第八章酶免疫技術

第八章酶免疫技術第一頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四第一節(jié)酶免疫技術的原理第二節(jié)酶免疫技術的分類第三節(jié)酶聯免疫吸附試驗第四節(jié)固相酶免疫測定的技術要點第五節(jié)酶免疫組織化學技術第六節(jié)其他酶免疫技術第七節(jié)酶免疫測定的應用第八章酶免疫技術第二頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四

第一節(jié)酶免疫技術的原理

第三頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四主要試劑:

酶標記的抗體或抗原酶標物特點：

免疫學活性酶對底物的催化活性抗原抗體反應的特異性+酶促催化反應的高敏感性原理及特點第四頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四特點：靈敏度高、特異性強、準確性好酶標記試劑能夠較長時間保持穩(wěn)定操作簡便、對環(huán)境沒有污染。易與其它技術偶聯衍生出適用范圍更廣的新方法。原理：酶標抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應酶對底物的顯色反應對抗原或抗體進行定位、定性或定量的測定分析

原理及特點第五頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四

第二節(jié)酶免疫技術分類

第六頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四酶免疫技術酶免疫組化酶免疫測定均相異相固相酶免疫測定液相酶免疫測定組織切片中的抗原抗體反應

液體標本中抗原或抗體的定性和定量(ELISA)第七頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定

酶標記物與相應的抗原或抗體結合后，標記酶的活性會發(fā)生改變，不用分離結合和游離酶標記物，通過測定標記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。Ag+Ab-E

Ag-Ab-E+?原理一、均相酶免疫測定第八頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四最具代表性的兩種技術酶放大免疫測定技術EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

克隆酶供體免疫分析

CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay

均相酶免疫測定第九頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四EMIT示意圖第十頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四CEDIA示意圖第十一頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四分類：液相酶免疫測定固相酶免疫測定以聚苯乙烯等材料作為固相載體的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是目前最為常用的固相酶免疫測定與均相不同之處需分離游離與結合的酶標記物二、異相酶免疫測定第十二頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四

第三節(jié)酶聯免疫吸附試驗

第十三頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四三個部分：免疫反應酶與底物反應檢測方法的建立ELISA酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）高純度的抗原、高親和力的抗體高活性、高純度的標記用酶有效的交聯方法制備高質量的酶標記物選用適宜的酶/底物系統(tǒng)分離結合與游離標記物的方法建立操作步驟以及研究自動化測定技術第十四頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四底物顯色定性或定量的分析原理包被反應加入待測抗體或抗原和酶標抗原或抗體洗滌使結合在固相上的抗原抗體復合物與未結合的分離1234一、基本原理第十五頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四固相的抗原或抗體

酶標記物

酶反應的底物

三個必要試劑

二、方法類型及反應原理第十六頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四雙抗體夾心法（doubleantibodysandwich-ELISA）方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標抗體，加底物顯色應用：

二價或二價以上的較大分子抗原測定(乙型肝炎表面抗原HBsAg),不能用于半抗原等小分子的測定。ELISA檢測抗原的方法第十七頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四第十八頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四1、已知抗體包被于載體表面3、加酶標抗體與抗原結合4、加酶作用的底物產生顏色2、加待檢物抗原與抗體結合4、加酶作用的底物不產生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原1、已知抗體包被于載體表面2、加待檢物無抗原與抗體結合3、加酶標抗體無抗原結合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY第十九頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四ELISA檢測抗體的方法捕獲法原理：抗人IgMμ鏈抗體包被捕獲待測標本中IgM類抗體加入特異性抗原和酶標記特異性抗原的抗體底物顯色

應用：病原體急性感染診斷中的IgM型抗體

甲型肝炎HAV-IgM抗體

乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體第二十頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四洗滌洗滌洗滌洗滌捕獲法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人IgM2、加待測物特異性IgM與非特異性IgM和抗人IgM結合3、加特異性抗原，與特異性抗體結合4、加酶標抗體與特異性抗原結合，加底物顯色2、加待測物只有非特異性IgM和抗人IgM結合3、加特異性抗原，不能與非特異性IgM結合4、加酶標抗體無抗原結合，加底物不顯色第二十一頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四第四節(jié)固相酶免疫測定的技術要點

試劑的準備反應條件的選擇操作的標準化第二十二頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四一、試劑的準備（一）固相載體聚苯乙烯特點：吸附蛋白能力強，保留其免疫活性形狀：小試管、小珠、微量ELISA板使用前檢測其性能（二）抗原和抗體高純度的Ag高效價的Ab第二十三頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四一、試劑的準備（三）酶和底物的選擇標記酶的要求：

活性高性質穩(wěn)定專一性強酶催化底物的顯色信號易于判斷和測量方法敏感，重復性好，簡單易行酶的底物易于配制保存，酶及底物價廉第二十四頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四辣根過氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關輔基是酶的活性中心RZ值：403nm（輔基）與275nm（主酶）OD值之比RZ值與酶活性無關，酶活性單位比RZ值更為重要ELISA中應用最為廣泛的標記用酶常用酶第二十五頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四HRP的底物

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP供氫體DH2習慣上被稱為底物，底物有多種

H2O2為受氫體，HRP對受氫體的專一性很高（小分子醇和尿素的過氧化物）

常用底物第二十六頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四HRP的常見底物

鄰苯二胺OPD四甲基聯苯胺TMB5-氨基水楊酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽ABTS常用底物第二十七頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四OPD反應后顯橙黃色，加酸終止反應后呈棕黃色，測定波長492nm。不穩(wěn)定，致癌性。TMB反應后顯藍色，加酸終止反應后變?yōu)辄S色,測定波長450nm，穩(wěn)定，無致癌性，ELISA中應用最廣泛的底物。

