氨基酸工藝學(xué)第二章谷氨酸發(fā)酵機制

氨基酸工藝學(xué)第二章谷氨酸發(fā)酵機制第一頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)谷氨酸發(fā)酵機制1.谷氨酸的作用：谷氨酸(g1utamate，Glu，C5H9O4N)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，主要分布于大腦皮質(zhì)、海馬、小腦和紋狀體，在學(xué)習(xí)、記憶、神經(jīng)元可塑性及大腦發(fā)育等方面均起重要作用。此外，谷氨酸對心肌能量代謝和心肌保護起著重要作用。

第二頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一一、谷氨酸生物合成途徑生物體內(nèi)合成谷氨酸的前體物質(zhì)是a-酮戊二酸，是三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))的中間產(chǎn)物，由糖質(zhì)原料生物合成谷氨酸的途徑包括糖酵解途徑(EMP途徑)、三羧酸循環(huán)、乙醛酸循環(huán)、CO2的固定反應(yīng)(伍德一沃克曼反應(yīng))等。第三頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一（一）、葡萄糖的糖酵解、三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)

1.糖酵解途徑（EMP途徑）將一分子葡萄糖分解成兩分子丙酮酸,并且發(fā)生氧化(脫氫)和生成少量ATP。

葡萄糖6-磷酸葡萄糖3-磷酸甘油醛丙酮酸6-磷酸葡萄糖酸5-磷酸核酮糖HMP途徑EMP途徑2.戊糖磷酸途徑（HMP途徑）可以生成酵解途徑的中間產(chǎn)物6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛。第四頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一肌肉中的葡萄糖代謝情況第五頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一3.三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）谷氨酸（胞內(nèi)）轉(zhuǎn)移到胞外草酰乙酸檸檬酸順烏頭酸異檸檬酸α-酮戊二酸琥珀酸延胡索酸蘋果酸丙酮酸乙酰CoA乙醛酸+CO2乙醛酸循環(huán)中的兩個關(guān)鍵酶——異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合成酶。

異檸檬酸脫氫酶

NH4α-酮戊二酸脫氫酶

第六頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一（二）谷氨酸合成的理想途徑在發(fā)酵產(chǎn)酸期，EMP所占比例更大，約為74％。

生物素充足菌EMP所占比例約為62％；第七頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一（三）由葡萄糖生物合成谷氨酸的代謝途徑3.在谷氨酸發(fā)酵的菌體生長期，由于三羧酸循環(huán)中的缺陷(喪失a-酮戊二酸脫氫酶氧化能力或氧化能力微弱)，谷氨酸產(chǎn)生菌采用乙醛酸循環(huán)途徑進行代謝，提供四碳二羧酸及菌體合成所需的中間產(chǎn)物等。2.此代謝途徑至少有16步酶促反應(yīng)。1.谷氨酸生產(chǎn)菌株為缺陷型，生產(chǎn)過程分為菌體生長期和谷氨酸積累期。第八頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一

4.在菌體生長期之后，進入谷氨酸生成期，封閉乙醛酸循環(huán)，積累α-酮戊二酸，就能夠大量生成、積累谷氨酸。因此在谷氨酸發(fā)酵中，菌體生長期的最適條件和谷氨酸生成積累期的最適條件是不一樣的。

第九頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一5.由葡萄糖生物合成谷氨酸的代謝途徑第十頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一

