湖北貝母有效部位提取工藝的研究

湖北貝母有效部位提取工藝的研究【摘要】目的優(yōu)選湖北貝母有效部位即總生物堿的最佳提取工藝。方法采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，測定不同提取條件所得總生物堿的含量及收率，結(jié)合各實(shí)驗(yàn)樣品藥理效應(yīng)強(qiáng)弱的評價，優(yōu)選出湖北貝母有效部位的最佳提取工藝。結(jié)果當(dāng)提取條件為以50％EtOH提取3次，1h/次，4倍體積/次時，湖北貝母有效部位總生物堿的收率最高，其鎮(zhèn)咳和平喘的綜合藥效最強(qiáng)，經(jīng)過穩(wěn)定性驗(yàn)證后，將該工藝確定為湖北貝母有效部位的最佳提取工藝。結(jié)論該研究以化學(xué)指標(biāo)和藥效指標(biāo)相結(jié)合的方法來優(yōu)選湖北貝母有效部位的最佳提取工藝，相對單純化學(xué)指標(biāo)來說更為科學(xué)和可信，可以有效防止以單純化學(xué)指標(biāo)優(yōu)選出的工藝與藥理效應(yīng)不一致時的偏差，使優(yōu)選出的工藝真正為活性導(dǎo)向下藥材有效部位的最佳提取工藝。

【關(guān)鍵詞】湖北貝母正交設(shè)計(jì)藥效篩選提取工藝

Abstract：ObjectiveTooptimizetheextractionprocessoftheactivefraction(thetotalalkaloids)fromtheBulbsofFritillariaehupehensis.MethodsApplyingorthogonaldesigninthisstudy，wegotnineextractionsamplesofBulbusFritillariaehupehensis.Andthenweevaluatedtheoptimumextractionprocessthroughassayingthetotalalkaloidsyieldsofthesesamplesandscreeningtheirantitussive,expectorantandantiasthmatictheextractingprocesswas1hour,3timesand4timesvolumesofthematerialpowderwith50%EtOH，thesampleextracthadthehighesttotalalkaloidsyieldsandstrongestbioactivities.Accordingtothisstudy，wedetermineditastheoptimumextractionprocess.ConclusionCombiningchemistryandpharmacologicalindexestooptimizetheextractionprocessofBulbusFritillariaehupehensiswasmorescientificthansinglechemistryindex，theoptimumextractingprocesswasmorecredibleandfeasible.

Keywords：BulbsofFritillariaehupehensis;Orthogonaldesign;Pharmacodynamicscreening;Extractionprocess

中藥貝母為百合科(Liliaceae)貝母屬(FritillariaL.)多種植物的干燥鱗莖，具有清熱潤肺、化痰止咳和散結(jié)消腫的功效，在我國使用歷史悠久，至今仍是防治呼吸系統(tǒng)疾病之要藥。湖北貝母FritillariahupehensisHsiaoetHsia原野生于湖北省恩施自治州，俗稱“板貝”或“窯貝”，民間習(xí)作川貝藥用，歷史悠久，現(xiàn)已收載于《中國藥典》2000版，發(fā)展為僅次于浙貝母的第二大主流品種。吳繼洲教授等從1979年開始，對其作了化學(xué)成分、急性毒性、初步藥效學(xué)和一般藥理學(xué)等品質(zhì)評價的系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)湖北貝母鎮(zhèn)咳、祛痰及平喘的主要活性部位為總生物堿。對湖北貝母活性導(dǎo)向分離的研究中曾發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取溶媒為50％EtOH時，提取所得總生物堿部位鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘的藥效為最好［1］。在確定此提取溶媒的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步優(yōu)化湖北貝母有效部位的提取工藝，本研究采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察了提取時間、提取次數(shù)和溶媒體積3個因素，以各提取物總生物堿產(chǎn)率為化學(xué)指標(biāo)，結(jié)合各樣品鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘活性的強(qiáng)弱對湖北貝母有效部位的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，為湖北貝母的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1材料與儀器1儀器RE52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；UV754紫外可見分光光度計(jì)，上海分析儀器廠；METTERTOLEDOAG285型電子天平。

