舌翻動(dòng)，特別是使之接觸齒齦的部位，待浸濕后取出抗出唾液。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，可用電流刺激分泌神經(jīng)或使用藥物增強(qiáng)唾液分泌，以助采集。

由于有細(xì)胞碎屑及沉淀的粘液素，全唾液往往很粘稠且為非均質(zhì)，用于免疫診斷時(shí)需于低溫下經(jīng)14000g以上的高速離心以去除雜質(zhì)。需長(zhǎng)期促存時(shí)可使用硫柳汞防腐，但不宜使用疊氮納以免干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。唾液中的許多有機(jī)成分會(huì)因細(xì)菌酶和低滲唾液中白細(xì)胞分解后放出的酶作用而很快分解，故唾液在收集后應(yīng)立即進(jìn)行分析或冰凍保存。亦有研究者將收集后的唾液于56℃溫育45分鐘，以減少唾液中的酶類(lèi)對(duì)有機(jī)成分的分解作用。

2檢測(cè)方法

由于唾液中免疫球蛋白的含量較低，故宜采用較敏感的方法。在免疫診斷方法中，ELISA因其操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用較低而應(yīng)用較多，特別是間接ELISA已在豬囊尾蚴、阿米巴原蟲(chóng)、剛地弓形蟲(chóng)等寄生蟲(chóng)引起的疾病中廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，研究者對(duì)抗原進(jìn)行了改進(jìn)，如在腦囊尾蚴病診斷中，Planlarte通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)分離豬囊尾蚴的蛋白質(zhì)抗原，以免疫印跡試驗(yàn)(Westernblotting)篩選出組分抗原GP24，用于檢測(cè)豬囊蟲(chóng)病，特異性良好。藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)膜蛋白經(jīng)SDS分離出的24個(gè)抗原片段，經(jīng)唾液標(biāo)本的篩選，分子量為120，105，92，66，32，29，14kDa的片段被認(rèn)為有特異性，具診斷潛力。由于新型診斷抗原的使用，間接ELISA的特異性與敏感性都有所提高。

酶聯(lián)免疫轉(zhuǎn)移印跡試驗(yàn)(EITB)在唾液樣本的檢測(cè)中亦被使用，此種方法敏感性與特異性均較高，但操作復(fù)雜，費(fèi)用較高，需一定的設(shè)備，多用于研究工作。Feldmen[10]和Flisser[11]曾用EITB技術(shù)檢測(cè)患者唾液中的特異性IgG抗體以診斷腦囊蟲(chóng)病。Feldmen發(fā)現(xiàn)其中抗原片段GP24最易被唾液中的IgG所識(shí)別。

直接凝集試驗(yàn)(DAT)檢測(cè)唾液特異性IgG抗體曾MusummA[12]用來(lái)診斷黑熱病，因其操作簡(jiǎn)單、唾液標(biāo)本用量較少，而適用于內(nèi)臟利什曼病的流行病學(xué)的調(diào)查[12]。