HRP的常見底物

第二十八頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四堿性磷酸酶（ALP）

菌源性ALP腸粘膜ALP(小牛)

β–半乳糖苷酶（β-Gal）

常用酶大腸埃希氏菌

第二十九頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四ALP的底物

β-Gal的底物

對-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）經ALP作用后的產物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。

酶作用后，生成高強度熒光物，用熒光計測量。常用底物第三十頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四二、酶標記抗體或抗原的方法酶免疫技術的核心組成部分

酶結合物（conjugate）酶標記物通過化學反應或免疫學反應，讓酶與抗體或抗原形成的結合物

第三十一頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四抗原要求純度高，抗原性完整抗體需要特異性好、效價高、親合力強以及比活性較高，能批量生產，易純化。

制備方法要求第三十二頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四制備方法過碘酸鈉法（直接法）常用于HRP標記抗體或抗原

戊二醛交聯法第三十三頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四戊二醛交聯法戊二醛分子中有兩個相同的醛基，可分別與HRP和蛋白質分子中的氨基結合。該法有一步法和二步法。二步法標記效率比一步法高，酶標記物質量較均一。

第三十四頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四純化標記完成后應除去反應液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，避免游離酶增加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競爭作用而降低特異性染色強度

常用的純化方法：葡聚糖凝膠（Sephadex）G-200/G-150過柱層析純化50%飽和硫酸銨沉淀提純親和層析效果更好（SPA-IgG;ConA-HRP）二、酶標記物的純化和鑒定第三十五頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四鑒定質量鑒定（ELISA法直接測定）HRP標記IgG的酶標記率（戊二醛法）酶結合量（mg/ml）IgG量（mg/ml）HRP/IgG摩爾比酶的標記率第三十六頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四四、最適工作濃度的選擇(棋盤法)10++1:10001.1710+1:10000.1510-1:10000.091.0++1:1000>21.0+1:10000.261.0-1:10000.120.1++1:10000.420.1+1:10000.140.1-1:10000.1110++1:50000.4610+1:50000.0310-1:500001.0++1:50000.91.0+1:50000.121.0-1:50000.010.1++1:50000.120.1+1:50000.040.1-1:50000.0210++1:100000.1210+1:100000101:1000001.0++1:100000.221.0+1:100000.011.0-1:1000000.1++1:100000.030.1+1:1000000.1-1:100000第三十七頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四五、測定方法的標準化包被加樣洗滌孵育結果判定第三十八頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四第三十九頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四第四十頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四理想coating：吸附盡可能多的Ag或Ab；吸附牢固；非特異性吸附較少包被機制1、物理性吸附（被動的）2、共價交聯（戊二醛，標準化）影響包被的因素1、包被物質的性質及其濃度2、包被緩沖溶液的pH及離子強度3、包被溫度和時間第四十一頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四包被物質的性質及其濃度

聚苯乙烯吸附抗原效果好聚乙烯吸附抗體效果好濃度過高引起前帶現象濃度過低引起非特異性吸附(BSA封閉)包被緩沖溶液的pH及離子強度

相對低的離子強度有利于蛋白質分子吸附固相表面包被溫度和時間

置4℃冰箱過夜，或37℃孵育2h第四十二頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四加樣加樣量準確加樣位置不產生氣泡第四十三頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四洗滌

目的1、洗去未結合的物質2、洗去非特異性吸附要求1、每孔充滿液體2、去凈洗滌液（Tween20）3、沖洗次數和浸泡時間足夠4、具有傳染性樣品必須采用全自動沖洗第四十四頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四孵育

定義：要使抗原抗體反應和酶催化反應順利進行，需要合適的pH和適當離子強度的基質液，保持一定的溫度，并作用一定時間，整個過程稱為孵育或溫育。

方法：干式濕氏推薦溫度：37℃

增強作用:聚乙二醇

反應時間:以陽性標本的吸光度值達到1.0時為反應終點第四十五頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四結果判定1、吸光度法（A）2、比例法(A/A0)3、滴度法（倍比稀釋樣品）4、吸光度直接表示陽性的程度（均一化）5、標準曲線法第四十六頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四第四十七頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四

第五節(jié)酶免疫組織化學技術

第四十八頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四酶免疫組織化學技術(enzymeimmunohistochemistrytechnique)定義

在一定條件下，應用酶標抗體或抗原與細胞或普通組織切片中抗原或抗體反應，酶與底物作用形成有色沉淀物或產物電子密度發(fā)生改變，在光鏡和電鏡下，就可識別出標本中抗原或抗體的分布和性質；經圖像分析也可達到定量的目的。種類

1、標記抗體免疫組織化學技術2、非標記抗體酶免疫組織化學技術3、酶標記免疫電鏡技術第四十九頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四1、標記抗體免疫組織化學技術第五十頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四第五十一頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四

第六節(jié)其他酶免疫技術

第五十二頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四免疫印記法（immunoblottingtest）其他酶免疫技術第五十三頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四生物素-親和素（BSA）-酶聯免疫吸附試驗生物素（biotin）-親和素（avidin）親和素與生物素之間的親和力極強，比抗原與抗體的親和力至少高1萬倍，且具有高度特異性和穩(wěn)定性。其他酶免疫技術第五十四頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四

第七節(jié)酶免疫測定的應用

第五十五頁，共六十頁，編輯于2023年，星期四EL