第十一章 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)

第十一章動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)第一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五主要內(nèi)容實(shí)驗(yàn)室設(shè)置常用器具的清洗消毒方法動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用液第二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)置基本實(shí)驗(yàn)室：準(zhǔn)備室+接種室+培養(yǎng)室輔助實(shí)驗(yàn)室：細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室+生化分析室第三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五二、常用器具的清洗消毒方法1、清洗（1）玻璃器材：初次使用的玻璃器皿：洗滌劑/肥皂水洗滌1~5%HCl浸泡過夜蒸餾水洗2~3次使用過的玻璃器皿立即浸入水中待洗

一般玻璃儀器：肥皂水/洗滌劑洗滌蒸餾水洗滌2~3次

量器：鉻酸洗液浸泡4~6小時(shí)蒸餾水洗滌2~3次第四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五二、常用器具的清洗消毒方法1、清洗（2）橡膠器材初次使用：0.5mol/LNaOH15min0.5mol/LHCl15min自來水煮沸蒸餾水煮沸20min用過的橡膠制品：同玻璃器材的清洗第五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五二、常用器具的清洗消毒方法1、清洗（3）塑料器皿2%NaOH浸泡過夜2~5%HCl浸泡30min蒸餾水洗（4）金屬器皿洗衣粉洗滌蒸餾水洗酒精棉球擦拭晾干第六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五二、常用器具的清洗消毒方法2、消毒物理：熱力滅菌、電離輻射、紫外滅菌化學(xué)：重金屬鹽、氧化劑、表面活性劑生物：抗生素第七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用液培養(yǎng)基平衡鹽其他（雜用液）第八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基1、組成成分糖：葡萄糖無機(jī)離子與微量元素：如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩氨基酸：12種必需氨基酸，精氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸和纈氨酸。Ｌ型。第九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基1、組成成分：維生素：至少8種，生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素Ｂ12。促生長因子及激素：如胰島素（insulin），它能促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨基酸。第十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基2、pH：大多數(shù)細(xì)胞的適宜pH為7.2～7.4,一般不能超過6.8~7.6。造成培養(yǎng)基pH波動(dòng)的主要物質(zhì)是細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO2,在封閉式培養(yǎng)過程中CO2與水結(jié)合產(chǎn)生碳酸，培養(yǎng)基pH很快下降。第十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基2、pH：調(diào)節(jié)：使用NaHCO3-CO2緩沖系統(tǒng)（合成培養(yǎng)基中，或Hepes），再通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱中CO2

氣體的濃度（5%）,使之與培養(yǎng)基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài)。NaHCO3

＋H2O←→Na++HO-+H2O+CO2↑當(dāng)[CO2]能夠保持相對(duì)穩(wěn)定時(shí)，上述反應(yīng)就可達(dá)到平衡，[OH－]也相對(duì)恒定，即pH相對(duì)恒定。第十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基3、分類天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基第十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基（1）、天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基：主要指來自動(dòng)物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術(shù)建立的早期，體外培養(yǎng)細(xì)胞都是利用天然培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，滲透壓、pH等也與體內(nèi)環(huán)境相似，但制作過程復(fù)雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。目前仍然廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清（serum），另外組織提取液、促進(jìn)細(xì)胞貼壁的膠原類物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞時(shí)也不可缺少。第十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基（1）、天然培養(yǎng)基血清的種類：主要是牛血清，在培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞時(shí)也用人血清、馬血清等。牛血清還分為小牛血清、新生牛血清和胎牛血清。一般使用的為小牛血清，小牛血清取自出生10～30天的小牛。第十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基（1）、天然培養(yǎng)基血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：血清質(zhì)量的鑒定一般包括理化性質(zhì)：如滲透壓、pH，球蛋白、血紅蛋白含量越低血清質(zhì)量越高。微生物檢測：包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等促生長效果檢測：克隆形成率測定法和連續(xù)傳代培養(yǎng)測定法。第十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基（1）、天然培養(yǎng)基血清的使用與儲(chǔ)存：大部分血清在使用之前必須經(jīng)過滅活處理，即56℃放置30分鐘。（滅活的目的是去除血清中的補(bǔ)體成分，避免補(bǔ)體對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用。滅活也會(huì)損失一些對(duì)細(xì)胞有利的成分如生長因子，因此也有人提出血清不經(jīng)滅活直接用于培養(yǎng)）儲(chǔ)存條件：血清一般儲(chǔ)存于-20℃，同時(shí)應(yīng)避免反復(fù)凍融?？蓽缁詈蠓盅b，使用時(shí)4℃融化。第十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基（1）、天然培養(yǎng)基血清使用的缺點(diǎn)：批次差異。鼠尾膠原：它的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的貼壁，特別是對(duì)上皮類細(xì)胞。組織浸出液：Hank’s浸30min

