激發(fā)光譜與熒光光譜演示文稿

激發(fā)光譜與熒光光譜演示文稿當(dāng)前第1頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)掌握分子熒光產(chǎn)生的過(guò)程及其影響因素熟悉熒光光度計(jì)的基本構(gòu)件及操作程序了解熒光分析法的特點(diǎn)與應(yīng)用【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹慨?dāng)前第2頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)【實(shí)驗(yàn)原理】一、分子熒光產(chǎn)生過(guò)程二、激發(fā)光譜與熒光光譜三、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)關(guān)系四、影響熒光強(qiáng)度的因素當(dāng)前第3頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)1.分子能級(jí)與躍遷分子能級(jí)比原子能級(jí)復(fù)雜；在每個(gè)電子能級(jí)上，都存在振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)；基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí))：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級(jí)圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1、S2…；第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1、T2…；一、分子熒光的產(chǎn)生過(guò)程當(dāng)前第4頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)2.電子激發(fā)態(tài)的多重度

電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1

S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低；大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；

S0→T1

禁阻躍遷；通過(guò)其他途徑進(jìn)入(見能級(jí)圖)；進(jìn)入的幾率??；

當(dāng)前第5頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)（S0：?jiǎn)尉€基態(tài)；S1：最低激發(fā)單線態(tài)；T1：最低激發(fā)三線態(tài)；A：

吸收；F：

熒光；P：磷光；v：振動(dòng)馳豫；ISC：系間竄躍）

熒光、磷光光物理過(guò)程示意圖當(dāng)前第6頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)3.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過(guò)輻射躍遷(發(fā)光)和無(wú)輻射躍遷等方式失去能量。傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動(dòng)弛豫無(wú)輻射躍遷

激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)大。熒光：10-7～10-9s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)；磷光：10-4～10s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)；當(dāng)前第7頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)二、激發(fā)光譜與熒光光譜

熒光：光致發(fā)光，照射光波長(zhǎng)如何選擇？1.熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線

固定測(cè)量波長(zhǎng)(選最大發(fā)射波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度與照射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線（圖中曲線I）。

激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大；當(dāng)前第8頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)2.熒光光譜(或磷光光譜)固定激發(fā)光波長(zhǎng)(選最大激發(fā)波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線(圖中曲線II或III)。當(dāng)前第9頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)3.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系

a.Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，振動(dòng)弛豫消耗了能量。b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光。c.鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。當(dāng)前第10頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)鏡像規(guī)則的解釋

基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類似；基態(tài)上的零振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的二振動(dòng)能級(jí)之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

當(dāng)前第11頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜當(dāng)前第12頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)三、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu)。（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。熒光量子產(chǎn)率（）：熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過(guò)程的速率常數(shù)有關(guān)，如外轉(zhuǎn)換過(guò)程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射。當(dāng)前第13頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)2.化合物的結(jié)構(gòu)與熒光（1）躍遷類型：*→的熒光效率高，系間跨越過(guò)程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒有。（4）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電基，使熒光增強(qiáng)。當(dāng)前第14頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)當(dāng)前第15頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)四、影響熒光強(qiáng)度的因素

影響熒光強(qiáng)度的外部因素1.溶劑的影響

除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化；2.溫度的影響

熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加。3.溶液pH

對(duì)酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制；當(dāng)前第16頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)4.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀。自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長(zhǎng)端與其吸收光譜的長(zhǎng)波長(zhǎng)端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。當(dāng)前第17頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)5.溶液熒光的猝滅碰撞猝滅；氧的熄滅作用等。當(dāng)前第18頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)二、儀器結(jié)構(gòu)流程熒光儀主要由四個(gè)部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測(cè)器。

特殊點(diǎn)：有兩個(gè)單色器，光源與檢測(cè)器通常成直角?；玖鞒倘鐖D：?jiǎn)紊鳎哼x擇激發(fā)光波長(zhǎng)的第一單色器和選擇發(fā)射光波長(zhǎng)的第二單色器；光源：氙燈和高壓汞燈，染料激光器(可見與紫外區(qū))檢測(cè)器：光電倍增管。當(dāng)前第19頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)儀

器

光

路

圖當(dāng)前第20頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)同步掃描技術(shù)根據(jù)激發(fā)和發(fā)射單色器在掃描過(guò)程中彼此間所保持的關(guān)系，同步掃描可分為固定波長(zhǎng)差()和固定能量差及可變波長(zhǎng)三種。

同步掃描技術(shù)可簡(jiǎn)化光譜：譜帶變窄，減少光譜重疊，提高分辨率；如圖。合適的可減少光譜重疊：酪氨酸和色氨酸的熒光激發(fā)光譜相似，發(fā)射光譜嚴(yán)重重疊，但<15nm的同步光譜只顯示酪氨酸特征光譜；>60nm時(shí)，只顯示色氨酸的特征光譜，實(shí)現(xiàn)分別測(cè)定。當(dāng)前第21頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)可獲得三維光譜圖的儀器可獲得激發(fā)光譜與發(fā)射光譜同時(shí)變化時(shí)的熒(磷)光光譜圖當(dāng)前第22頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)日立F-4500熒光儀熒光儀主機(jī)電源開關(guān)光源開關(guān)主機(jī)開關(guān)當(dāng)前第23頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)開機(jī)順序：開機(jī)前首先確認(rèn)主機(jī)兩個(gè)開關(guān)：POWER/MAIN均處于關(guān)閉狀態(tài)（搬向O處）。先接通電源開關(guān)（POWER），5秒鐘后再按下氙燈點(diǎn)燈按鈕，當(dāng)氙燈點(diǎn)燃后，再接通主開關(guān)（MAIN）。此時(shí)主開關(guān)上方綠色指示燈連續(xù)閃動(dòng)三下。接通電腦及打印機(jī)電源，Win98開始建立，隨后F-4500操作界面自動(dòng)進(jìn)入。按界面提示選擇操作方式。關(guān)機(jī)順序：逆開機(jī)順序?qū)嵤┎僮?。?dāng)電源開關(guān)關(guān)閉后5秒鐘，再次接通10分鐘。（目的是僅讓風(fēng)扇工作，使燈室散熱）最后關(guān)閉電源開關(guān)。日立F-4500熒光分光光度計(jì)簡(jiǎn)易操作方法當(dāng)前第24頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)三、熒光分析方法與應(yīng)用1.特點(diǎn)（1）靈敏度高比紫外-可見分光光度法高2～4個(gè)數(shù)量級(jí)；為什么？檢測(cè)下限：0.1～0.1g/cm-3

相對(duì)靈敏度：0.05mol/L奎寧硫酸氫鹽的硫酸溶液。（2）選擇性強(qiáng)既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜；（3）試樣量少缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍小。當(dāng)前第25頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)2.定量依據(jù)與方法(1)定量依據(jù)

熒光強(qiáng)度

If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率：

If=Ia由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc)If=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)濃度很低時(shí)，將括號(hào)項(xiàng)近似處理后：If=2.3I0lc

=Kc當(dāng)前第26頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)（2）定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法：

配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測(cè)定熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測(cè)量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度；比較法：在線性范圍內(nèi)，測(cè)定標(biāo)樣和試樣的熒光強(qiáng)度，比較；當(dāng)前第27頁(yè)\共有31頁(yè)\編于星期五\5點(diǎn)3.熒光分析法的應(yīng)用(1)無(wú)機(jī)化合物的分析

與有機(jī)試劑配合物后測(cè)量；可測(cè)量約60多種元素。鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測(cè)定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過(guò)氧化氫采用催化熒光法測(cè)定；鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y(cè)定；鈰、銪、