（1）在谷氨酸生成期，假如四碳二羧酸是100％通過C02固定反應(yīng)供給，在生長期之后，理想的發(fā)酵按如下反應(yīng)進行：1mol葡萄糖可以生成1mol的谷氨酸，谷氨酸對葡萄糖的質(zhì)量理論轉(zhuǎn)化率為：6.葡萄糖對谷氨酸的轉(zhuǎn)化率第十一頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一（2）在谷氨酸生成期，若CO2固定反應(yīng)完全不起作用，丙酮酸在丙酮酸脫氫酶的催化作用下，脫氫脫羧全部氧化成乙酰CoA，通過乙醛酸循環(huán)供給四碳二羧酸。反應(yīng)如下：3C6H12O66丙酮酸6乙酰CoA乙醛酸循環(huán)：4乙酰CoA+4H2O2琥珀酸+4CoASH6乙酰CoA+2NH3+3O22谷氨酸+2CO2+6H2O第十二頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一3mol葡萄糖可以生成2mol的谷氨酸，谷氨酸對葡萄糖的質(zhì)量理論轉(zhuǎn)化率為：(3)實際轉(zhuǎn)化率：處于二者之間，即54.4%～81.7%。CO2固定反應(yīng)、乙醛酸循環(huán)的比率等對轉(zhuǎn)化率影響較大。乙醛酸循環(huán)活性越高，谷氨酸越不易生成與積累。第十三頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一7.醋酸或正石蠟原料發(fā)酵谷氨酸的推測途徑在醋酸發(fā)酵谷氨酸或石油發(fā)酵谷氨酸時，卻只能經(jīng)乙醛酸循環(huán)供給四碳二羧酸，四碳二羧酸經(jīng)草酰乙酸又轉(zhuǎn)化為檸檬酸。第十四頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一二、谷氨酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)機制

在工業(yè)上，通過對微生物代謝途徑的控制來滿足生產(chǎn)的需要，提高生產(chǎn)效益。所以，研究微生物代謝調(diào)節(jié)機制有極其重要的意義。

合成代謝將分解代謝產(chǎn)生的能量和中間體合成氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)。微生物的代謝分解代謝：合成代謝：從環(huán)境中攝取營養(yǎng)物質(zhì)，把它們轉(zhuǎn)化為自身物質(zhì)，以此來提供能源和小分子中間體；第十五頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一

1．糖代謝(EMP途徑和HMP途徑)的調(diào)節(jié)糖代謝可分為分解與合成兩方面。糖分解代謝包括酵解與三羧酸循環(huán)；（提供能量）合成代謝包括糖的異生、糖原與結(jié)構(gòu)多糖的合成等，中間代謝還有磷酸戊糖途徑、糖醛酸途徑等。（消耗能量）

第十六頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一(1)能荷的調(diào)節(jié)腺嘌呤核苷三磷酸，又叫三磷酸腺苷(腺苷三磷酸)，簡稱為ATP。

其結(jié)構(gòu)簡式是：A—P～P～P，其相鄰的兩個磷酸基之間的化學(xué)鍵非常活躍，水解時可釋放約30.54kJ/mol的能量，因此稱為高能磷酸鍵。第十七頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一能荷調(diào)節(jié)是通過ATP、ADP和AMP分子對某些酶分子進行變構(gòu)調(diào)節(jié)來實現(xiàn)的。Atkinson提出了能荷的概念。認為能荷是細胞中高能磷酸狀態(tài)的一種數(shù)量上的衡量，能荷大小可以說明生物體中ATP—ADP—AMP系統(tǒng)的能量狀態(tài)。能荷的大小決定于ATP和ADP的多少。第十八頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一能荷逐漸升高時，即細胞內(nèi)的能量水平逐漸升高，這一過程中AMP、ADP轉(zhuǎn)變成ATP。ATP的增加會抑制糖分解代謝，抑制如檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶等酶的活性，并激活糖類合成的酶，加速糖原的合成。糖酵解主要受三個酶調(diào)節(jié)：磷酸果糖激酶、己糖激酶、丙酮酸激酶，其中磷酸果糖激酶是限速酶，己糖激酶控制酵解的入口，丙酮酸激酶控制出口；三羧酸循環(huán)的調(diào)控由三個酶調(diào)控，即檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶和ā-酮戊二酸脫氫酶。兩者都與能荷的控制調(diào)節(jié)相關(guān)。

第十九頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一當(dāng)生物體內(nèi)生物合成或其它需能反應(yīng)加強時，細胞內(nèi)ATP分解生成ADP或AMP，ATP減少，能荷降低，就會激活某些催化糖類分解的酶(糖原磷酸化酶、磷酸果糖激酶、檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶等)或解除ATP對這些酶的抑制，并抑制合成糖原的酶(NN合成酶、果糖-1，6～二磷酸酯酶等)，從而加速酵解、TCA循環(huán)產(chǎn)生能量，通過氧化磷酸化作用生成ATP。第二十頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一

