放射性配體與受體結合分析實驗方法演示文稿

放射性配體與受體結合分析實驗方法演示文稿本文檔共62頁；當前第1頁；編輯于星期六\6點34分優(yōu)選放射性配體與受體結合分析實驗方法本文檔共62頁；當前第2頁；編輯于星期六\6點34分實驗定義與原理定義放射性配基與受體結合分析簡稱為受體放射分析（radioassayofreceptors），它是應用放射性核素標記配基與特異受體相結合，研究受體的親和力和受體的數(shù)量，以及研究受體亞型的常用方法。原理放射性標記配基（激動劑或拮抗劑）和組織、細胞，或含有受體的制劑一起溫育，使受體和配基充分結合，形成受體-配基復合物，終止反應后，用過濾或離心的方法除去未被結合的標記物，測定濾膜或沉淀物中的放射性，即可計算出和配基結合的受體的量。本文檔共62頁；當前第3頁；編輯于星期六\6點34分RBA的分類RBA用放射性核素來標記配基，與相應的受體進行特異性結合反應，可對受體的性質進行定性和定量的分析。

1、定性RBA：是通過反應的量效關系的變化來判斷受體的類型，單位點或多位點結合式，及受體與配體結合的特點，反應的可逆性、協(xié)作性等。

2、定量RBA：是在已知配體與受體反應性質的基礎上，通過結合反應，給出一定量的組織或細胞中能與該放射性配體結合的受體數(shù)及結合的平衡解離常數(shù)或結合位點數(shù)（最大結合容量）。

本文檔共62頁；當前第4頁；編輯于星期六\6點34分實驗材料與儀器本文檔共62頁；當前第5頁；編輯于星期六\6點34分實驗材料動物組織（皮層、海馬、紋狀體等）儀器（組織勻漿機、旋渦混合器、低溫高速離心機、電熱恒溫水溫箱、-80℃冰箱、制冰機、抽慮瓶、液閃儀等）材料（2ml/6ml分離管、10ul/200ul/1ml槍頭、微纖維濾紙等）藥品（放射性配基、各種非標計化合物等）本文檔共62頁；當前第6頁；編輯于星期六\6點34分實驗儀器組織勻漿機IKA，T10BS25漩渦混合器WH-2本文檔共62頁；當前第7頁；編輯于星期六\6點34分低溫高速離心機凱達，TGL20M超低溫冰箱海爾本文檔共62頁；當前第8頁；編輯于星期六\6點34分數(shù)顯恒溫水浴鍋金燕，HH-S26S制冰機GELIN型號IMS-50automaticiceflakes本文檔共62頁；當前第9頁；編輯于星期六\6點34分電熱恒溫水溫箱循環(huán)水式多用真空泵液閃測定計數(shù)儀HIDEX，425-034型本文檔共62頁；當前第10頁；編輯于星期六\6點34分實驗材料2ml離心管6ml一次性軟試管本文檔共62頁；當前第11頁；編輯于星期六\6點34分槍頭1ml10ul200ul本文檔共62頁；當前第12頁；編輯于星期六\6點34分TrisPPO與POPOP本文檔共62頁；當前第13頁；編輯于星期六\6點34分過濾裝置砂芯過濾裝置（抽濾瓶）1000mlWhatmanGF/C玻璃微纖維濾紙40mm本文檔共62頁；當前第14頁；編輯于星期六\6點34分放射性化合物放射性配體低溫保存本文檔共62頁；當前第15頁；編輯于星期六\6點34分實驗方法流程本文檔共62頁；當前第16頁；編輯于星期六\6點34分實驗方法流程1、制備受體樣品；2、加樣、溫育進行結合反應；3、終止反應，分離結合物與游離物4、測定結合物的放射性；5、數(shù)據(jù)處理。本文檔共62頁；當前第17頁；編輯于星期六\6點34分實驗具體操作（D1、D2、5-HT）1、配制各種緩沖液及試劑按處方配比配制各種緩沖液貯備液配制各種非標記配體溶液配制各種受試藥物溶液注意：該項操作所需試劑或儀器儀器：分析天平、移液槍、燒杯、量筒、容量瓶、試管、EP管等試劑：無水乙醇、超純水、Tris、抗血酸、優(yōu)降寧、HCl、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、DMSO、甲苯、PPO、POPOP、Methysergide、Butaclamol及5HT等本文檔共62頁；當前第18頁；編輯于星期六\6點34分2、制備膜受體大鼠斷頭取腦分離出目標組織加10倍體積（V/W）冰冷的緩沖液用組織勻漿機勻漿3次，每次數(shù)秒鐘，制成組織勻漿液組織勻漿液用低溫高超離心機離心（12000轉/分）3次，每次20分鐘棄上清液，沉淀（膜受體）放-80度超低溫冰箱保存?zhèn)溆米⒁猓涸擁棽僮魉柙噭┗騼x器儀器：手術器械、組織勻漿機、制冰機、超低溫冰箱、低溫高超離心機試劑：超純水本文檔共62頁；當前第19頁；編輯于星期六\6點34分3、加樣

