生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)基本知識(shí)

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)基本知識(shí)

主編：齊錦生編委：

孔德娟齊錦生許麗輝楊崇輝周秀霞羅湘衡君智煒張曉玲王芳

實(shí)驗(yàn)室要求

一、實(shí)驗(yàn)課的目的

1、加深懂得：加深對生物化學(xué)差不多理論的懂得。

2、把握技術(shù)：把握生物化學(xué)的差不多實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)技術(shù)（四大差不

多技術(shù)：離心、電泳、層析、比色）及分子生物學(xué)的一些差不多技術(shù)和方

法。

3、培養(yǎng)能力：培養(yǎng)學(xué)生的思維能力、動(dòng)手能力和表達(dá)能力。

4、把握精髓：科學(xué)的精髓是實(shí)事求是、敢于探究、善于創(chuàng)新的精神，

要對實(shí)驗(yàn)中顯現(xiàn)的一切反?，F(xiàn)象進(jìn)行討論，并大膽提出自己的看法。

二、生化實(shí)驗(yàn)室規(guī)則和要求

1、預(yù)習(xí)：課前要預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)教材，了解實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、原理，熟悉操作?guī)

程。

2、秩序：自覺遵守紀(jì)律，愛護(hù)教學(xué)秩序，不準(zhǔn)遲到、早退，保持安

靜，嚴(yán)禁談笑打鬧，聽從教師指導(dǎo)，未經(jīng)教師同意，不得隨意離開實(shí)驗(yàn)室。

3、整潔：搞好實(shí)驗(yàn)環(huán)境和儀器的衛(wèi)生整潔，實(shí)驗(yàn)臺(tái)面必須保持整潔,

儀器藥品要井然有序，公用試劑用畢，應(yīng)趕忙蓋嚴(yán)放回原處，勿使藥品試

劑撒在實(shí)驗(yàn)臺(tái)面和地面。實(shí)驗(yàn)完畢，需將藥品試劑排列整齊，儀器要洗凈

倒置放好。固體廢物，如濾紙、棉花、血塊不得倒入水池中，以免堵塞下

水道；一樣性廢液可倒入水池中沖走，但強(qiáng)酸強(qiáng)堿或有毒有害溶液必須用

水高度稀釋后，方可倒入水池中，同時(shí)放水沖走，以免腐蝕水管。全體同

學(xué)由班長安排輪番值日，負(fù)責(zé)當(dāng)天實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生、安全和一些服務(wù)性工作，

經(jīng)教師驗(yàn)收合格后，方可離開實(shí)驗(yàn)室。

4、節(jié)約：使用儀器、藥品、試劑及各種物品必須厲行節(jié)約，并節(jié)

約水電。應(yīng)專門注意保持藥品和試劑的純潔，嚴(yán)防混雜、亂用和污染。使

用和洗滌儀器應(yīng)小心認(rèn)真，防止損壞，貴重儀器使用前應(yīng)熟悉使用方法，

嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，嚴(yán)禁隨意開動(dòng)，發(fā)覺故障后應(yīng)趕忙報(bào)告指導(dǎo)教師，不

要自己動(dòng)手檢修，如有損壞按學(xué)校規(guī)定賠償。

5、安全：注意人身和國家財(cái)產(chǎn)安全是至關(guān)重要的，要時(shí)刻注意防

火、防水、防電、防危險(xiǎn)品、防事故，以免發(fā)生意外。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙。

使用乙醛、苯、乙醇、丙酮等易燃品時(shí)，不承諾在電爐、酒精燈上直截了

當(dāng)加熱。實(shí)驗(yàn)中須遠(yuǎn)離火源，如有危險(xiǎn)發(fā)生，應(yīng)第一關(guān)掉電源；有機(jī)溶劑

著火時(shí)，勿用水潑，以免擴(kuò)大燃燒面積，可用沙土、滅火器具滅之。用火

時(shí)必須嚴(yán)格做到：火著人在，人走火滅。用畢電器后及時(shí)切斷電源。加熱

試劑、液體時(shí)，管口不要對人，要十分小心操作，幸免灼傷人。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)

