秀麗線蟲的研究和飼養(yǎng)演示文稿

秀麗線蟲的研究和飼養(yǎng)演示文稿當(dāng)前第1頁\共有24頁\編于星期五\7點(diǎn)秀麗線蟲的研究和飼養(yǎng)當(dāng)前第2頁\共有24頁\編于星期五\7點(diǎn)介紹秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans）,屬于線形動物門、線蟲綱。體形非常小,成蟲只有1mm左右。線蟲是細(xì)胞定數(shù)動物，兩性成蟲只有959個體細(xì)胞，雄性成蟲只有1031個體細(xì)胞，其中131個細(xì)胞注定要接一定的發(fā)育程序陸續(xù)死亡。神經(jīng)系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)十分簡單，僅有302個細(xì)胞，約占整個動物體細(xì)胞總數(shù)的三分之一。它身體透明,能感知?dú)馕逗臀兜?對光線、溫度有反應(yīng)。研究者很容易在顯微鏡下對其細(xì)胞和組織進(jìn)行跟蹤觀察當(dāng)前第3頁\共有24頁\編于星期五\7點(diǎn)飼養(yǎng)與凍存設(shè)備試劑：

大腸桿菌OP50——大腸桿菌OP50是尿嘧啶滲漏突變型,作為秀麗隱桿線蟲的食物。

NGM培養(yǎng)基——1000ml的NGM培養(yǎng)基內(nèi)加有:3gNaCl,2.5g蛋白胨,17g瓊脂,1mol/LK2HPO4-KH2PO4緩沖液(pH=6.0)25ml,975ml蒸餾水,滅菌后加入分別抽濾除菌的1ml膽固醇溶液(5mg/ml乙醇),1mol/LMgSO41ml,1mol/L的CaCl21ml

當(dāng)前第4頁\共有24頁\編于星期五\7點(diǎn)M9緩沖液——每升緩沖液中含15.12gNa2HPO4#12H2O(或6gNa2HPO4),3gKH2PO4,5gNaCl,0.25gMgSO4#7H2O,宜現(xiàn)用現(xiàn)配S緩沖液——0.1mol/LNaCl,0.05mmol/LK2HPO4-KH2PO4緩沖液(pH=6.0)當(dāng)前第5頁\共有24頁\編于星期五\7點(diǎn)喂養(yǎng)方法用冰M9緩沖液清洗蟲體置4℃環(huán)境20min1000r離心，棄上清,沉淀物用M9緩沖液重懸置4℃環(huán)境20min棄上清取200ul沉淀物以靠接法接種到涂有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基上將培養(yǎng)基放置到16℃生化培養(yǎng)箱中，72h后可繁育至第二代當(dāng)前第6頁\共有24頁\編于星期五\7點(diǎn)凍存準(zhǔn)備1mlEP管，加入700ul30%甘油（s緩沖液溶解）用冰M9緩沖液清洗蟲體置4℃環(huán)境20min，1000r離心棄去上清將蟲體轉(zhuǎn)入事先準(zhǔn)備好的EP管中，置于-80℃冰箱凍存（可保存2個月），需要時取出室溫解凍重置培養(yǎng)基當(dāng)前第7頁\共有24頁\編于星期五\7點(diǎn)研究方法及用途當(dāng)前第8頁\共有24頁\編于星期五\7點(diǎn)研究范圍細(xì)胞程序性死亡的遺傳調(diào)控機(jī)制RNAi及其作用機(jī)制秀麗線蟲的功能基因組學(xué)及其他研究