取出膜受體，加入一定體積的冰冷的緩沖液，混勻，使成一定濃度的膜受體溶液。取放射性配體母液，用無水乙醇稀釋成實驗所需濃度

按以下順序及比例加入各種反應液。（1）總結合管：100ul膜受體+200ul緩沖液+10ul放射性配體（2）非特異管：100ul膜受體+100ul緩沖液+100ul非標記配體+10ul放射性配體（3）受試物管：100ul膜受體+100ul緩沖液+100ul藥物溶液+10ul放射性配體注意：該項操作所需試劑或儀器儀器：移液槍、燒杯、量筒、EP管等試劑：超純水、無水乙醇、放射性配體母液

本文檔共62頁；當前第20頁；編輯于星期六\6點34分4、受體配體結合反應

以上各管在加完放射性配體后，立即放入37度的水浴鍋中，孵育20分鐘。20分鐘后把各管放入冰中終止反應。注意：該項操作所需試劑或儀器儀器：恒溫水浴鍋，制冰機試劑：無本文檔共62頁；當前第21頁；編輯于星期六\6點34分5、分離游離及結合的放射性配體上述各管在反應結束后，分別倒入抽濾裝置進行過濾，并用5-10ml冰冷的緩沖液沖洗濾膜2次。濾膜放入85度烘箱中烘干，隨后放入測試管中，關加入一定體積的閃爍液，浸泡過夜。注意：該項操作所需試劑或儀器儀器：抽濾器、烘箱、濾紙、移液槍、液閃杯試劑：甲苯、PPO、POPOP本文檔共62頁；當前第22頁；編輯于星期六\6點34分6、測定結合型放射配體每分鐘放射計數(shù)采用放射性計數(shù)儀，測定各測試管中結合型放射配體每分鐘放射計數(shù)注意：該項操作所需試劑或儀器儀器：液閃儀試劑：無本文檔共62頁；當前第23頁；編輯于星期六\6點34分7、數(shù)據(jù)處理按以下公式計算各化合物對同位素配基結合的抑制率百分率：抑制率(I%)=（總結合管cpm—化合物cpm）/

（總結合管cpm—非特異結合管cpm）×100%化合物每次實驗做兩復管，進行兩次單獨實驗。本文檔共62頁；當前第24頁；編輯于星期六\6點34分8、各種指標IC50：半數(shù)抑制濃度KD：平衡解離常數(shù)（mol/L），物理意義為受體有一半結合配基時所需要的配基濃度。Bmax：受體最大結合容量（fmol/mg蛋白質）nH：Hill系數(shù)本文檔共62頁；當前第25頁；編輯于星期六\6點34分Scatchard方程與作圖