(2)生物素對糖代謝速率的調(diào)節(jié)

生物素對糖代謝的調(diào)節(jié)與能荷的調(diào)節(jié)是不同的，能荷是對糖代謝流的調(diào)節(jié)，而生物素能夠促進糖的EMP、HMP途徑、TCA循環(huán)。第二十一頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一

谷氨酸產(chǎn)生菌大多為生物素缺陷型。許多研究表明，生物素對從糖開始到丙酮酸為止的糖降解途徑的比例并沒有顯著的影響，主要作用是對糖降解速率的調(diào)節(jié)。原因：碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)代謝中的許多反應(yīng)都需要生物素。

生物素的主要功能是在脫羧-羧化反應(yīng)和脫氨反應(yīng)中起輔酶作用，并和碳水化合物與蛋白質(zhì)的互變、碳水化合物以及蛋白質(zhì)向脂肪的轉(zhuǎn)化有關(guān)。在碳水化合物代謝中，生物素酶能催化脫羧和羧化反應(yīng)。碳水化合物代謝中依賴生物素的特異反應(yīng)有：丙酮酸轉(zhuǎn)化生成草酰乙酸；蘋果酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸；琥珀酸與丙酮酸的互變；草酰琥珀酸轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸。第二十二頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一2．三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))的調(diào)節(jié)

谷氨酸產(chǎn)生菌在代謝途徑中，三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié)主要是通過5種酶的調(diào)節(jié)進行的。這五種酶是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶。谷氨酸比天冬氨酸優(yōu)先合成，谷氨酸合成過量后，谷氨酸抑制谷氨酸脫氫酶的活力并阻遏檸檬酸合成酶的合成，使代謝轉(zhuǎn)向天冬氨酸的合成。

草酰乙酸+谷氨酸谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶天冬氨酸+α-酮戊二酸第二十三頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一①磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反饋抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反饋阻遏。②檸檬酸合成酶是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，除受能荷調(diào)節(jié)外，還受谷氨酸的反饋阻遏和烏頭酸的反饋抑制。反饋抑制：是指最終產(chǎn)物抑制作用，即在合成過程中有生物合成途徑的終點產(chǎn)物對該途徑的酶的活性調(diào)節(jié)，所引起的抑制作用。

反饋抑制與反饋阻遏的區(qū)別在于：反饋阻遏是轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，產(chǎn)生效應(yīng)慢，反饋抑制是酶活性水平調(diào)節(jié)，產(chǎn)生效應(yīng)快。此外，前者的作用往往會影響催化一系反應(yīng)的多個酶，而后者往往只對是一系列反應(yīng)中的第一個酶起作用。第二十四頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一③異檸檬酸脫氫酶活力強，而異檸檬酸裂解酶活力不能太強，這就有利于谷氨酸前體物α-酮戊二酸的生成，滿足合成谷氨酸的需要。異檸檬酸脫氫酶催化的異檸檬酸脫氫脫羧生成α–酮戊二酸的反應(yīng)和谷氨酸脫氫酶催化的α-酮戊二酸還原氨基化生成谷氨酸的反應(yīng)是一對氧化還原共軛反應(yīng)，細胞內(nèi)α–酮戊二酸的量與異檸檬酸的量需維持平衡，當(dāng)α–酮戊二酸過量時，對異檸檬脫氫酶發(fā)生反饋抑制作用，停止合成α–酮戊二酸。第二十五頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一在谷氨酸的生物合成中，谷氨酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶在銨離子存在下，兩者非常密切地偶聯(lián)起來，形成強固的氧化還原共軛體系，不與NADPH2的末端氧化系相連接，使α–酮戊二酸還原氨基化生成谷氨酸。