試劑湖貝甲素對照品，本教研室吳繼洲教授提供；各種化學(xué)試劑，國產(chǎn)分析純。3動物昆明種小鼠，雌雄兼用，體重g；豚鼠，雌雄兼用，體重(170±20)g，均由本校實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

2方法與結(jié)果

總生物堿的含量測定采用酸性染料比色法［2，3］。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取湖貝甲素對照品mg，置50ml容量瓶中，用氯仿溶解并加至刻度，搖勻，作為對照品溶液。分別精密吸取該對照品溶液0，，，，，ml置25ml容量瓶中，加鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液(pH=)5ml，溴甲酚綠2ml，再加氯仿至刻度，充分搖勻，移入分液漏斗中，靜置10min分層，取下層液于415nm波長處測定吸光度。將吸光度與相應(yīng)的濃度作回歸處理，得回歸方程為A=+，r=6(A為樣品溶液吸光度值，X為樣品含生物堿的毫克量)

提取物中總生物堿含量的測定分別精密稱取等量樣品總生物堿浸膏適量，用氯仿溶解定容至50ml，搖勻后分別精密吸取各樣品液ml置于25ml容量瓶中，加鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液5ml，溴甲酚綠指示劑2ml，搖勻，加氯仿至刻度，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線下操作方法測定各樣品的吸光度并計(jì)算各樣品中生物堿的含量及產(chǎn)率。

2正交設(shè)計(jì)考察提取時間、提取次數(shù)和溶媒體積在以往湖北貝母總生物堿提取分離研究的基礎(chǔ)上，本文選取提取時間，提取次數(shù)和溶媒體積為考察因素，各因素相應(yīng)安排了3個水平，選用L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn)。因素水平的安排見表1。

將湖北貝母鱗莖研成粉末，過20目篩，分別稱取該粉末80g，按表1安排實(shí)驗(yàn)，回收并濃縮各提取液，經(jīng)酸堿處理后，再以醋酸乙酯萃取，直至水層對Draggendorf‘s試劑不顯色，回收醋酸乙酯萃取液并濃縮成浸膏。將各實(shí)驗(yàn)樣品所得浸膏轉(zhuǎn)移入已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在相同條件下于60℃烘箱中干燥2h，取出，置干燥器中冷卻30min后立即稱重，計(jì)算各樣品浸膏得率，并進(jìn)行生物堿含量測定，計(jì)算各樣品總生物堿的收率(%)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析見表2～4。

表1L9(34)因素水平設(shè)計(jì)

藥理效應(yīng)評價［4］由于提取所得的活性部位除生物堿外還含有非生物堿成分，這些成分對總生物堿藥效的影響并不清楚，所以若單純以化學(xué)指標(biāo)如生物堿產(chǎn)率的高低來優(yōu)選最佳提取工藝，其藥效是否最強(qiáng)仍未可知，由此，對這些提取浸膏做了進(jìn)一步的藥效篩選。

鎮(zhèn)咳效應(yīng)的篩選取體重(20±2)g小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分組，各組給藥1h后，將小鼠置于倒置的500ml燒杯內(nèi)，用1ml注射器吸取氨水ml注入燒杯內(nèi)放的棉球中，觀察小鼠的咳嗽潛伏期和3min內(nèi)咳嗽次數(shù)。

祛痰效應(yīng)的篩選分別配制標(biāo)準(zhǔn)濃度酚紅溶液，以分光光度計(jì)測定吸光度(A)，以A對酚紅含量C回歸，得回歸方程A=9+722C，r=5。

取體重(22±2)g雄性昆明種小鼠，隨機(jī)分組(n=8)，各組給藥30min后，再給予5％酚紅溶液ml/g，30min后處死小鼠，仰位固定于手術(shù)臺上，剪取自甲狀軟骨至氣管分叉處的氣管段，放入已盛有2ml%的NaHCO3試管中，穩(wěn)定洗出液的pH，以4000r/min離心20min后測定吸收度。