第十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基（2）、合成培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基無蛋白培養(yǎng)基第十九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基（2）、合成培養(yǎng)基①基本培養(yǎng)基：最初研制合成培養(yǎng)基，就希望使其完全替代天然培養(yǎng)基，但結(jié)果卻沒有象人們所預(yù)期的那樣，許多合成培養(yǎng)基都只能使體外培養(yǎng)細(xì)胞短暫生存，只有在添加了少量天然培養(yǎng)基（血清）之后，細(xì)胞才能在其中長期生長繁殖。

這類合成培養(yǎng)基稱為“基本培養(yǎng)基”或“通用培養(yǎng)基”，在添加了一定比例的血清之后，稱之為“完全培養(yǎng)基”。第二十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基（2）、合成培養(yǎng)基①基本培養(yǎng)基：常用基本培養(yǎng)基199培養(yǎng)基低限量基礎(chǔ)培養(yǎng)基（minimumessentialmedia,MEM）DMEM(Dulbecco’smodifiedEaglemedium)IMDM(Iscove’smodifiedDulbecco’smedium)：適合于細(xì)胞密度較低、生長較困難的情況RPMI1640第二十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基（2）、合成培養(yǎng)基②無血清培養(yǎng)基雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的完全培養(yǎng)基可以滿足大部分細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的要求，但對(duì)有些實(shí)驗(yàn)卻不適合，如觀察一種生長因子對(duì)某種細(xì)胞的作用，又如測定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長因子）的能力。無血清培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)液

+添加組分。第二十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基（2）、合成培養(yǎng)基②無血清培養(yǎng)基添加組分包括以下幾大類物質(zhì)：促貼壁物質(zhì)：一般是細(xì)胞外基質(zhì)，如纖連蛋白（FN）、層粘連蛋白(LN)等。

促生長因子及激素酶抑制劑：最常用的是大豆胰酶抑制劑。結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：常見的有轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白。微量元素：硒是最常見的第二十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基（3）、無蛋白培養(yǎng)基(proteinfreemedium，PFM)

不含動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基。添加了植物水解物以替代動(dòng)物激素、生長因子的作用。（4）、限定化學(xué)成分培養(yǎng)基(CDM)：是指培養(yǎng)基中的所有成分都是明確的，它不含有動(dòng)物蛋白，也不添加植物水解物，而是使用一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。第二十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（二）、平衡鹽溶液平衡鹽溶液：（balancedsaltsolution,BSS）主要由無機(jī)鹽、葡萄糖組成。作用：具有維持滲透壓，調(diào)控酸、堿平衡的作用提供細(xì)胞生存所需的能量和無機(jī)離子成分用于洗滌組織、細(xì)胞配制各種培養(yǎng)用液第二十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（二）、平衡鹽溶液幾種常用的平衡鹽溶液：RingerPBSTyrodeEarleHank’sD-Hank’sDulbecco第二十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（三）、其他培養(yǎng)用液1、消化液胰酶溶液（0.1%~0.5，pH8.0）膠原酶溶液（0.1～0.3mg／L或200U／mL，pH6.5）EDTA溶液（0.02%）上述溶液可混合使用第二十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（三）、其他培養(yǎng)用液2、pH調(diào)整液NaHCO3溶液（常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液）HEPES液（HEPES是一種弱酸，中文名稱是羥乙基哌嗪乙硫磺酸，使用的終濃度為0.01～0.05mol/L；可維持pH在7.0左右）。第二十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（三）、其他培養(yǎng)用液3、谷氨酰胺補(bǔ)充液谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重要作用，是合成培養(yǎng)基的重要成分。由于谷氨酰胺容易降解，所以都是在使用前添加。谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L。一般配制為100倍濃縮液，配制時(shí)應(yīng)加溫至30℃，完全溶解后過濾除菌，分裝至小瓶，儲(chǔ)存于-20℃。第二十九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（三）、其他培養(yǎng)用液4、抗生素液常用的是青鏈霉素，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要對(duì)革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對(duì)革蘭陰性菌有效。青霉素使用的終濃度為100000U/L，鏈霉素使用的終濃度為0.1g/L。一般配制成100倍濃縮液，可用PBS或培養(yǎng)基配制。第三十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五三、培養(yǎng)物的污染及防止按現(xiàn)代的觀念，凡是混入培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)該視為污染。根據(jù)這一概念，組織培養(yǎng)污染物應(yīng)包括生物（真菌、細(xì)菌、病毒和支原體）化學(xué)物質(zhì)（影響細(xì)胞生存、非細(xì)胞所需的化學(xué)成分）細(xì)胞（非同種的其他細(xì)胞）。其中以微生物最為多見。另外，隨著使用細(xì)胞種類增多，不同細(xì)胞交叉污染，尤其是Hela細(xì)胞的污染也時(shí)有發(fā)生，從而造成細(xì)胞不純。第三十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五三、培養(yǎng)物的污染及防止一、污染途徑1空氣：空氣是微生物及塵埃顆粒傳播的主要途徑。因此，培養(yǎng)設(shè)施不能設(shè)在通風(fēng)場所。無菌操作應(yīng)在凈化臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，工作時(shí)要帶口罩，以免因講話、咳嗽等使外界污染進(jìn)入操作面，造成污染。2器材：各種培養(yǎng)器皿、器械消毒不徹底和洗刷不干凈導(dǎo)致污染，另外需要對(duì)培養(yǎng)箱進(jìn)行定期消毒，防止形成污染3操作：實(shí)驗(yàn)操作無菌觀念不強(qiáng)，培養(yǎng)兩種細(xì)胞以上時(shí)，交叉使用吸管或培養(yǎng)液、瓶等有可能導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。