一切物品未經(jīng)本室負(fù)責(zé)教師批準(zhǔn)，嚴(yán)禁攜帶出室外，有毒物品專門如此。

借物必須辦理登記手續(xù)。

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)概述

一、層析法

層析是利用混合物各組分物理化學(xué)性質(zhì)（如：溶解度、吸附能力、電

荷和分子量等）的差別，使各組分在支持物上集中分布在不同區(qū)域，借此

將各組分分離。

層析系統(tǒng)分為兩個(gè)相：固定相和流淌相。由于各組分受固定相的阻力

和受流淌相的推力阻礙不同，各組分移動(dòng)速度也各異，從而使各組分得以

分離。此法第一用于有色物質(zhì)的分離，故又稱色層析法。

層析法是近代生物化學(xué)最常用的分析法之一，此法能夠分離性質(zhì)極為

相似、而用一樣化學(xué)方法難以分離的各種化合物，如各種氨基酸、核甘酸、

糖、蛋白質(zhì)等。

層析法有多種類型，按照所用兩組分不同分為以下幾類：吸附層析、

分配層析、離子交換層析、凝膠層析和親和層析等；按照操作方式不同分

為：柱層析、薄層層析和紙層析等。

(-)吸附層析法：

吸附層析法(absorptionchromatography)是混合物隨流淌相通過吸附

劑時(shí)，由于吸附劑對不同物質(zhì)有不同的吸附力而使混合物分離的方法。吸

附層析按照操作方式的不同，分為柱層析與薄層層析兩種。

1、柱層析法：柱層析法是用一根玻璃管柱，下端鋪墊棉花或玻璃棉，

管內(nèi)加吸附劑粉末，用一種溶劑潤濕后，即成為吸附柱，如圖1中的(l)o

然后在柱頂部加入要分離的樣品溶液，如圖1中的(2)o如果樣品內(nèi)含兩

種成分A和B,則二者被吸附在柱上端，形成色圈，如圖1中的(3)o樣

品溶液全部溶入吸附柱中之后，接著就加入合適的溶劑洗脫，如圖6-0-1中

的(4)。A與B就隨著溶劑的向下流淌而移動(dòng)。最后分離情形如圖1中的

(5)所示。

圖6-0-1二元混合物的柱層析示意圖

在洗脫過程中，管內(nèi)連續(xù)發(fā)生溶解、吸附、再溶解、再吸附的現(xiàn)象。

例如，被吸附后的A粒子被溶解(解吸作用)隨溶劑下移，但遇到新的吸

附劑，又將A粒子吸附，隨后，新溶劑又使A粒子溶解下移。由于溶劑與

吸附劑對A與B的溶解力與吸附力不完全相同，A與B移動(dòng)的速率也不同，

經(jīng)一定時(shí)刻，如此反復(fù)地溶解與吸附，而形成兩個(gè)環(huán)帶，每一環(huán)帶是一種

純物質(zhì)。如A與B有顏色可看到色層；如樣品無色，可用其它方法使之顯

色，為進(jìn)一步鑒定，可將吸附柱從管中頂出來，用刀將各色層切開，然后

分別洗脫，現(xiàn)在多采納溶劑洗脫法，即連續(xù)加入溶劑，連續(xù)分段收集洗脫

劑，直到各成分順序全部從柱中洗出為止。

最常用的吸附劑是硅膠和氧化鋁。硅膠的吸附能力和含水量關(guān)系極大，

硅膠吸水后，吸附能力下降，常用于分離非極性的和極性不強(qiáng)的有機(jī)物，

如甘油脂、磷脂、膽固醇等。

2、薄層層析法：薄層層析法是吸附劑在玻璃板上平均地鋪成薄層，把

要分析的樣品點(diǎn)加到薄層上，然后用適當(dāng)?shù)娜軇┱归_，而達(dá)到分離、鑒定

的目的。其優(yōu)點(diǎn)是：設(shè)備簡單，操作容易；層析展開時(shí)刻短，分離時(shí)幾乎

不受溫度的阻礙；可采納腐蝕性的顯色劑，且能夠在高溫下顯色；分離效

率高。

薄板的制備：所用玻璃板表面必須光滑、清潔。

按照制薄板的方法不同薄板能夠分為軟板和硬板兩種。軟板即不加粘

合劑，將吸附劑干粉直截了當(dāng)平均鋪在玻板上；制作簡單方便，然而易被

吹散。硬板即用粘合劑如水或其他液體，將吸附劑調(diào)成糊狀再鋪板，經(jīng)干

燥后才能使用；制備盡管較繁瑣，但易于儲(chǔ)存。具體制備方法如下：

（1）軟板：選用一根直徑約為1?1.2cm的玻璃管，按照薄層的厚度在

玻璃管兩端纏幾圈膠布，膠布的厚度按需要的薄層厚度而定。常用的厚度

約為左右。把干的吸附劑倒到玻璃板上，玻板的一端固定，防止

推玻璃管時(shí)玻板移動(dòng)，然后將玻璃管壓在玻板上，把吸附劑由一端推向另

一端，即成薄板。要求：光滑、平坦、厚度平均。

（2）硬板：將適當(dāng)調(diào)好的吸附劑倒在兩塊3mm玻板中間所夾的一塊2

mm厚度的玻板上，然后用一塊邊緣光滑的玻片把吸附劑刮向一邊，即成厚

度一定的薄板。下面介紹氧化鋁和硅膠硬板的制備方法。

氧化鋁硬板：稱取氧化鋁G25g（G表示石膏，這種氧化鋁中含5%鍛

石膏），加水25ml,在燒杯中調(diào)成糊狀，鋪層，先在空氣中干燥，后置于2

00?220（烘箱中烤4小時(shí)即可使用。

硅膠硬板：稱取硅膠G30g,加水60?90ml,在燒杯中調(diào)成平均糊狀，

趕忙鋪層，室溫內(nèi)干燥后置烘箱中烘干。此外，也可用淀粉或竣甲基纖維

素鈉（CMC）作粘合劑制板。

薄層層析的操作步驟是：點(diǎn)樣、展開、顯色。

（二）分配層析：

分配層析是利用混合物在二種或二種以上的不同溶劑中的分配系數(shù)不

同而使物質(zhì)分離的方法。如用帶水的材料（載體）作為液相（固定相），加

入與水不相混合或僅部分混合的溶劑（流淌相），則混合物各組分在兩相間

發(fā)生不同的分配現(xiàn)象而逐步分開，形成色層。

載體在分配層析中只起負(fù)擔(dān)固定相的作用，它們是一些吸附力小、反

應(yīng)性弱的惰性物質(zhì)，如淀粉、纖維素粉、濾紙等。固定相除水外，還有稀

硫酸、甲醇、仲酰胺等強(qiáng)極性溶液。流淌相則采納比固定相極性小或非極

性的有機(jī)溶劑。紙層析是最廣泛應(yīng)用的一種分配層析。

紙層析法以濾紙為載體，濾紙上吸附著水（約含20%—22%）是經(jīng)常

用的固定相，此類有機(jī)溶劑如醇、酚等為常用的流淌相。把欲分離的物質(zhì)

加在紙的一端，使流淌溶劑經(jīng)此移動(dòng)，如此就在兩相間發(fā)生分配現(xiàn)象。由

于物質(zhì)分配系數(shù)的不同，就逐步在紙上集中于不同的部位。在固定相中分

配趨勢較大的成份，隨流淌相移動(dòng)的速度就慢；反之，在流淌相分配趨勢

較小的成分，移動(dòng)速度就快。物質(zhì)在紙上移動(dòng)的速度能夠用Rf表示：

色斑中心至原點(diǎn)中心的距離

Rf

溶劑前緣至原點(diǎn)中心的距離

物質(zhì)在一定溶劑中的分配系數(shù)是一定的，故移動(dòng)速率（Rf值）也恒定,

因此，能夠按照Rf值來鑒定被分離的物

質(zhì)。

紙層析法按操作方法分成兩類，即：

垂直型和水平型。垂直型是將濾紙條懸起,

使流淌相向上或向下擴(kuò)散；水平型是將圓

形濾紙置于水平位，溶劑由中心向四周擴(kuò)