平喘效應(yīng)的篩選取體重(170±20)g豚鼠逐一測定引喘潛伏期，挑選合格者。將其放入402AI型超聲霧化器中，以53kPa恒壓噴入2％氯化乙酰膽堿和%組胺的等量混合液15s，密切注意豚鼠的反應(yīng)，觀察6min內(nèi)豚鼠出現(xiàn)喘息性抽搐的潛伏期即引喘潛伏期(從噴霧停止到出現(xiàn)喘息性抽搐的時間)。如見到豚鼠跌倒應(yīng)立即取出，以免死亡，記錄引喘潛伏期，若潛伏期大于150s則認(rèn)為不敏感而不予選用。

次日將合格豚鼠隨機(jī)分組(n=6)并給藥，30min后以同樣條件引喘并測定引喘潛伏期，計(jì)算給藥前后各豚鼠引喘潛伏期的差值。

3討論

藥理效應(yīng)評價從表2藥效實(shí)驗(yàn)篩選的結(jié)果可以看出，按正交設(shè)計(jì)提取得到的9個有效部位樣品中，6，7，8，9四個樣品的鎮(zhèn)咳作用與陰性比較均顯示出較強(qiáng)的鎮(zhèn)咳活性，其中又以6號樣品作用最強(qiáng)，其與陽性對照可待因的藥效非常接近。祛痰活性的篩選中，9個樣品與陰性比較均無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明湖北貝母有效部位即總生物堿浸膏的祛痰效應(yīng)總體來說不明顯。在平喘活性的篩選實(shí)驗(yàn)中，9個樣品中只有6號顯示出了一定程度的平喘活性，其余8個樣品平喘作用則均不明顯。

綜合評價藥效實(shí)驗(yàn)的篩選結(jié)果，9個有效部位提取樣品中以6號樣品的生物活性為最強(qiáng)。

生物堿產(chǎn)率評價表3正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的結(jié)果表明9個提取物樣品中生物堿提取率最高的為6號(A2B3D2)；進(jìn)一步的方差分析表明，在對湖北貝母有效部位的提取時間，提取次數(shù)和溶劑體積3個因素中，各因素均達(dá)不到影響顯著性的程度，故仍然參考表3中的極差對正交結(jié)果進(jìn)行分析。由極差分析可見，影響最大的因素為提取次數(shù)，其次為提取時間，最后則是溶媒體積，由此以生物堿提取率為指標(biāo)得出最佳的提取工藝為A2B3D2。

提取工藝的綜合評價及穩(wěn)定性驗(yàn)證綜合生物堿提取率的高低和藥理效應(yīng)的篩選結(jié)果，6號工藝所得到的有效部位不但藥理效應(yīng)最強(qiáng)，而且總生物堿收率也最高。為考察該提取工藝的穩(wěn)定性，本研究還分別按此工藝提取了3批樣品，測定了各自總生物堿的含量，計(jì)算得出總生物堿的平均收率為2%，3次結(jié)果差異較小，說明該工藝穩(wěn)定可行。由此確定湖北貝母有效部位的最佳提取工藝為以50％EtOH提取3次，1h/次，提取溶媒體積為4倍/次。

表2藥效實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果

陽性對照：鎮(zhèn)咳為磷酸可待因；祛痰為愈創(chuàng)木酚甘油醚；平喘為氨茶堿

陰性對照：%Tween80生理鹽水液

與陰性對照組比較：******

△：以吸光度衡量

表3正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4方差分析

本研究不僅在活性導(dǎo)向下以化學(xué)和藥效雙重指標(biāo)得出了湖北貝母有效部位的最佳提取工藝，還從另一角度闡明了湖北貝母有效部位中總生物堿的含量高低與藥效強(qiáng)弱是平行一致的，即生物堿含量越高其所對應(yīng)的鎮(zhèn)咳和平喘的活性也越強(qiáng)。

正如中藥的提取分離若在活性篩選的指導(dǎo)下進(jìn)行，研究活動將變得更為有的放矢一樣，在中藥有效部位提取工藝的優(yōu)化研究中，若能將化學(xué)指標(biāo)和藥效指標(biāo)相結(jié)合，將使優(yōu)選出的提取工藝依據(jù)更充分、可信和可行。本實(shí)驗(yàn)采用的活性和含量相結(jié)合的方法為中藥提取工藝的優(yōu)化提供了一種新的思路，值得嘗試。

【參考文獻(xiàn)】