④沿著由檸檬酸至α–酮戊二酸的氧化途徑，谷氨酸產(chǎn)生菌有兩種NADP專性脫氫酶，即異檸檬酸脫氫酶和L-谷氨酸脫氫酶。第二十六頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一由于谷氨酸產(chǎn)生菌的谷氨酸脫氫酶比其它微生物強大得多，所以由三羧酸循環(huán)所得的檸檬酸的氧化中間物就不再往下氧化，而以谷氨酸的形式積累起來。谷氨酸對谷氨酸脫氫酶存在著反饋抑制和反饋阻遏。若銨離子進一步過剩供給時，發(fā)酵液偏酸性，pH在5.5～6.5，谷氨酸會進一步生成谷氨酰胺。第二十七頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一⑤在谷氨酸產(chǎn)生菌中，α–酮戊二酸脫氫酶先天性缺失或微弱，對導(dǎo)向谷氨酸形成具有重要意義，這是谷氨酸產(chǎn)生菌糖代謝的一個重要特征。谷氨酸產(chǎn)生菌的α–酮戊二酸氧化力微弱，尤其在生物素缺乏的條件下，三羧酸循環(huán)到達α–酮戊二酸時即受到阻擋，這有利于α–酮戊二酸的積累，然后生成谷氨酸。第二十八頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一

3．乙醛酸循環(huán)(DCA循環(huán))的調(diào)節(jié)

乙醛酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶是異檸檬酸裂解酶和蘋果酸酶。通過乙醛酸循環(huán)異檸檬酸裂解酶的催化作用使琥珀酸、延胡索酸和蘋果酸的量得到補足，其反應(yīng)如下：

葡萄糖和琥珀酸等對異檸檬酸裂解酶起著阻遏作用。第二十九頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一在生物素亞適量條件下，琥珀酸氧化力降低，積累的琥珀酸會反饋抑制異檸檬酸裂解酶活性，并阻遏該酶的生成，DCA循環(huán)基本處于封閉狀態(tài)，異檸檬酸高效率地轉(zhuǎn)化為α-–酮戊二酸，再生成谷氨酸。在生物素充足的條件下，異檸檬酸裂解酶活性增大，通過DCA循環(huán)提供能量，進行蛋白質(zhì)的合成，不僅異檸檬酸轉(zhuǎn)化生成谷氨酸的反應(yīng)減弱使得谷氨酸減少，而且生成的谷氨酸在轉(zhuǎn)氨酶的催化作用下又轉(zhuǎn)成其它氨基酸，也不利于谷氨酸積累。

(1)以糖質(zhì)為原料的谷氨酸發(fā)酵中生物素對DCA循環(huán)的影響第三十頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一以醋酸為原料發(fā)酵谷氨酸時，醋酸濃度要低，高濃度的醋酸易被完全氧化。當(dāng)菌體內(nèi)的有機酸濃度低到一定程度，DCA循環(huán)啟動，此時異檸檬酸裂解酶催化生成的乙醛酸與細胞內(nèi)的草酰乙酸共同抑制異檸檬酸脫氫酶，TCA循環(huán)轉(zhuǎn)為DCA循環(huán)，不利于谷氨酸生成與積累；當(dāng)DCA循環(huán)運轉(zhuǎn)使得TCA循環(huán)包含的某些有機酸過剩時，異檸檬酸裂解酶被抑制，乙醛酸濃度下降，解除對異檸檬酸脫氫酶的抑制，TCA循環(huán)運轉(zhuǎn)。(2)以醋酸為原料的谷氨酸發(fā)酵對DCA循環(huán)的影響第三十一頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一

4．CO2固定反應(yīng)的調(diào)節(jié)

CO2固定反應(yīng)主要通過以下途徑完成：C02的固定反應(yīng)的作用：補充草酰乙酸；在谷氨酸合成過程中，糖的分解代謝途徑與C02固定的適當(dāng)比例是提高谷氨酸對糖收率的關(guān)鍵問題。第三十二頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一5．NH4+的調(diào)節(jié)