散。

垂直型使用較廣，按分配物質(zhì)的多寡,

將濾紙截成長條，在某一端距邊緣2?4cm處點(diǎn)樣，待干后，將點(diǎn)樣端邊緣

與溶液接觸，在密蓋的玻璃缸內(nèi)進(jìn)行展開

見圖6-0-1

圖6-0-2垂直紙層析

上述方法只用一種溶劑系統(tǒng)進(jìn)行

一次展開，稱為單向?qū)游?。如果樣品?/p>

分較多，而且彼此的Rf值相近，單向

層析分離成效不佳，可用雙向?qū)游龇ǎ?/p>

即在長方形或方形濾紙的一角點(diǎn)樣，卷

成圓筒形，先用第一種溶劑系統(tǒng)展開，

展開完畢吹干后轉(zhuǎn)90°,再放于另一種

溶劑系統(tǒng)中，向另一方向進(jìn)行第二次展

開，如此各成分分離較為清晰。見圖6

-0-3

圖6-0-3

(三)離子交換層析：

離子交換層析法(ionexchangechromatographyIEC)是利用離子

交換劑對需要分離的各種離子有不同的親和力而達(dá)到分離的目的，這種柱

層析稱為離子交換層析。

離子交換劑是通過化學(xué)反應(yīng)將帶電荷基團(tuán)引入惰性支持物上而形成。

離子交換作用是指一溶劑中某一種離子與一固體中的另一種具有相同電荷

的離子進(jìn)行相互位置的調(diào)換。由于各種離子所帶電荷的多少不同，它們對

交換劑的親和力就有所差別。因此，在洗脫過程中，各種離子由固體柱上

先、后下來的順序不同，從而可達(dá)到分離的目的。這種離子交換是定量完

成的，因此測定溶液中由固體上交換下來的離子量，可知樣品中原有離子

的含量，也可將吸附在交換劑上的樣品的成分用另一洗脫液洗脫下來，進(jìn)

行定量測定。

離子交換層析要緊用于蛋白質(zhì)、多肽的分離。核酸也是強(qiáng)極性分子，

用離子交換層析也能得到專門好的分離成效。

離子交換劑種類專門多，按照交換劑上吸附的離子交換基團(tuán)不同，可

分為陽離子交換劑和陰離子交換劑；按照惰性支持物不同，又有樹脂、纖

維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠及瓊脂糖凝膠等種類。目前大多采納

的離子交換劑是合成離子交換劑，即離子交換樹脂，其分為兩大類：分子

中具有酸性基團(tuán)，能交換陽離子的稱為陽離子交換樹脂；分子中具有堿性

基團(tuán)，能交換陰離子的稱為陰離子交換樹脂。按其解離性的大小，又可分

為強(qiáng)弱兩種：

磺酸基（一SO3H）r

強(qiáng)酸性「一

陽離子交換樹脂1酚羥基（一OH）

弱酸性較基（一COOH）

強(qiáng)堿性季胺基(->NR4)

陰離子交換樹脂一伸胺基(-NH2)

弱堿性仲胺基(-NHR),

叔胺基（-NR2）

交換反應(yīng)舉例如下:

R-SO3-H++M+X-R-SO3-M++X-H+

R4三N+OH-+H+X--R4三N+X-+H+OH-

離子交換樹脂的交換容量與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，這直截了當(dāng)關(guān)系到合成過程。

離子交換樹脂要緊是按照有機(jī)化學(xué)反應(yīng)（如硝化、磺化、氯甲基化和胺化

等）及高分子合成反應(yīng)（如聚合及縮合）的差不多原理進(jìn)行合成的。離子

交換劑的母體聚合物有苯乙烯、酚醛及丙烯酸等。常見的聚苯乙烯樹脂由

苯乙烯聚合，再加入二乙稀交聯(lián)：

（方程式1）插入附件1

在那個(gè)母體上引進(jìn)功能基就得到各種離子交換樹脂，如制備強(qiáng)酸性陽

離子樹脂時(shí)，馬上母體加以磺化：

（方程式2）插入附件2

制備強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂時(shí)，先將母體甲基化后，再加以胺化，即

得：

（方程式3）插入附件3

那個(gè)地點(diǎn)，樹脂中二乙烯苯的含量決定了樹脂的交聯(lián)度大小，應(yīng)盡量

選用交聯(lián)度高些，而且有較高的交換容量的樹脂。樹脂交換容量的單位為

毫克當(dāng)量/克（干樹脂）或者毫克當(dāng)量/毫升（濕樹脂）。測定樹脂的交換容

量方法：陽離子交換樹脂：第一，用氫氧化鈉溶液通過已轉(zhuǎn)型為氫型的樹

脂，將H+替換出來，其反應(yīng)式：

R-SO3H+NaCl』R-SO3Na+HCl

再用酸堿滴定法測定流出液中鹽酸的當(dāng)量數(shù)，即可運(yùn)算交換容量，即:

HCl+NaOHfNaCl+H2O

而測定陰離子交換樹脂交換容量的反應(yīng)則為：

R4NOH+NaCl-R4NCl+NaOH

NaOH+HCl-NaCl+H2O

離子交換纖維素是30年來廣泛用于分離純化蛋白質(zhì)的離子交換劑。目

前常用的離子交換纖維素列于下表：

（表1）目前常用的離子交換纖維素

離子交換劑游離基團(tuán)結(jié)構(gòu)

陰離子交換劑

強(qiáng)堿性-OCH2CH2N(C2H5)3

TEAE三乙基氨基乙基NH

I1

胭基乙基

GE-OCH2CH2NHC—NH2

QAE-Sephadex二乙基（2-羥丙基）季胺-C2Hq+(C2H5)2

CH2CHCH3

弱堿性O(shè)H

DEAE二乙基氨基乙基-OCH2CH2N(C2H5)2

PAB對氨基苯甲基

中等堿性

氨基乙基

AE-OCH2CH2NH2

ECTEOLA三乙醇胺經(jīng)甘油和多聚甘油鏈偶聯(lián)于

纖維素的混合基團(tuán)（混合胺類）

DBD苯甲基化的DEAE纖維素

BND苯甲基化蔡?；腄EAE纖維素

PEL聚乙烯亞胺吸附于纖維素或較弱磷酰

化的纖維素

陽離子交換劑

弱堿性

CM竣甲基-OCH9COOH

中等酸性p

1

P磷酸-O-P—OH

I

強(qiáng)酸性O(shè)H

O

I

SE磺酸乙基-OCH9CH7-S—OH

I

O

O

1

SP-Sephadex磺酸丙基

-OC3H6-S—OH

I

O

常用離子交換樹脂某些物理化學(xué)性質(zhì)表

（表2）插入附件4—1,2、3

各類常用離子交換樹脂型號(hào)對比表

（表3）插入附件5

離子交換介質(zhì)在純化步驟中的選擇

（表4）插入附件6

離子交換層析介質(zhì)的技術(shù)數(shù)據(jù)