4血清：有些血清在生產(chǎn)時(shí)就已經(jīng)被支原體或病毒等污染，變成了污染。5組織樣本第三十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五三、培養(yǎng)物的污染及防止污染對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無法挽回。細(xì)胞污染早期或污染程度較輕時(shí)，如果能及時(shí)去除污染物，部分細(xì)胞有可能恢復(fù)。污染物持續(xù)存在培養(yǎng)環(huán)境中，輕者細(xì)胞生長緩慢，分類象減少，細(xì)胞變得粗糙，輪廓增強(qiáng)細(xì)胞漿出現(xiàn)顆粒；污染較嚴(yán)重，細(xì)胞增值停止，分裂象消失，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物，細(xì)胞變圓、脫壁。第三十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五三、培養(yǎng)物的污染及防止細(xì)菌污染對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響及污染物的檢測常見的污染細(xì)菌有大腸桿菌、假單孢菌、葡萄球菌等。細(xì)菌污染初期由于培養(yǎng)體系的抗生素作用，其繁殖處于抑制狀態(tài)，細(xì)胞生長不受明顯影響，污染情況用倒置顯微鏡觀察不易判斷。檢測：取10ml細(xì)胞懸液離心1000轉(zhuǎn)5分鐘，沉淀中加入無抗生素培養(yǎng)液2ml，將細(xì)胞放培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)污染細(xì)菌時(shí)，培養(yǎng)系統(tǒng)中產(chǎn)生大量細(xì)菌，幾個(gè)小時(shí)后，增殖的細(xì)菌就可以導(dǎo)致培養(yǎng)液外觀渾濁，肉眼就可以判斷。用相差顯微鏡觀察，可見滿視野都是點(diǎn)狀的細(xì)菌顆粒，原來的清晰培養(yǎng)背景變得模糊，大量的細(xì)菌甚至可以覆蓋細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的生存構(gòu)成威脅。用青霉素、鏈霉素可以預(yù)防細(xì)菌污染有效。第三十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五三、培養(yǎng)物的污染及防止真菌污染對(duì)細(xì)胞的影響及污染物的檢測微生物污染中以真菌最多，真菌污染后易于發(fā)現(xiàn)，大多呈白色或淺黃色小點(diǎn)漂浮于培養(yǎng)液表面，肉眼可見；有的散在生長，鏡下可見呈絲狀、管狀、樹枝狀，縱橫交錯(cuò)穿行于細(xì)胞之間。念珠菌和酵母菌卵圓形，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長。真菌生長迅速，能在短時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)胞生長、產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺死細(xì)胞?？拐婢苿?duì)預(yù)防和排除真菌污染有效。第三十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五三、培養(yǎng)物的污染及防止支原體污染對(duì)細(xì)胞影響及污染物的檢測

細(xì)胞培養(yǎng)（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染是個(gè)世界性問題，是細(xì)胞培養(yǎng)最常見的、干擾試驗(yàn)結(jié)果的一種污染。研究表明，95％以上是以下四種：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和萊氏無膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。國外調(diào)查證明，大約有二十多種支原體能污染細(xì)胞，有的細(xì)胞株可以同時(shí)污染兩種以上的支原體。支原體污染細(xì)胞后，常用方法有抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補(bǔ)體聯(lián)合處理。第三十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五三、培養(yǎng)物的污染及防止支原體污染對(duì)細(xì)胞影響及污染物的檢測支原體最突出的結(jié)構(gòu)特征是沒有細(xì)胞壁，一般來講，對(duì)作用于細(xì)胞壁生物合成的抗生素，如β-內(nèi)酰胺類、萬古霉素等完全不敏感；對(duì)多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對(duì)支原體最有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及一些氟喹諾酮。第三十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五三、培養(yǎng)物的污染及防止細(xì)胞交叉污染對(duì)細(xì)胞的影響及污染物的檢測細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞間交叉污染并不罕見，多是由于在培養(yǎng)中操作時(shí)各種細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行，混雜使用器皿和液體所致，這種污染能使細(xì)胞的生長特性、形態(tài)特征等發(fā)生變化。常用觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)、分析生長特性和核型、檢測細(xì)胞的標(biāo)記物等方法檢測交叉污染的細(xì)胞。第三十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五三、培養(yǎng)物的污染及防止污染的預(yù)防:1.器皿準(zhǔn)備中的預(yù)防：嚴(yán)格消毒，做