（飽和實驗）本文檔共62頁；當前第26頁；編輯于星期六\6點34分Scatchard方程與作圖簡單單位點系統(tǒng)受體和配體結合反應（Clark模型）條件：（1）配基與受體結合反應為可逆雙分子反應；（2）所有受體都是等效和獨立的，同一受體的不同分子對配基的親和力都相等，而且不受鄰近受體分子結合配基與否的影響；（3）配體本身不代謝，也不與其它位置結合；（4）生物效應的強度與濃度近似于總配基濃度。本文檔共62頁；當前第27頁；編輯于星期六\6點34分飽和曲線固定的受體數(shù)量，固定數(shù)量的非標和不同濃度體積的放射性配體本文檔共62頁；當前第28頁；編輯于星期六\6點34分

飽和曲線(saturationcurve)1）飽和曲線

受體數(shù)量一定，當配體（一般是不同濃度體積的放射性配體與固定數(shù)量的非標）的濃度從零開始上升時，形成的復合物也逐漸增多。但由于受體數(shù)量有限，又是可逆反應，因此[RL]（受體配體復合物）的增加不是直線上升，而是一條上升先快后慢的曲線，最后絕大部分受體與配體結合時，[RL]的增加就非常緩慢，漸趨水平，即受體已經(jīng)飽和了，此即飽和曲線。#飽和曲線的作用？Scatchard作圖，求得KD與Bmax本文檔共62頁；當前第29頁；編輯于星期六\6點34分2）曲線的高度取決于[RT]。在曲線起始段，曲線上升的快慢即曲線的斜率取決于配基與受體的親和力，所以，KD越小(親和力越大)，飽和曲線上升越快，KD越大(親和力越小)，飽和曲線上升越慢。（即：親和力越大，受體與配件結合速度越快，時間越短）

k1,v1[R]+[L]－－－－[RL]k2,v2KD＝K2/K1=[R][L]/[RL]本文檔共62頁；當前第30頁；編輯于星期六\6點34分

飽和曲線的形狀和KD有關（如圖1）。圖1KD對飽和曲線的影響

本文檔共62頁；當前第31頁；編輯于星期六\6點34分飽和曲線曲線的高度取決于[RT]（如圖2）。

圖2[RT]對飽和曲線影響本文檔共62頁；當前第32頁；編輯于星期六\6點34分

質量作用定律(Massactionlaw)：受體和配基的結合反應服從可逆反應的質量作用定律，可用下式表示:

k1,v1[R]+[L]－－－－[RL]（1）

k2,v2

上式中，[R]和[L]為游離受體和游離配基的濃度，[RL]為復合物濃度，v1和v2為結合速率和解離速率，k1和k2為結合速率常數(shù)(associationrateconstant)和解離速率常數(shù)(dissociationrateconstant)。

數(shù)學表達本文檔共62頁；當前第33頁；編輯于星期六\6點34分根據(jù)質量作用定律：

v1

=k1[R][L]；v2=k2

[RL]當反應達到平衡后，v1=v2,即:k1[R][L]=k2[RL],則平衡解離常數(shù)（KD）的數(shù)學表達式為：

KD＝K2/K1=[R][L]/[RL]（2）

本文檔共62頁；當前第34頁；編輯于星期六\6點34分Scatchard作圖

設[LT]為配體的初始濃度，[RT]為受體的初始濃度（即受體總量），則有：

[L]=[LT]–[RL][R]=[RT]–[RL]由式（2）整理可得：

KD＝[RT-RL][L][RL]

將上式整理可得：

[RL]=[RT]

－1_×[RL]（Scatchard方程）

[L]KDKD變形：[RL]為受體與配基特異結合的量，換成[B]表示，[L]為自由配基的量，換成[F]表示，[RT]為受體總量，也即受體最大結合量，換成[Bmax]表示，則上式方程變?yōu)?/p>

