雞馬立克氏病病毒PCR檢測(cè)法

雞馬立克氏病病毒PCR檢測(cè)法1、概述針對(duì)MDV血清1型病毒特有的meq基因和132堿基重復(fù)序列（132bpr）的PCR檢測(cè)，可以對(duì)MDV血清1型病毒感染進(jìn)行檢測(cè)和鑒定；同時(shí)可以對(duì)野毒株和疫苗株感染加以區(qū)分。2、試劑2.1陰性和陽(yáng)性對(duì)照：分別為SPF雞的組織和MDV強(qiáng)弱毒細(xì)胞株培養(yǎng)物提取的核酸，-2（rc保存。2.2組織細(xì)胞裂解液：為病毒總DNA提取試劑。2.3苯酚，氯仿，異戊醇；均為分析純。2.475%乙醇：用無(wú)水乙醇和水配制，-2（TC預(yù)冷。3、器材PCR擴(kuò)增儀。臺(tái)式低溫高速離心機(jī)。穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽。凝膠成像儀（或紫外透射儀）。-2（rc冰箱。微量可調(diào)移液器（0.5uL?10uL、5uL?40uL、40uL?200口L和200uL-1000口L各1支）。PCR擴(kuò)增管。4、操作方法樣品準(zhǔn)備本方法適用所有的MD病原樣品包括羽髓、肝臟、脾臟、腎臟等器官。以及淋巴細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)物等。在無(wú)菌環(huán)境中，將采集的動(dòng)物機(jī)體組織研磨，加PBS洗2次，12000r7min離心lOmin,取沉淀用于提取總DNA。細(xì)胞樣品不需要研磨處理，直接用于提取總DNAo核酸提取.1酚氯仿法C.2.1取待檢樣本、陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照各5HL?10uL(lug/uL)分別置于15mL離心管中，每管加入1OOOuL組織細(xì)胞裂解液，置于371水浴4h期間適當(dāng)旋轉(zhuǎn)混勻。C.2.2將溶液冷卻至溫，加入等體積的用lOOmmol/LTris-ClpH8.0平衡過(guò)的苯酚顛倒混勻；下，12000r離心10minoC.2.3用寬口移液管吸出水相于新的干凈的離心管中，重復(fù)步驟C.2.2OC.2.4用寬口移液管吸出水相于新的干凈的離心管中，加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25：24：1)倒轉(zhuǎn)混勻成乳濁狀，靜置5min后，12000r離心10minoC.2.5用寬口移液管吸出水相于新的干凈的離心管中，加入等體積的異戊醇，倒轉(zhuǎn)混勻，靜置5min后，12000r離心lOmin。C.2.6重復(fù)步驟C.2.5oC.2.7用寬口移液管吸出水相于干凈的離心管中，加入25倍體積的無(wú)水乙醇，倒轉(zhuǎn)混，-201靜置2h,4℃12000r/min離心20min后，棄盡上清。C.2.8沉淀用75%的冷乙醇洗滌2次，12000r/min離心lOmin,盡量吸干液體；室溫干燥5min?lOmin。C.2.9每管加入10uLTE緩沖液（pH8.0）溶解DNA。提取的DNA即可用于PCR擴(kuò)增，也可以-70七冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.2.2核酸提取等效方法MDV核酸提取可以采用細(xì)胞、血液和組織提取試劑盒，按照使用說(shuō)明書操作。4.3PCR擴(kuò)增4.3.1擴(kuò)增試劑的準(zhǔn)備在試劑配制區(qū)進(jìn)行。設(shè)PCR反應(yīng)數(shù)為n,n為待檢樣品數(shù)+陽(yáng)性對(duì)照+陰性對(duì)照，宜按n+1個(gè)反應(yīng)進(jìn)行配制。將上下游引物，Taq酶，buffer,dNTP和去離子水按照使用量加入到一個(gè)離心管中，混勻，每個(gè)PCR管中分裝19UL記錄好待檢樣品管、陰性對(duì)照管、陽(yáng)性對(duì)照管，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。4.3.2加樣在樣本處理區(qū)進(jìn)行，在已分裝有PCR反應(yīng)液的PCR擴(kuò)增管中分別加入已制備好的DNA溶液1uL,蓋緊。4.3.3PCR反應(yīng)將PCR管放入PCR擴(kuò)增儀中，按照設(shè)定擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增。4.4瓊脂糖凝膠電泳4.4.1制備1%瓊脂糖凝膠板。依據(jù)樣品數(shù)選用適宜的梳子，待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣孔），放入電泳槽中加1XTAE緩沖液淹沒(méi)膠面。4.2加樣取6uL?8uLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和加樣緩沖液混勻后加入一個(gè)加樣孔。每次電泳同時(shí)加樣標(biāo)準(zhǔn)DNAMarker、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照。4.3電泳：電壓0V?100V或電流40mA?50mA；電泳30min?40min。5、PCR檢測(cè)結(jié)果判定1試驗(yàn)成立判定電泳結(jié)束后.取出凝膠板置于紫外透射儀或凝膠成像系統(tǒng)觀察。陽(yáng)性對(duì)照樣品，meq基因應(yīng)檢測(cè)到786bp大小條帶，132bpr應(yīng)檢測(cè)到317bp大小的條帶，且陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶，則試驗(yàn)成立；否則，此次試驗(yàn)視為無(wú)效。5.2陽(yáng)性判定2.1若待檢樣品擴(kuò)增結(jié)果meq基因檢測(cè)為786bp或963bp大小條帶；132bpr檢測(cè)產(chǎn)物為317bp或449bp大小單一條帶，或者為多帶型條帶（存在2條以上的條帶，一般可出現(xiàn)5條?8條，大小為185bp,317bp,449bp,58Ibp,713bp,845bp,977bp,1109bp）,表明檢測(cè)樣品中MDV血清1型病毒陽(yáng)性（示例圖見C）o（圖C1132bpr引物擴(kuò)增結(jié)果示例圖）（圖C2meq引物擴(kuò)增結(jié)果示例圖）2.2若待檢樣品擴(kuò)增結(jié)果,meq基因檢測(cè)為786bp大小條帶，132bpr檢測(cè)為317bp或449bp大小單一條帶，表明該MDV為野毒株（示例圖見C）。2.3若待檢樣品擴(kuò)增結(jié)果meq基因檢測(cè)為963bp大小條帶，132bpr檢測(cè)為多帶型條帶（存在2條以上的條帶，一般可出現(xiàn)5條?8條，大小為185bp,317bp,449bp,581bp,713bp,845bp,977bp,1109bp）表明檢測(cè)樣品中MDV血清1型病毒陽(yáng)