谷氨酸脫氫酶也能催化谷氨酸氧化脫氨反應(yīng)，脫氨過程以NAD+作為輔酶，該酶催化的反應(yīng)雖然偏向氨合成谷氨酸一邊，但是脫氫過程產(chǎn)生的NADH被氧化成NAD+，同時產(chǎn)生的NH3很容易被除去。脫氨反應(yīng)被NH4+和α-–酮戊二酸所抑制，這對于谷氨酸的積累也起到了很好的作用。第三十三頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一在谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中，生物素缺陷型菌在NH4+存在時，葡萄糖消耗速率快而且谷氨酸收率高；NH4+不存在時，葡萄糖消耗速率很慢，生成物是α-–酮戊二酸、丙酮酸等物質(zhì)，不產(chǎn)生谷氨酸。

第三十四頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一四、細胞膜通透性的調(diào)節(jié)

對谷氨酸發(fā)酵的重要性：當(dāng)細胞膜轉(zhuǎn)變?yōu)橛欣诠劝彼嵯蚰ね鉂B透的方式，谷氨酸才能不斷地排出細胞外，這樣既有利于細胞內(nèi)谷氨酸合成反應(yīng)的優(yōu)先性、連續(xù)性，也有利于谷氨酸在胞外的積累。第三十五頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一細胞膜是在細胞壁與細胞質(zhì)之間的一層柔軟而富有彈性的半滲透性膜，磷脂雙分子層為其基本結(jié)構(gòu)，在雙分子層中鑲嵌蛋白質(zhì)。

第三十六頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一一種是通過控制脂肪酸和甘油的合成，實現(xiàn)對磷脂合成的控制，使得細胞不能形成完整的細胞膜；一種是通過干擾細菌細胞壁的形成，使得細胞不能形成完整的細胞壁，喪失了對細胞膜的保護作用。在膜內(nèi)外滲透壓差等因素影響下，細胞膜物理性損傷，增大膜的通透性。根據(jù)細胞膜的結(jié)構(gòu)特性，控制細胞膜通透性的方法主要有兩種：第三十七頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一1．控制細胞膜的形成

①利用生物素缺陷型菌株進行谷氨酸發(fā)酵時，限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素的濃度。生物素參與了脂肪酸的生物合成，進而影響了磷脂的合成和細胞膜的形成。生物素是催化脂肪酸合成起始反應(yīng)的關(guān)鍵酶乙酰CoA羧化酶的輔酶，對脂肪酸的形成起促進作用。選育生物素缺陷型菌株，阻斷生物素合成，亞適量控制生物素添加，抑制不飽和脂肪酸的合成，使得細胞膜不完整，提高了細胞膜對谷氨酸的通透性。第三十八頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一②利用生物素過量的糖蜜原料進行谷氨酸發(fā)酵時，添加表面活性劑或飽和脂肪酸。在生物素過量的條件下，添加表面活性劑或飽和脂肪酸仍能進行谷氨酸發(fā)酵，其原因在于這些物質(zhì)對生物素起拮抗作用，抑制不飽和脂肪酸的合成，導(dǎo)致油酸合成量減少，磷脂合成不足，使得細胞膜不完整，提高了細胞膜對谷氨酸的通透性。常用的表面活性劑有吐溫-60、吐溫-40等。常用的飽和脂肪酸有十七烷酸、硬脂酸等。第三十九頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一③利用油酸缺陷型菌株進行谷氨酸發(fā)酵，限制發(fā)酵培養(yǎng)基油酸的濃度。油酸缺陷型菌株喪失了自身合成油酸的能力，直接影響磷脂的合成，不能形成完整細胞膜，必須添加油酸才能生長，所以通過控制油酸的添加量，實現(xiàn)細胞膜對谷氨酸的通透性。當(dāng)油酸過量時，該菌株只長菌或產(chǎn)酸少；當(dāng)油酸亞適量時，隨著油酸的耗盡，細胞膜結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生變化，使得谷氨酸的通透性提高。一種脂肪酸。分子式C18H34O2