B/F=Bmax/KD-B/KD（[RT]為受體總量，等于[R]和[RL]之和，也是最大結合量Bmax）以復合物濃度[RL]為橫坐標，以復合物濃度和游離配體的濃度比值[RL]/[L]為縱坐標作圖，即為Scatchard作圖。本文檔共62頁；當前第35頁；編輯于星期六\6點34分圖3簡單單位點系統(tǒng)RBA的Scatchard作圖簡單單位點系統(tǒng)Scatchard作圖為一條直線，斜率為-（1/KD），橫軸截距為[RT]，縱軸截距為[RT]/KD（見圖3）。由此求得KD與Bmax本文檔共62頁；當前第36頁；編輯于星期六\6點34分Hill方程與作圖當一個受體分子可以結合一個以上的配基時，配基受體結合反應不是簡單的雙分子反應，而是

k1,v1[R]+n[L]－－－－n[RL]，根據(jù)質量作用定律推導出Hill方程：

k2,v2經(jīng)過變形得其中n為hill系數(shù)，以結合分數(shù)B/Bmax對游離配基[L]作圖，得Hill作圖（如右）。（3）本文檔共62頁；當前第37頁；編輯于星期六\6點34分將（3）式兩邊取對數(shù)

本文檔共62頁；當前第38頁；編輯于星期六\6點34分非特異性結合

(non-specificbinding，NSB)

NSB

在RBA系統(tǒng)中，放射性配體除與受體特異性結合外，還可與其他成分（如非特異蛋白、反應容器、分離材料等）結合。NSB的特點

親和力小而結合容量大，不易被飽和，隨反應系統(tǒng)內配體濃度增加而線性增大，而且這種結合與生物效應無關（見圖4）。本文檔共62頁；當前第39頁；編輯于星期六\6點34分圖4飽和曲線實驗中TB、SB和NSB的關系在RBA的數(shù)據(jù)處理時，測得的總結合的放射性(totalbinding，TB)，必須減去NSB，才能得到特異性結合(specificbinding，SB)的數(shù)據(jù)。本文檔共62頁；當前第40頁；編輯于星期六\6點34分競爭曲線固定的放射性配基濃度，一定量的受體和不同濃度的未標記化合物本文檔共62頁；當前第41頁；編輯于星期六\6點34分數(shù)學表達此實驗用于測定非標計藥物與放射性配基競爭結合同一受體的能力。通常用IC50和Ki來表示。本文檔共62頁；當前第42頁；編輯于星期六\6點34分閃爍液包括溶劑、閃爍劑和添加劑溶劑：溶解閃爍劑和放射性樣品，吸收和傳遞射線能量。閃爍劑：第一閃爍劑（吸收受激溶劑能量，退激發(fā)光）、第二閃爍劑（波長轉移，匹配光電倍增管光譜；提高淬滅耐受）添加劑：助溶劑、抗淬滅劑本文檔共62頁；當前第43頁；編輯于星期六\6點34分各受體的非標與同位素受體非標放射性配基受體組織5-HT1A5-HT(serotonin)3H-8-OH-DPAT大鼠紋狀體/皮層5-HT2AMethysergide3H-Ketanserin大鼠紋狀體/皮層D2Butaclamol3H-Spiperone大鼠紋狀體α1Prazosin3H-prazosin大鼠皮層α2Rauwolscine3H-Rauwolscine大鼠皮層M阿托品3H-QNB（畢茲）大鼠腦去小腦/回腸β心得舒3H-DHA鴨紅細胞/大鼠腦本文檔共62頁；當前第44頁；編輯于星期六\6點34分RBA的安全問題本文檔共62頁；當前第45頁；編輯于星期六\6點34分β射線本文檔共62頁；當前第46頁；編輯于星期六\6點34分放射型物質發(fā)出的射線有三種：天然放射現(xiàn)象本文檔共62頁；當前第47頁；編輯于星期六\6點34分三種射線α射線β射線γ射線本文檔共62頁；當前第48頁；編輯于星期六\6點34分α射線根據(jù)射線的偏轉方向和磁場方向的關系可以確定，偏轉較小的一束由帶正電荷的粒子組成，我們把它叫做α射線，α射線由帶正電的α粒子組成.科學家們研究發(fā)現(xiàn)每個α粒子帶的正電荷是電子電荷的2倍，α粒子質量大約等于氦原子的質量.進一步研究表明α粒子就是氦原子核.由于α粒子的質量較大，所以α射線的穿透本領最小，我們用一張厚紙就能把它擋住.本文檔共62頁；當前第49頁；編輯于星期六\6點34分β射線與α射線偏轉方向相反的那束射線帶負電荷，我們把它叫做β射線.研究發(fā)現(xiàn)β射線由帶負電的粒子（β粒子）組成.進一步研究表明β粒子就是電子.