（表5）插入附件7—1、2

（四）凝膠層析（分子篩層析）

凝膠層析（gelfiltration）又稱分子篩層析、排阻層析或凝膠滲透色譜,

要緊是按照混合物中各種分子的分子量不同，通過固定相凝膠時(shí)，分子的

擴(kuò)散速度各異，使大小不同的分子得到分離和純化。它不僅用于大分子物

質(zhì)的分離，也可用于分子量測定以及蛋白質(zhì)樣品除鹽等。

所謂凝膠是一類具有三維空間多孔性的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)。在洗脫過程中,

分子量最大的物質(zhì)由于不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆粒間的間隙而最先流

出；分子量最小的物質(zhì)因能鉆入網(wǎng)孔而受阻滯，流速緩慢，而最后流出；

分子量介于最大和最小之間的物質(zhì)，流出的順序在最大分子量物質(zhì)之后，

而在最小分子量物質(zhì)之前。因此，各組分的洗脫順序與其分子量成正比。

（圖6-0-4）插入附件8

凝膠是由膠體溶液凝聚而成的固體物質(zhì)，是含有大量液體的柔軟而富

于彈性的物質(zhì)。吸水量大于7.5g/g的凝膠稱軟膠，吸水量小于7.5g/g的凝

膠稱為硬膠。按照凝膠物質(zhì)的來源可分為天然凝膠和人工合成凝膠兩類。

1、天然凝膠：要緊是一些糖類物質(zhì)，如淀粉、瓊脂及瓊脂糖等。

淀粉凝膠應(yīng)用較早，但因其理化性質(zhì)不夠穩(wěn)固，洗脫時(shí)的阻力較大，

洗脫時(shí)刻長等缺點(diǎn)阻礙了它的應(yīng)用。

瓊脂來源于一種海藻，是由D-半乳糖和L-半乳糖所組成的多聚糖。它

能分離分子量較高的物質(zhì)。其缺點(diǎn)是帶有大量的電荷（要緊是磺酸基，其

次為較基），層析經(jīng)常需用較高離子強(qiáng)度的洗脫液，使洗脫物含有一定量鹽

分，而阻礙產(chǎn)品的純度。

瓊脂糖凝膠(sepharose)應(yīng)用較多，它又稱生物凝膠A(biogel一A),

由瓊脂糖溶液冷卻后，

通過分子間氫鍵，自發(fā)凝集成束，形成穩(wěn)固的珠狀凝膠。穩(wěn)固性較差,

工作pH值范疇在4?9之間，4(TC以上易老化，不能高壓和冰凍，其機(jī)械強(qiáng)

度取決于瓊脂糖的含量。它有2B、4B、6B三個(gè)級(jí)別，含瓊脂糖的濃度分

別為2%、4%、6%0Sepharose結(jié)構(gòu)開放，排阻極限比Sephadex大，分離

范疇廣泛，適用于DNA大片段分離。各種型號(hào)瓊脂糖凝膠的的性質(zhì)及生產(chǎn)

廠商見下表。

(表6)瓊脂糖凝膠的技術(shù)數(shù)據(jù)

凝膠內(nèi)瓊脂

排阻的下限分級(jí)分離的范疇

名稱、型號(hào)糖％含量(W/生產(chǎn)廠商

(Mr)(Mr)

w)

Sagavac10102.5X10，1X10’s2.5X10，Seravac

Sagavac887X1052.5X104s7X105Laborato

Sagavac662X1065X104s2X106ries,Mai

Sagavac4415X1062X10$s15X106denhead,

Sagavac22150X1065X10's15X107England

Bio-GelA-0.5M100.5X10bVlXlO's2.5X106Bio-Pad

Bio-GelA-1.5M81.5X106<1X1O4s7X106Laboratori

Bio-GelA-5M65X1061X104s2X106es,Californ

Bio-GelA-15M415X1064X10"s15X106ia,U.S.A

Bio-GelA-50M250X106IXIO,s15X106

Bio-GelA-150M1150X106IXlO's15X106

2、人工合成的凝膠：常用的有葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩大類。

葡聚糖凝膠又稱交聯(lián)葡聚糖凝膠，英文名稱為Dextrak,商品名稱為S

ephadex,由許多右旋葡萄糖單位通過1,6-糖昔鍵聯(lián)結(jié)成鏈狀結(jié)構(gòu)，再由交

聯(lián)劑1-氯-2,3-環(huán)氧丙烷(CH2-CH-CH2CL,又稱氯醇)交聯(lián)而形成多孔網(wǎng)

狀結(jié)構(gòu)高分子化合物。其差不多結(jié)

構(gòu)如圖:

(圖5)插入附件9

在合成凝膠時(shí)，調(diào)劑葡聚糖和交聯(lián)劑的配比，能夠獲得具有不同大小

網(wǎng)眼的葡聚糖凝膠。G表示交聯(lián)度，G越大，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)越緊密，吸水性差,

膨脹也小，適用于分離小分子物質(zhì)；G越小，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)疏松，吸水量大，

適用分離大分子物質(zhì)。商品凝膠的型號(hào)采納“吸水量”的10倍數(shù)字表示，

例如，每g凝膠吸水量為2.5g即定為G—25型。各種型號(hào)葡聚糖凝膠的性

質(zhì)見下表。

（表7）各種型號(hào)葡聚糖凝膠的性質(zhì)

型號(hào)分離范疇（分子量）吸水量膨脹體積浸泡時(shí)刻（小時(shí)）

蛋白質(zhì)多糖g/g干凝膠ml/g干凝膠20-25u90-100"

G-10<700<7001.0±.012s331

G--15<1500<15001.5±0.22.5s3.531

G--251000^5000100^50002.5±0.24s631

G--501500^3000500s100005.0±0.39sli31

G--753000^700001000^500007.5±0.512sl5243

G--1004000s1500001000^10000010±1.015s20725

G--1505000^4000001000^15000015±1.520s30725

G—2005000^8000001000^20000020±2.030s40725

由上表可見，Sephadex一G值越大，吸水量越大，分離范疇（分

子量）越大

聚丙烯酰胺凝膠其商品名為生物凝膠P（Bio-GelP）,是用丙稀酰胺（a

crylamide,簡稱Acr）和交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺（N,N'—methylene

bisacrylamide,簡稱Bis）在催化劑的作用下聚合而成。其結(jié)構(gòu)式如下：

（方程式4）

張龍翔P90

聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：

（1）化學(xué)聚合：催化劑多采納過硫酸錠（ammoniumpersulfare,AP）

或過硫酸鉀，此外還需要一種脂肪族叔胺作為加速劑，最有效的加速劑為N,

N,N',N'一四甲基乙二胺（N,N,N',N'—tetramethylethylened

iamine,TEMED),其次為三乙醇胺及二甲氨基丙腌(3-dimethylaminoprop

ionitrile,DMPN)o在叔胺的催化下，由過硫酸胺形成氧的自由基，后者又使

單體形成自由基，從而引發(fā)聚合作用。因?yàn)槭灏芬幱谧杂蓧A狀態(tài)下才有

效，因此在低pH時(shí)，常會(huì)延遲聚合作用。分子氧阻止鏈的延長，防礙聚合

作用，一些金屬也能抑制聚合。冷卻能夠使聚合速度變慢，通常操縱這些

因素使聚合在一小時(shí)內(nèi)完成，以便使凝膠的性質(zhì)穩(wěn)固。

(2)光聚合：通常用核黃素作催化劑，不一定加TEMED即能聚合，

但加入則可加速聚合。光聚合通常需要有痕量氧存在，核黃素經(jīng)光解形成

無色基，后者被氧再氧化形成自由基，從而引發(fā)聚合作用，但過量的氧會(huì)