此外，亦將有染料試驗(yàn)(DT)用于診斷唾液中抗剛地弓形蟲(chóng)抗體的報(bào)道[13]。

3在寄生蟲(chóng)病診斷中的應(yīng)用

阿米巴病

阿米巴病的診斷多依靠在糞便中查找病原體。但糞便檢查費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，需有經(jīng)驗(yàn)的工作人員，且不適于大規(guī)模的普查。Muro[14]在墨西哥阿米巴病流行區(qū)，以糞檢病原體、ELISA方法檢測(cè)糞便中溶組織內(nèi)阿米巴物異性膜抗原與唾液中檢測(cè)特異性抗體三種方法，對(duì)223名5－14歲學(xué)生進(jìn)行普查后發(fā)現(xiàn)，唾液中特異性IgA檢測(cè)的敏感性為85％，特異性達(dá)98％。此結(jié)果與糞中抗原檢測(cè)的結(jié)果無(wú)差異(r＝，P＜)，也與糞便中病原體檢查的結(jié)果一致。由于唾液檢測(cè)較為方便，且比血清與糞便檢查便宜，認(rèn)為可適用于流行病學(xué)調(diào)查。Muro同時(shí)發(fā)現(xiàn)人群中阿米巴原蟲(chóng)的感染率與唾液中IgA檢測(cè)的敏感性呈正相關(guān)，與特異性負(fù)相關(guān)。當(dāng)人群感染率＜5％時(shí)，其特異性＞99％，敏感性＜60％，感染率＞70％時(shí)的特異性為70％，敏感性達(dá)99％。Aceti[15]檢測(cè)了阿米巴病患者、阿米巴帶蟲(chóng)者和健康人唾液中的特異性抗體后發(fā)現(xiàn)，IgA在侵襲性阿米巴病患者唾液中顯著升高，而無(wú)癥狀帶蟲(chóng)唾液中的IgA水平與健康人無(wú)差異。故認(rèn)為唾液中IgA抗體僅適合于診斷侵襲性阿米巴病，對(duì)阿米巴帶蟲(chóng)者無(wú)價(jià)值。此外，研究者亦有報(bào)道唾液中抗溶組織內(nèi)阿米巴IgA抗體在治療后45天可消失，成人與兒童感染阿米巴后分泌性免疫應(yīng)答相似。Brian[16]以260kDa半乳糖抑制性粘附蛋白(GIAP)為診斷抗原，用ELISA方法檢測(cè)了13名阿米巴肝膿腫患者(其中4名為經(jīng)甲硝唑治療病人)唾液中抗GIAP抗體IgA與血清中的IgG。發(fā)現(xiàn)兩者均明顯升高，但兩者之間不相關(guān)，而治療與未治療病人唾液中的IgA水平無(wú)差異。

弓形蟲(chóng)病

Hajeer[12]經(jīng)人體實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)人們感染弓形蟲(chóng)后，唾液中11天即可查見(jiàn)IgM抗體，27天后查見(jiàn)IgG抗體，兩者在81天后轉(zhuǎn)陰。而IgA可在急性、慢性感染，及血清檢測(cè)陰性感染有唾液中均可查見(jiàn)，從而認(rèn)為唾液中IgG、IgM對(duì)急性弓形蟲(chóng)病具有診斷潛力，而唾液中IgA的水平對(duì)急、慢性弓形蟲(chóng)病無(wú)鑒別意義。Loyela對(duì)60人進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查后證實(shí)唾液中抗弓形蟲(chóng)IgA水平可反映血清IgG水平。唾液中的IgA檢測(cè)可用于弓形蟲(chóng)病的檢測(cè)，而唾液中的IgG不適于慢性弓形蟲(chóng)感染的流行病學(xué)調(diào)查。

唾液標(biāo)本除用于免疫學(xué)診斷外，還可用于病原學(xué)檢查。Amendoeira[17]曾在一名3歲幼童唾液及扁桃體中查找到剛地弓形蟲(chóng)的滋養(yǎng)體。而Terragna[18]將弓形蟲(chóng)感染兔的唾液接種小鼠后發(fā)現(xiàn)，在33％感染兔的唾液中有病原體存在，從面證實(shí)唾液在弓形蟲(chóng)傳播中的媒介作用。但Amesto[19]在檢測(cè)了26位艾滋病人(其中6例明確診斷并發(fā)弓形蟲(chóng)病)的唾液，結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)弓形蟲(chóng)，故認(rèn)為在艾滋病人唾液中尋找弓形蟲(chóng)病原體以診斷弓形蟲(chóng)病的意義不大。

杜氏利什曼原蟲(chóng)病

杜氏利什曼原蟲(chóng)感染引起的內(nèi)臟利肝什曼病的免疫診斷多依靠血清學(xué)檢查。Masum[12]以DAT檢測(cè)了19例黑熱病人唾液中的特異性抗體，18例唾液檢測(cè)呈陽(yáng)性結(jié)果，且特異性為100％。由于唾液標(biāo)本檢測(cè)較為方便及安全，作者認(rèn)為可代替血清進(jìn)行免疫診斷。

藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)病

Disney[20]用ELISA法檢測(cè)24名藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)患者唾液中SIgA后發(fā)現(xiàn)，其SIgA水平與健康人有顯著性差異(P＜)。

豬囊尾蚴病

本病的臨床表現(xiàn)多樣而無(wú)特異癥狀，臨床診斷較為困難。目前較為有效的診斷方法包括計(jì)算機(jī)斷層掃描、核磁共振(MRI)、檢測(cè)腦積液與血清標(biāo)本中抗囊尾蚴抗體。但CT及MRI費(fèi)用較高，腦積液與血清檢測(cè)具有損傷性。有鑒于此，唾液中特異性抗體的檢測(cè)有望為本病提供較為理想的診斷方法。Acasta用豬帶絳蟲(chóng)囊尾蚴的粗提物作為診斷抗原，用ELISA方法檢測(cè)了43例腦囊病患者、34例非感染性腦部疾病患者及39名正常人唾液及血清中的特異性抗體后發(fā)現(xiàn)，唾液中特異性IgG的檢測(cè)對(duì)腦囊蟲(chóng)具有較高的診斷價(jià)值，但I(xiàn)gA的檢測(cè)無(wú)診斷意義。由于囊尾坳粗提物與扁蟲(chóng)有交叉抗原，故此方法僅適用于非血吸蟲(chóng)病及包蟲(chóng)病流行區(qū)。Feldman[10]用兩種方法(ELISA、EITB)檢測(cè)了28例腦囊蟲(chóng)病、29例非感染性腦部疾病及26名健康人唾液與血清中的特異性抗體后發(fā)現(xiàn)，ELISA檢測(cè)唾液中IgG的敏感性為％，高于血清標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果(％)。Feldman認(rèn)為EITB可作為血清診斷囊蟲(chóng)病較好的方法，而ELISA檢測(cè)唾液中的IgG抗體，因其無(wú)痛、無(wú)損傷性可應(yīng)用于臨床及流行病學(xué)調(diào)查。

絳蟲(chóng)病

Kinder[21]分析了豆?fàn)罱{蟲(chóng)(Taniapisiformis)感染犬唾液與血清中免疫球蛋白后認(rèn)為，唾液中特異性IgA與血清中IgG抗體可反映帶絳蟲(chóng)感染，這兩種抗體在感染后兩周上升，治療4周即顯著下降。由于唾液中IgA在絳蟲(chóng)產(chǎn)卵前已出現(xiàn)，治療后可消失。故可用于區(qū)分新舊感染。kinder認(rèn)為檢測(cè)唾液中的IgA對(duì)腸道絳蟲(chóng)病具診斷潛力。

參考文獻(xiàn)

1ParryJVet,1987;2(8550)72-75

2PerryKRetMedVirol,1993;40(3):235-240

3ArchibaldDWetInfDis,1987;155(4):793-796

4CohenHeinemannMedicalBooksLimited,1976

5MandelOralPatholMed,1990;1993):119-125

6ChallacombeSJetExpImmunol,1978;34(3):417-422

7AcostaClinLab;492):90-94

8LoyoalAMetOralPatholMed,1997;26(4):17-191

9PlancatreAetJParasitol,1994;24(5):733-738

10FeldmanMetRsocTropMedHyg,1990;84(4):559-562

11FlisserAetParasitolHumComp,1990;65(Suppl1):95-98

12MasumMAetRSocTropMedHyg,1994;88(6):660

13HajeerAHetImmuno,1994;16(1):43-50

14Del-MuroRetIntDis,1990;162(6):1260-1364

15AcetiAetInfDis,1991;164(3):613-614

16BrianLKetJTropMedHyg,11995;51(4):454-459