低氧應(yīng)答模式生物基因組學(xué)和功能蛋白組學(xué)的研究其他（MAPK信號傳導(dǎo)、TGF-b信號傳遞途徑、衰老和年齡及脂肪代謝等）當(dāng)前第9頁\共有24頁\編于星期五\7點(diǎn)方法——線蟲基因顯微注射顯微注射技術(shù)是線蟲研究領(lǐng)域的常用技術(shù)，對線蟲進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作的一種高效且相對簡單的方法，主要用于研究線蟲突變種系的功能恢復(fù)(mutantrescue)、特定基因的過表達(dá)或異位表達(dá)、標(biāo)簽蛋白的表達(dá)、特定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的功能、DNA或RNA調(diào)節(jié)元件的分析及RNA干擾等．此外，這項(xiàng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)對于特異表型的篩選也是個強(qiáng)有力的工具，并且它還可用于將人工合成mRNAs或其他分子接引入細(xì)胞當(dāng)前第10頁\共有24頁\編于星期五\7點(diǎn)設(shè)備顯微注射全套儀器瓊脂糖固定墊添加了4%葡萄糖(glucose)的M9緩沖液當(dāng)前第11頁\共有24頁\編于星期五\7點(diǎn)當(dāng)前第12頁\共有24頁\編于星期五\7點(diǎn)注射步驟制劑及破針固定蟲將純化的DNA溶解在Tris-EDTA(TE)緩沖液中即可接用于注射。在注射液中加入終濃度約10mg/L的線蟲基因組DNA，則會有效地提高轉(zhuǎn)基因效率。將一小玻片放在加了注射油的固定墊上，操縱微操使注射針與玻片邊緣相撞，若針頭尖端撞破，可觀察到有液泡自動滲出注射時將線蟲挑至瓊脂糖固定墊上，調(diào)整線蟲使性腺暴露，滴加注射油覆蓋整個蟲體．固定好后的操作要迅速，否則線蟲容易脫水而死．將瓊脂糖固定墊放在載物臺上，40x物鏡下找到線蟲，使性腺聚焦在正確的平面．操作微操或輕移滑動載物臺，將注射針尖刺入性腺．啟動微量加壓器進(jìn)行注射，能觀察到注射液在性腺中快速流動，注射后的性腺被液體充滿．在體視顯微鏡下，滴加恢復(fù)緩沖液至注射后的線蟲正上方，由于與油互不相溶，緩沖液會滲入油下使線蟲浮起．一般等待2～5min，線蟲活力恢復(fù)，身體開始游動，即可挑至培養(yǎng)板上，20℃常規(guī)培養(yǎng)．注射恢復(fù)當(dāng)前第13頁\共有24頁\編于星期五\7點(diǎn)瓊脂糖固定墊取約50ul加熱溶解的2%瓊脂糖(agarose)溶液滴在長寬50mmx24mm，厚0.13～0.17mm的載玻片上，用另一載玻片輕壓其上，待瓊脂糖凝固后(約2min)，將上面的玻片從側(cè)面滑下即可．制作好的固定墊室溫過夜或65℃干燥1h后可疊放起來備用當(dāng)前第14頁\共有24頁\編于星期五\7點(diǎn)恢復(fù)緩沖液5.8gNa2HPO4，3.0gKH2PO4，0.5gNaCl，1.0gNH4Cl加水至1L，高壓滅菌，用于注射后線蟲的恢復(fù)當(dāng)前第15頁\共有24頁\編于星期五\7點(diǎn)注射當(dāng)前第16頁\共有24頁\編于星期五\7點(diǎn)子代目的基因表達(dá)檢測注射后約3天，觀察孵出的F1代是否有目的DNA表達(dá)．目前，線蟲外源基因表達(dá)的標(biāo)記通常用：a．熒光蛋白與目的蛋白形成融合蛋白，但需要確定熒光蛋白的連接不影響目的蛋白的功能；b．目的基因與熒光標(biāo)記基因共注射；c．目的基因與具有明顯表型的標(biāo)記基因共注射，我們通常使用易觀察的pmyo-3::TDimerII作為熒光標(biāo)記，它在所有體壁肌肉細(xì)胞表達(dá)，轉(zhuǎn)基因效率高且本身對線蟲的行為和功能沒有影響。當(dāng)前第17頁\共有24頁\編于星期五\7點(diǎn)顯微注射后的整合目前常用的整合方法有：用y射線和X射線照射，或用光敏劑補(bǔ)骨脂素加長波紫外線照射整合(TMP/UVintegration)．基本策略是大量篩選經(jīng)射線照射過的轉(zhuǎn)基因線蟲，一般挑取數(shù)百只F1代繁殖，篩選F4代，檢測是否有100%的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，若是則說明整合成功．一般一次整合能得到若干個獨(dú)立種系，可選擇最好的一個進(jìn)行實(shí)驗(yàn)．當(dāng)前第18頁\共有24頁\編于星期五\7點(diǎn)整合TMP/UV整合無需酌或X射線源，可在普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行．誘變劑TMP(Trioxsalen或4,5憶,8-Trimethylpsoralen,三甲基補(bǔ)骨脂素)，劇毒，避光，對其操作都需避光進(jìn)行．TMP/UV的處理可使線蟲DNA發(fā)生隨機(jī)斷裂，從而使染色體外的DNA片段整合至染色體上．TMP/UV整合法的流程為：a．用M9緩沖液將同步好的L4齡線蟲從培養(yǎng)板中清洗下來，加TMP(溶于DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，存于-80℃)使其終濃度為50mg/L．b．室溫下輕柔振蕩15min，將線蟲轉(zhuǎn)至未鋪菌的9cm培養(yǎng)板上紫外線照射，照射能量為35000滋J/cm2，換算成瞬時功率即350滋W/cm2,100s．c．照射完畢后，在培養(yǎng)板上加大腸桿菌OP50，室避光培養(yǎng)5h，使線蟲活力恢復(fù)．d．挑取15～25只狀態(tài)較好的P0代個體，每板1只，等待大腸桿菌被吃完，挑100～300只F2代，每板1只，觀察F4代是否全部表達(dá)注射DNA．根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，如果經(jīng)紫外線照射后，后代出現(xiàn)很多具有短粗、致死表型的線蟲，甚至1/4沒有后代，則預(yù)示整合成功．整合成功的標(biāo)準(zhǔn)是F4代全部表達(dá)目的基因，若沒有，一般沒必繼續(xù)篩選，可認(rèn)為該克隆的整合不成功當(dāng)前第19頁\共有24頁\編于星期五\7點(diǎn)細(xì)胞程序性死亡的遺傳調(diào)控機(jī)制