阻止鏈長的增加，應(yīng)該幸免過量的氧存在。光聚合通常用日光燈或一般鴿

絲燈泡作光源，直截了當(dāng)日光或室內(nèi)強(qiáng)散射光也能夠。

用核黃素進(jìn)行光聚合的優(yōu)點(diǎn)是：①核黃素的用量專門低(lmg/100ml)；

②通過光照能夠預(yù)定聚合時(shí)刻，但光聚合的凝膠孔較大，而且隨時(shí)刻延長

而逐步變小，不太穩(wěn)固，因此用它制備大孔凝膠較適合?；瘜W(xué)聚合的凝膠

孔徑較小，因而采納過硫酸胺一TEMED催化系統(tǒng)制備小孔凝膠(分離膠),

而且各次制備的重復(fù)性好。

凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系：凝膠濃度與被分離物的分子量

大小的關(guān)系，大至范疇如表：

(表8)Mr范疇與凝膠濃度的關(guān)系

Mr的范疇適用的凝膠濃度％

蛋白質(zhì)

<10420s30

1S4X10"15s20

4X1O4<^1X1O510^15

1^5X1055sl0

>5X1052s5

核酸

<10415s20

lO'sio'5sio

105s2X1()62s2.6

聚丙烯酰胺凝膠的機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性、透亮、相對的化學(xué)穩(wěn)固，對p

H和溫度變化較穩(wěn)固，在專門多溶劑中不溶，是非離子型的，沒有吸附和

電滲作用。原料成分要采納高純度制品，通過改變濃度和交聯(lián)度，能夠操

縱孔徑變動(dòng)在極廣泛的范疇，同時(shí)制備凝膠的重復(fù)性好，由于純度高及不

溶性，因此還適于少量樣品的制備，不致污染樣品。

（表9）聚丙烯酰胺凝膠的技術(shù)數(shù)據(jù)

型號(hào)排阻的下分級(jí)分離的范疇膨脹后的床體積所需最少時(shí)刻

限（M「）（Mr）ml/g干凝膠（室溫，小時(shí)）

Bio-gel-P-21600200—20003.82—4

Bio-gel-P-43600500—40005.82—4

Bio-gel-P-646001000—50008.82—4

Bio-gel-P-10100005000—1700012.42—4

Bio-gel-P-303000020000—5000014.910—12

Bio-gel-P-606000030000—7000019.010—12

Bio-gel-P-10010000040000—10000019.024

Bio-gel-P-15015000050000—15000024.024

Bio-gel-P-20020000080000—30000034.048

Bio-gel-P-300300000100000—40000040.048

下面幾張表列出凝膠層析介質(zhì)的一些性能指標(biāo)，供讀者參考。

表10各種凝膠所承諾的最大操作壓

凝膠建議的最大靜水壓（cmH2O）**

Seohadex

G-10100(98.06Pa)

G-15100(98.06Pa)

G-25100(98.06Pa)

G-50100(98.06Pa)

SeohadexG-7550(49.03Pa)

SeohadexG-10035(34.32Pa)

SeohadexG-15015(14.71Pa)

SeohadexG-20010(9.806Pa)

Bio-Gel

P-2100(98.06Pa)

P-4100(98.06Pa)

P-6100(98.06Pa)

P-10100(98.06Pa)

P-30100(98.06Pa)

P-60100(98.06Pa)

Bio-Gel-P-10060(58.83Pa)

Bio-Gel-P-15030(29.42Pa)

Bio-Gel-P-20020(19.61Pa)

Bio-Gel-P-30015(14.71Pa)

Sepharose

2Bl*(0.9806Pa)

4Bl(0.9806Pa)

Bio-Gel

A-0.5M100(98.06Pa)

A-1.5M100(98.06Pa)

A-5M100(98.06Pa)

Bio-GelA-15M90(88.25Pa)

Bio-GelA-50M50(49.03Pa)

Bio-GelA-150M30(29.42Pa)

*每cm凝膠濃度**1cmH20=0.9806Pa

（表11、）見附件10

（表12）見附件11—1.2

下面介紹幾種染料的性能及染色原理：

1、氨基黑10B（aminoblack10B）

C22H13O12N6S3Na3,Mr=715,入max=620?630nm。氨基黑是酸性染

料，其磺酸基與蛋白質(zhì)反應(yīng)構(gòu)成復(fù)合鹽，是最常用的蛋白質(zhì)染料。但用氨

基黑染SDS-蛋白質(zhì)時(shí)成效不行。另外，氨基黑染不同蛋白質(zhì)時(shí)的著色度不

等、色調(diào)不一（有藍(lán)、黑、棕等），作同一凝膠柱的掃描時(shí)誤差較大，需要

對各種蛋白質(zhì)作出本身的蛋白質(zhì)染料量（吸取值）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（方程式5）

插入分子式張龍翔P91

2、考馬斯亮藍(lán)G250,又名XylenebrilliantcyaninGo比考馬斯亮藍(lán)

R250多二個(gè)甲基。Mr=854,入max=590?610nm。染色靈敏度不如R250,

但比氨基黑高3倍。優(yōu)點(diǎn)在于它在二氯乙酸中不溶而成膠體，能選擇地染

色蛋白而幾乎無本底色。因此常用于需要重復(fù)性好和穩(wěn)固的染色，適于作

定量分析。

3、考馬斯亮藍(lán)R250（CoomassivebrilliantblueR250）,C45H44O7N3

S2Na,Mr=824,入max=560?590nm。染色靈敏度比氨基黑5倍，但蛋白質(zhì)

濃度超出一定范疇時(shí)，對高濃度蛋白的染色不合乎Beer定律，用作定量分

析時(shí)，要注意這點(diǎn)。

（方程式6）

插入分子式張龍翔P92

4、1-苯胺基-8-蔡磺酸(l-anilino-8-naphthalenesulfonicacid,ANS)

本身無熒光，但與蛋白質(zhì)結(jié)合后則產(chǎn)生熒光。將凝膠放在此染料溶液浸1?