β射線的穿透本領較強，很容易穿透黑紙，還能穿透幾厘米厚的鋁板.本文檔共62頁；當前第50頁；編輯于星期六\6點34分γ射線

中間不發(fā)生偏轉的那束射線叫做γ射線，研究表明，γ射線的實質是一種波長極短的電磁波，它不帶電，是中性的.

γ射線的穿透本領極強，一般薄金屬板都擋不住它，它能穿透幾十厘米厚的水泥墻和幾厘米厚的鉛板.本文檔共62頁；當前第51頁；編輯于星期六\6點34分β射線在某種核反應中，一個中子變成一個電子和一個質子.這就是原子核內沒有電子，又會放出電子，這就是產(chǎn)生β射線的原因.β射線是一種帶負電荷的、高速運行、從核素放射性衰變中釋放出的粒子。人類受到來源于人造或自然界(氚，C－14等)β射線的照射，β射線比α射線更具有穿透力，但在穿過同樣距離，其引起的損傷更小。一些β射線能穿透皮膚，引起放射性傷害。但是它一旦進入體內引起的危害更大。β粒子能被體外衣服消減、阻擋或一張幾毫米厚的鋁箔完全阻擋。本文檔共62頁；當前第52頁；編輯于星期六\6點34分放射防護措施本文檔共62頁；當前第53頁；編輯于星期六\6點34分外照防護措施時間防護：盡量減少受照射時間。距離防護：距離越遠，輻射能量越低。屏蔽防護：α射線注意防止內照射；β射線可用鋁、有機玻璃、塑料等原子序數(shù)較低的物質；γ射線可用鉛、鐵、混凝土等高原子序數(shù)物質。本文檔共62頁；當前第54頁；編輯于星期六\6點34分內照射防護措施圍封隔離防擴散：“三區(qū)配置”法，即清潔區(qū)、中間區(qū)、活性區(qū)；通風良好、獨立的下水處理系統(tǒng)；遵守SOP。除污保潔防污染個人防護侵入：穿戴適當?shù)膫€人保護衣具，如工作服、口罩、鞋、帽等。不準在工作場所進食、吸煙。工作結束后進行衛(wèi)生清洗，并作污染檢測。本文檔共62頁；當前第55頁；編輯于星期六\6點34分放射性“三廢”處理基本方法：放置衰變、濃縮儲存、稀釋排放固體：一般用放置法（半衰期短）、焚化法（廢氣的處理）、埋藏法（不可燃/焚化殘渣）液體：一般用放置法（半衰期短）、稀釋法（量少濃度低）、濃集法（富集掩埋）氣體：大氣排放（低濃度/氣溶膠）、過濾器或液體吸收（高濃度）本文檔共62頁；當前第56頁；編輯于星期六\6點34分表面放射性污染的處理皮膚：輕度，大量清水和肥皂清洗；嚴重，10%EDTA或6.5%高錳酸鉀浸泡清洗工作場所表面：輕度，大量清水或洗滌劑清洗；嚴重，挖去再填充或覆蓋油漆/塑料板工作服：輕度，肥皂水；嚴重，0.02