現(xiàn)階段研究已發(fā)現(xiàn)了十幾個控制細(xì)胞凋亡的基因，這些凋亡基因之間通過遺傳相互作用組成一條線性的調(diào)控途徑控制細(xì)胞程序性死亡，包括凋亡的激活階段、凋亡的起始、凋亡細(xì)胞的清除及凋亡細(xì)胞內(nèi)部的DNA降解當(dāng)前第20頁\共有24頁\編于星期五\7點(diǎn)線蟲PCA關(guān)鍵階段EGL-1：促凋亡蛋白，屬BCl—2蛋白家族，與哺乳動物BAD、BIK/NBK及HRK同源CED-9:抗凋亡蛋白,與人體bcl-2同源CED-4:促凋亡蛋白,同源體為Apaf-1CED-3:凋亡蛋白,與ICE(caspase家族)同源當(dāng)前第21頁\共有24頁\編于星期五\7點(diǎn)低氧應(yīng)答模式生物低氧能夠引起秀麗線蟲發(fā)生相應(yīng)的生理和行為學(xué)變化，并可保護(hù)機(jī)體免受缺氧損傷。秀麗線蟲的低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)的恒定性調(diào)控通路和人類的相應(yīng)通路之間具有高度保守性，因此秀麗線蟲也已成為研究低氧應(yīng)答調(diào)控通路進(jìn)化保守性的重要工具之一。闡明秀麗線蟲的低氧應(yīng)答機(jī)制將為了解人類低氧相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制提供有價值的線索。當(dāng)前第22頁\共有24頁\編于星期五\7點(diǎn)相關(guān)機(jī)制低氧環(huán)境秀麗線蟲的非HIF一1介導(dǎo)的低氧應(yīng)答通路秀麗線蟲的氧感知神經(jīng)回路胰島素／胰島素樣受體DAF-2通路熱休克蛋白及其它秀麗線蟲中低氧誘導(dǎo)因子