3分鐘，用長波紫外燈照耀時(shí)，產(chǎn)生黃色熒光，可顯示蛋白質(zhì)lOOug,如

果不明顯，可將凝膠取出暴露于空氣或鹽酸氣中，或浸沒在3moi/L鹽酸中

幾秒至2分鐘，使表面蛋白質(zhì)稍變性，然后再用ANS染色，如此可顯示蛋

白質(zhì)20ng。

如此的染色優(yōu)點(diǎn)是可保留凝膠內(nèi)部的酶和抗體的活性。可將該區(qū)帶切

下來進(jìn)行酶活力測定；也可直截了當(dāng)把凝膠搗碎研細(xì)，用作抗原先注射動(dòng)

物，聚丙稀酰胺不阻礙抗體的產(chǎn)生。

(五)親和層析法：

生物體中許多高分子化合物具有與某些對應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特

性，例如，酶、蛋白與輔酶，抗原與抗體、酶與酶抑制劑、激素與受體等

體系，都具有這種特性。生物高分子與配體之間形成可解離的專一絡(luò)合物

的能力稱為親和力。按照這種具有親和力的生物高分子與配基間可逆性結(jié)

合和解離的原理而建立的層析技術(shù)稱為親和層析(affinitychromatograph

y)。

親和層析的優(yōu)點(diǎn)是：在溫順條件下進(jìn)行，操作簡單，效率高。親和層

析在分離、純化的效率上能夠講是最佳的方法。親和層析是由吸附層析進(jìn)

展起來的，它有關(guān)于建立在物理化學(xué)原理(如分子顆粒大小、分子帶電荷

狀況等)的分離方法而言，可稱為“生物專一吸附”的層析分離方法。在

親和層析過程中，被分離的生物分子在一定條件下，有選擇性地即高度特

異性地被結(jié)合到共價(jià)偶聯(lián)的不溶性載體的配基親和吸附劑上，然后改變原

有條件，如選用競爭性抑制劑、底物、輔助因子，或采納不同pH的緩沖液、

高濃度鹽，變性劑等，又可有選擇性地從親和吸附配基上把要分離的物質(zhì)

洗脫下來。通過親和層析，被分離物質(zhì)的純度有時(shí)一次即可提升幾倍、十

幾倍甚至幾百倍，活化回收率也是專門高的。

親和層析法的差不多過程如下：

1、偶聯(lián)：將欲分離的高分子物質(zhì)X（如抗原）的配基L（如抗體）在

不阻礙其生物功能的情形下與水不溶性的載體相結(jié)合（稱為固相化或固定

化），制成親和吸咐劑或免疫吸附劑。

2、裝柱：在層析柱內(nèi)裝入固相化的配基一親和吸附劑（稱為親和柱）。

3、親和吸附：含有高分子物質(zhì)X的混合液（如粗勻漿提取液或血清等）,

在有利于配基和高分子之間形成復(fù)合物的條件下，進(jìn)入親和吸附劑的層析

柱?；旌弦褐兄挥心芘c配基形成復(fù)合物的高分子X被吸附，而所有不能形

成復(fù)合物的雜質(zhì)則直截了當(dāng)流出。親和柱進(jìn)一步用緩沖液洗滌，以盡可能

地除去非親和吸附的物質(zhì)。

4、洗脫：改變洗脫條件，促使親和吸附劑一高分子復(fù)合物解離而開釋

出高分子的物質(zhì)X,便得到欲純化的活性物質(zhì)。

5、再生：將欲分離、純化的生物大分子從親和吸附劑中洗脫的過程，

確實(shí)是再生的過程。再生后的親和吸附劑可直截了當(dāng)用于又一周期的純化

工作。

用親和層析法分離大分子化合物可用下圖表示：

（圖6、7）

張龍翔P372

從理論上講，親和層析能夠用來純化各種酶、抗原、抗體、維生素結(jié)

合蛋白、傳遞蛋白、激素和藥物的受體、核酸、多酶系統(tǒng)以至完整的細(xì)胞。

固定化的配基也可用來探討生物體內(nèi)大分子和配基間的作用方式。這

種固相吸附劑還可作為生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能研究的工具。

下面對親和層析法中的幾個(gè)需要注意的咨詢題進(jìn)行分析討論：

第一，載體的選擇。

使親和物一方固相化的水不溶性化合物稱為載體。其應(yīng)具備下述特性:

1、高度親水。使固相吸附劑易與水溶液中的生物高分子接近。2、惰性載

體。載體的非專一性吸附應(yīng)盡可能小。3、具有相當(dāng)量的化學(xué)基團(tuán)可供活化

或化學(xué)改變。4、有較好的物理和化學(xué)的穩(wěn)固性，能經(jīng)得起配基固定化和親

和柱層析時(shí)可能采納的各種條件（如pH、離子強(qiáng)度、溫度、變性劑和去污

劑）的阻礙。5、具有多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能使被親和吸附的大分子自由通過,

從而增加配基的有效濃度。6、有良好的機(jī)械性能，為使親和柱有較好的流

速，載體最好是均一的珠狀顆粒。

常用的載體有纖維素，聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖凝膠。

（表13）珠狀凝膠分離范疇

珠狀凝膠分離范疇（Ml

瓊脂糖：

Sephaarose2B4X107

Sephaarose4B3X107

Sephaarose6B4X106

聚丙烯酰胺：

Bio-gel-p-3005X105

Bio-gel-p-1501.5XIO'

其次，配基的選擇。

作為理想的配基，它第一必須對欲純化的大分子具有專門高的親和力。

另外，小分子配基必須具備可修飾的功能基團(tuán)，通過這些基團(tuán)與載體形成

共價(jià)鍵。這些共價(jià)鍵的形成應(yīng)不致嚴(yán)峻地?fù)p害配基與欲純化蛋白質(zhì)的親合

力，用于親和層析的配基有酶的底物類似物、效應(yīng)物、酶的輔助因子及抗

體（或抗原）等。

第三，幾種類型的免疫吸附劑。

把抗原或抗體用共價(jià)鍵或其它方式連接在固相載體上，用以分離和純

化相應(yīng)的抗體或抗原的方法稱為免疫吸附法，固相化的抗原或抗體稱為免

疫吸附劑，按照載體的性質(zhì)不同，配基和載體的連接方式大體可分為三種

類型。

1、使配基吸附在某些載體的表面。常用的載體有皂土、玻璃粉（或微

球）、石英粉、羥基磷灰石、氧化鋁、硬脂酸鋼等。其優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，條

件溫順。其缺點(diǎn)：吸附不穩(wěn)固而阻礙被分離物質(zhì)的純度。

2、使配基網(wǎng)絡(luò)在某些載體化合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。常用的載體有聚丙烯