第四十頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一甘油缺陷型菌株不能自身合成α-–磷酸甘油和磷脂，外界供給甘油才能使其生長，因此可以通過控制甘油添加量來控制細胞膜對谷氨酸的通透性。當(dāng)甘油添加量過多時，磷脂正常合成，菌體正常生長，不產(chǎn)酸或產(chǎn)酸低；當(dāng)甘油添加量過少時，菌體生長不好，產(chǎn)酸低，所以控制甘油亞適量是控制的關(guān)鍵。④利用甘油缺陷型菌株進行谷氨酸發(fā)酵，限制發(fā)酵培養(yǎng)基甘油的濃度。第四十一頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一2．控制細胞壁的形成細胞壁的骨架結(jié)構(gòu)是肽聚糖。對細胞壁形成的控制方法：添加青霉素、頭孢霉素C等β-內(nèi)酰胺類抗生素。

雙糖單位：N-乙酰胞壁酸（NAM）和N-乙酰葡萄糖胺（NAG）第四十二頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一青霉素是糖肽末端結(jié)構(gòu)(D—Ala—D—Ala)的類似物，與轉(zhuǎn)肽酶的活性中心結(jié)合，使轉(zhuǎn)肽酶受到了不可逆的抑制，糖肽合成不能完成，結(jié)果形成不完整的細胞壁，使細胞膜處于無保護狀態(tài)，易于破損，增大谷氨酸的通透性。轉(zhuǎn)肽酶功能：在蛋白質(zhì)生物合成過程中肽鍵的形成具有必須的作用。轉(zhuǎn)肽酶識別特異多肽,催化不同的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)。

青霉素控制細胞壁形成的原因：第四十三頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一第二節(jié)谷氨酸產(chǎn)生菌的選育主要是棒桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬和節(jié)桿菌屬中的細菌。目前，我國企業(yè)使用的谷氨酸產(chǎn)生菌主要有：北京棒桿菌AS1．299；鈍齒棒桿菌AS1．542；天津短桿菌T6-13；它們的各種突變株。第四十四頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一第四十五頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一第四十六頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一黃色短桿菌北京棒桿菌桿狀細菌第四十七頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一谷氨酸菌體的選育方法主要有五種，自然選育、誘變選育、雜交選育、代謝控制選育和基因工程選育。

第四十八頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一一、自然選育以基因自發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)。有利于谷氨酸產(chǎn)生菌保持純系良種，使谷氨酸生產(chǎn)具有相對穩(wěn)定性，提高發(fā)酵水平。缺點：菌體自身存在著修復(fù)機制和某些酶的校正作用，使得自發(fā)突變率極低，導(dǎo)致選育耗時長、工作量大、效率低。也稱自然分離，是指對微生物細胞群體不經(jīng)過人工處理而直接進行篩選的育種方法。

第四十九頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一二、誘變選育

物理因素：紫外線、60Co、X射線、γ-射線、快中子、α-射線、β-射線、超聲波、He-Ne激光輻照、離子束等。化學(xué)因素：氮芥、亞硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亞硝基甲基脲、亞硝酸、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶等。其它因素：生物誘導(dǎo)因子，如噬菌體誘發(fā)抗性突變等。第五十頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一例：王歲樓；張一震；李志。谷氨酸高產(chǎn)菌TZ-310的誘變選育及其發(fā)酵的研究

。中國調(diào)味品，1997年09期

。

摘要：以天津短桿菌Ｔ６-１３為出發(fā)菌株，經(jīng)６０Ｃｏ—γ射線、紫外線和硫酸二乙酯復(fù)合誘變并經(jīng)高溫馴化，獲得一株琥珀酸和生物素雙營養(yǎng)缺陷型突變株。該菌株具有耐高糖、耐高谷氨酸（ＧＡ）、不分解利用ＧＡ及耐高溫（３８℃～４５℃）的優(yōu)點。第五十一頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一原生質(zhì)體融合就是將兩個親株的細胞壁分別通過酶解作用加以剝除，制得原生質(zhì)體或原生質(zhì)球，在高滲條件下混合，由聚乙二醇(PEG)助融，促使原生質(zhì)體凝集、融合，兩個基因組之間接觸、交換、遺傳重組，在再生細胞中獲得重組體。