酰胺凝膠、淀粉凝膠、交聯(lián)葡聚糖凝膠等。此方法使用的條件也專門溫順;

只要凝膠的交聯(lián)度和配基分子大小選配合適，就可得到成效專門好的免疫

吸附劑。

3、使配基通過共價(jià)鍵和載體結(jié)合。常用的載體有瓊脂糖、纖維素交聯(lián)

葡聚糖、聚丙烯酰胺及多孔玻璃等，此種方法適用于大分子化合物及小分

子化合物。由于與載體化學(xué)的結(jié)合，因此增強(qiáng)了配基對pH、離子強(qiáng)度及溫

度耐受力。它也是目前親和層析方法中最廣泛采納的一種類型。

4、使用偶聯(lián)劑直截了當(dāng)把配基的許多分子彼此連接起來。如此的偶聯(lián)

劑有戊二醛、氯甲酸乙酯，乙基丁烯二酸酎，環(huán)已基碳二亞胺等。但如果

條件把握不行，專門易引起生物大分子的失活。

第四、親和層析條件的選擇

1、吸附：生物大分子的親和純化最好采納柱層析法。親和柱所用的平

穩(wěn)緩沖液其組成、pH和離子強(qiáng)度都應(yīng)選擇配基與生物大分子之間的作用最

強(qiáng)、最有利于形成復(fù)合物的條件。上柱的樣品應(yīng)該溶于親和柱的平穩(wěn)緩沖

液中，并在上柱前對緩沖液透析平穩(wěn)。

2、洗滌：樣品通過親和柱后，連續(xù)用大量緩沖液洗去無親和力的生物

大分子，且還常用不同的緩沖液洗滌，如此可進(jìn)一步除去非專一吸附的物

質(zhì)，而在親和柱上只留下有專一作用的親和物。

3、洗脫：洗脫正好與吸附相反，所選取的條件應(yīng)該能減弱純化對象與

吸附柱之間的相互作用，使得復(fù)合物完全解離。通過改變緩沖液的條件，

如改變pH、離子強(qiáng)度、有機(jī)溶劑的濃度等，有選擇性地從載體上把被分離

物洗脫下來。

4、親和柱的再生：當(dāng)洗脫終止后，連續(xù)用大量洗脫劑完全洗滌親和柱,

然后再用平穩(wěn)緩沖液使親和柱充分平穩(wěn)，通過如此處理，親和柱可反復(fù)使

用。

下面各表列出一些親和層析介質(zhì)的技術(shù)數(shù)據(jù)，供讀者參閱。

（表14）

張龍翔P503—507（十三）親和層析介質(zhì)的技術(shù)數(shù)據(jù)1一6。

綜上所述，五種層析技術(shù)在分離各種化合物時(shí)各有其優(yōu)越之處，也有

不足之處。因此，應(yīng)按照具體分離化合物的種類及要求，選擇不同的層析

方法及層析介質(zhì)，以達(dá)到迅速、準(zhǔn)確地分離目的。

現(xiàn)就如何選擇層析介質(zhì)，列表如下，供讀者參閱。

（表15）

張龍翔P497（七）如何選擇層析介質(zhì)。

P498按純化步驟選擇層析介質(zhì)。

（表16）

二、比色和分光分析法（孔德娟）

（-）原理

光線的本質(zhì)是電磁波的一種，有與電磁波和X線類同的性質(zhì)。光線有

不同的波長，肉眼可見彩色光稱為可見光，波長范疇在400?750nm,小于4

OOnm的光線稱為紫外線，大于750nm的光線稱為紅外線，如表所示。

（表17）見書P19

當(dāng)光線通過透亮溶液介質(zhì)時(shí)，其輻射能量

一部分被吸取，一部分被透過，因此光線射出溶液

介質(zhì)之后，光能減少。例如，可見光通過有色溶液

介質(zhì)后，或紅外線通過多種氣體后均被吸取部分光

能。這種光能的吸取和透過可用于某些物質(zhì)的定量分析。

分光分析所依據(jù)的定律是Lambert和Beer定律

Lambert式定律：一束單色光通過透亮溶液介質(zhì)時(shí)，光能被吸取一部分,

被吸取光能的量與溶液介質(zhì)厚度有一定比例關(guān)系。見圖6-0-8

-adl將此式積分得:

I=IOeal⑴式

式中10為入射光強(qiáng)度

I為通過溶液介質(zhì)后的光強(qiáng)度

1為溶液介質(zhì)的厚度

e為自然對數(shù)的底2.718

a為溶液介質(zhì)的吸取系數(shù)

（1）式可改寫為：

10

Ln——=al(2)式

（2）式換算成常用對數(shù)式，即：10

Ln—X0.4343=0.4343Xal

10g—=0.4343Xal

I

10

則10g一=kl(3)式

I

式中K為吸光系數(shù)。

2.Beer定律：以溶液中溶質(zhì)濃度的變化代替溶液厚度的改變，光能

的吸取與濃度改變有類同的關(guān)系。即一束單色光通過溶液介質(zhì)時(shí)，光波被

溶液介質(zhì)吸取一部分，吸取多少與溶液中溶液介質(zhì)濃度有一定比例關(guān)系。

依據(jù)Lambert氏定律中同樣的推導(dǎo)，可得出下式：

10

10g一=k

c(4)式

I

式中c為溶液介質(zhì)的濃度。

Lambert定律與Beer定律合并，即(3)和(4)式合并為：

10

10g一=kc

1⑸式

I

1010

令A(yù)=10g—T=-

I,I

則A=kcl(6)式

A=-10T

式中A為光密度（又稱吸光度），T為透光度。

（6）式為Lambert-Beer定律的物理表示式，其含義為：一束單色光通

過溶液后，光能被吸取一部分，吸取多少與溶液的濃度和厚度成正比。

（二）光電比色法

利用溶液的顏色深淺來測定溶液中物質(zhì)含量的方法，稱為比色法。

用光電池和檢流計(jì)代替眼睛進(jìn)行比色分析，又稱光電比色法。光電比色法

測定的條件是在可見光范疇，并要求測定為有色物，或通過一定的化學(xué)處

理使無色的測定物質(zhì)變成有色化合物或者使其所處的溶液變成有色液，與

經(jīng)同樣處理的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液在光電比色計(jì)上進(jìn)行比色，求出各自的光

密度（吸光度），經(jīng)運(yùn)算即可求出被測物的含量。

比色分析較常見的儀器為光電比色計(jì)和分光光度計(jì)。

（三）分光光度法

采納適當(dāng)?shù)墓庠础⒗忡R和適當(dāng)?shù)墓庠赐馄?。可使介質(zhì)濃度測定范疇

不僅僅局限于可見光，尚可擴(kuò)大到紫外光區(qū)和紅外光區(qū)。經(jīng)單色器（棱鏡）

得到的光源雖講不是純的單色光，但波長范疇更狹窄，也更符合Lambert-

Beer定律，使靈敏度大為提升。

以不同波長的單色光作為入射光，測定某一介質(zhì)溶液的光密度。

然后以入射光的不同波長為橫軸，各相應(yīng)的光密度為縱軸作圖，可得到溶

液介質(zhì)的吸取光譜曲線。不同的物質(zhì)，分子結(jié)構(gòu)不同，其吸取曲線也有其

專門形狀，許多動(dòng)、植物組織中所含組分用化學(xué)方法不易分離，，此組分可

借助于分光光度法測定出不同的光譜曲線，用于確定幾種組分的性質(zhì)和含

量，此法的優(yōu)點(diǎn)是光電比色法不可比擬的。由于分光光度計(jì)波長范疇較大

（200-1000nm），故既可用于可見光，也可用于紫外光或紅外光的分光測

定。又由于分光光度法可利用物質(zhì)特有的吸光譜曲線進(jìn)行定性定量，因此,

測定物質(zhì)既可為有色物，也但是無色物，從而使測定手續(xù)簡化，標(biāo)本用量

也可減少。

目前，學(xué)生實(shí)驗(yàn)室多用722型或UV-9100型分光光度計(jì)，其差不

多結(jié)構(gòu)如圖所示：

7.反射鏡8.光欄9.聚光透鏡10.比色杯11.光門

12.保護(hù)玻璃13.光電管

（圖6-0-9）

圖9722型分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)示意圖

此儀器的最大特點(diǎn)為受光器不是光電池,而是光電管。光電管的陰極表

面（光電面）有一層對光靈敏的物質(zhì)，當(dāng)光射到光電管后，會(huì)發(fā)射出光電

子，此光電子向陽極移動(dòng)，形成光電流。光電管靈敏度雖比光電池小，但

經(jīng)光電管出來的光電流能夠放大，而經(jīng)光電池出來的光電流不易放大，同

時(shí)刻電池易疲乏，故較高級(jí)的分光光度計(jì)均采納光電管作為出射光線受光

器。

722型分光光度計(jì)的使用方法：接通電源，打開比色箱蓋，使檢流計(jì)指

針處于“0”位，預(yù)熱10分鐘，用波長調(diào)劑器選用所需的波長。

將空白或?qū)Ρ纫杭皽y定液分別裝入比色杯內(nèi)，擦干后置于比色盒中，

再放入比色箱內(nèi)，放妥蓋好。現(xiàn)在空白溶液對在光路上，光電管感光。旋

轉(zhuǎn)光量調(diào)劑器，使檢流計(jì)指針正確地指在透光度“100%”或光密度”0”±o

輕輕拉動(dòng)比色槽滑桿，使其他比色杯依次處于光路上，同時(shí)刻密度。

使用時(shí)可按照不同波長、光量分別選用放大器靈敏度擋，使空白液能

專門好地用光量調(diào)劑器使光密度調(diào)整到“0”。其靈敏度范疇是第一擋義1

倍，第二擋X10倍，第三擋X20倍。

（四）運(yùn)算

1.利用標(biāo)準(zhǔn)管運(yùn)算被測物含量：用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)物與測定管同樣處

理，讀取光密度，再按照（6）式運(yùn)算：

Al=klclll

A2=k2c212

式中Al、A2分別為已知濃度標(biāo)準(zhǔn)管和未知濃度測定管光密度。

Cl、c2分別為已知濃度標(biāo)準(zhǔn)管和未知濃度測定管測定物濃度。

因盛標(biāo)準(zhǔn)液和測定液的比色皿內(nèi)徑相同（11=12）,故上二式可寫成：

Al/klcl=A2/k2c2

因標(biāo)準(zhǔn)液和測定液中介質(zhì)為同一物，故k相同，即：Kl=k2

2.利用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算：先配制一系列已知不同濃度的測定物溶液,

按測定管同樣方法處理顯色，分別讀取各管光密度，以各管光密度為縱軸,

各管濃度為橫軸，在方格坐標(biāo)紙上作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。以后進(jìn)行測定時(shí)，就

無需再作標(biāo)準(zhǔn)管，以測定管光密度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可求得測定物的濃度。

一樣認(rèn)為，標(biāo)準(zhǔn)曲線范疇在測定物濃度的1/2到2倍之間，并使光密度

在0.05?1.0范疇內(nèi)為宜，所作標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供短期使用。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與測

定管測定應(yīng)在同一臺(tái)儀器上進(jìn)行，盡管型號(hào)相同，操作條件完全一樣，因

不同一臺(tái)儀器，其結(jié)果會(huì)有一定誤差。

3.利用克分子吸光系數(shù)￡求取測定物濃度：（6）式中k為吸光系數(shù)，

當(dāng)濃度c為mol/L,溶液厚度1為1cm時(shí)，k稱為克分子吸光系數(shù)，以￡

表示，現(xiàn)在e與A相等。實(shí)際應(yīng)用中測定物常以g/ml作濃度單位。

已知￡情形下，讀取測定液厚度為1cm時(shí)的光密度，按照下式可求出

測定的物質(zhì)濃度。

C=A/￡

此運(yùn)算式常用于紫外吸取法，如蛋白質(zhì)溶液含量測定，因蛋白質(zhì)在波

長280nm下具有最大吸取峰，利用已知蛋白質(zhì)在波長280mm時(shí)的克分子吸

光系數(shù)，再讀取待測蛋白溶液的光密度，即可算出待測蛋白質(zhì)的濃度。無

需顯色，操作簡便。

二種以上待測物的混合液未被單