三、雜交育種雜交育種常規(guī)雜交原生質(zhì)體融合第五十二頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一谷氨酸產(chǎn)生菌的前處理因為其有著特殊的細胞壁結(jié)構(gòu)，對溶菌酶一般不敏感。方法：加入EDTA（乙二胺四乙酸

）、甘氨酸、青霉素和D-環(huán)絲氨酸等，這些物質(zhì)可以使細胞壁變得疏松，便于溶菌酶處理。如，李蒲興等將6株谷氨酸產(chǎn)生菌以甘氨酸、青霉素和溶菌酶的不同組合處理，對其原生質(zhì)體形成進行比較，在最佳條件下，原生質(zhì)體形成率可達95％～100％。

第五十三頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一

張蓓等以谷氨酸產(chǎn)生菌天津短桿菌T6-13為出發(fā)菌株，獲得了具有目的遺傳標(biāo)記寡霉素抗性(Orm)和氟乙酸抗性(FEAr)的突變株TN63和TN115。然后，分別以TN63和TN115為親株，通過原生質(zhì)體融合，獲得了具有Orm+FEAr標(biāo)記的融合子FTN9108，其原生質(zhì)體融合頻率為2.6×10-3。OrmFEAr+OrmFEArOrmFEAr第五十四頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一四、代謝控制選育以誘變育種為基礎(chǔ)，獲得各種解除或繞過微生物正常代謝途徑的突變株，從而人為地使有用產(chǎn)物選擇性地大量生成積累。Glu產(chǎn)生菌誘變育種突變株代謝控制發(fā)酵大量積累Glu第五十五頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一第五十六頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一1.選育耐高糖、高谷氨酸的菌株

如選育在含20％～30％葡萄糖的平板上生長良好的耐高糖突變株；在含15％～20％味精的平板上生長良好的耐高谷氨酸突變株；在20％的葡萄糖加15％味精的平板上生長良好的耐高糖、耐高谷氨酸的菌株。第五十七頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一2.選育能強化谷氨酸合成代謝、削弱或阻斷支路代謝的菌株（1）選育不分解利用谷氨酸的突變株

選育在以谷氨酸為唯一碳源培養(yǎng)基上不長或生長微弱的突變株。谷氨酸谷氨酰胺鳥氨酸瓜氨酸精氨酸第五十八頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一（2）選育強化CO2固定反應(yīng)的突變株

a.選育以琥珀酸或蘋果酸為唯一碳源，生長良好的菌株。因為細胞內(nèi)碳代謝必須走四碳二羧酸的脫羧反應(yīng)，該反應(yīng)與C02固定反應(yīng)是相同酶所催化，C02固定反應(yīng)相應(yīng)地加強。第五十九頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一b.選育氟丙酮酸敏感突變株。因為氟丙酮酸是丙酮酸脫氫酶的抑制劑，即抑制丙酮酸向乙酰CoA轉(zhuǎn)化，相應(yīng)地CO2固定反應(yīng)加強。突變株對氟丙酮酸越敏感，效果越理想。c.選育減弱乙醛酸循環(huán)的突變株。乙醛酸循環(huán)減弱不僅能使C02固定反應(yīng)比例增大，而且異檸檬酸也能高效率地轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸，再生成谷氨酸。常見的該突變株有琥珀酸敏感型突變株和不分解利用乙酸的突變株。第六十頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一（3）選育解除谷氨酸對谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)的突變株

有酮基丙二酸抗性突變株、谷氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株和谷氨酰胺抗性突變株。草酰乙酸谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶天冬氨酸+α-酮戊二酸谷氨酸α-酮戊二酸NH3谷氨酸脫氫酶第六十一頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期一（4）選育強化能量代謝的突變株

原因：使TCA循環(huán)前一段代謝加強，谷氨酸合成速率加快。a.選育呼吸鏈抑制劑抗性突變株如可選育丙二酸、氧化丙二酸、氰化鉀、氰化鈉抗性突變株來實現(xiàn)。b.選育ADP磷酸化抑制劑抗性突變株如可選育2,4-二硝基酚、羥胺、砷、胍等抗性突變株來實現(xiàn)