目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳

目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹攸c(diǎn)掌握表達(dá)載體構(gòu)建的原理及方法掌握目的基因原核誘導(dǎo)表達(dá)的原理及方法了解目的蛋白質(zhì)“標(biāo)簽”純化的基本原理和方法掌握PAGE變性凝膠電泳的原理及方法掌握考馬斯亮藍(lán)染色的方法目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳目的蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白質(zhì)的純化目的蛋白質(zhì)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)原理目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳蛋白質(zhì)的表達(dá)：將克隆基因插入合適載體后導(dǎo)入宿主細(xì)胞表達(dá)大量蛋白質(zhì)的方法。體內(nèi)很難分析單個(gè)蛋白質(zhì)的作用進(jìn)行大量表達(dá)和純化是為了在體外進(jìn)行研究應(yīng)用于蛋白純化、定位及功能分析等方面實(shí)驗(yàn)原理目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳圖pET14b-His-TAT-EGFP-p38-16peptides融合蛋白在Hela細(xì)胞中的熒光顯微鏡檢測(cè)（×400）例目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳酵母表達(dá)系統(tǒng)昆蟲表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白具有正常的活性、構(gòu)象技術(shù)難度較大、耗時(shí)、耗資大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)單，時(shí)間較短，費(fèi)用低，系統(tǒng)比較完備不能有效地對(duì)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾加工，易形成包涵體原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)原理目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)菌株菌株內(nèi)源的蛋白酶過多，可能會(huì)造成外源表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成為理想的起始表達(dá)菌株?？胺Q經(jīng)典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型，也是我們非常熟悉的表達(dá)菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌則是添加T7聚合酶基因，為T7表達(dá)系統(tǒng)而設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)原理目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建目的基因表達(dá)載體PlasmidTaglacIqPromoterAmpr多克隆位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)原理目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳目的基因

/DNA/PCR/酶切/Primer例：p38中抑制多肽16肽序列GGAAGAACATTGTTTCCTGGTACAGACCATATTGATCAGTTGAAGCTCF5’-ACGGATCCTAGGAAGAACATTGTTTCCTGGT-3’R5’-ACGGATCCTTAGAGCTTCAACTGATCAATATGG-3’5’端引物中AC是隨機(jī)保護(hù)堿基，GGATCC是BamHI酶切位點(diǎn)，TA是為防止移碼而引入的兩個(gè)堿基，隨后是編碼16肽前7個(gè)氨基酸的堿基序列。3’端引物中AC是隨機(jī)保護(hù)堿基，GGATCC是BamHI酶切位點(diǎn)，TAA是終止密碼子的反向互補(bǔ)序列，隨后是從編碼16肽堿基序列的最后一個(gè)堿基開始的反向互補(bǔ)序列。實(shí)驗(yàn)原理目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳表達(dá)載體能將外源基因運(yùn)載到大腸桿菌細(xì)胞中;在基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達(dá)元件，就構(gòu)成了表達(dá)載體。元件啟動(dòng)子、終止子、核糖體識(shí)別序列誘導(dǎo)性表達(dá)所需要的元件操縱子序列調(diào)控基因多克隆位點(diǎn)融合Tag復(fù)制起始序列篩選標(biāo)記/報(bào)告基因各種表達(dá)載體的不同之處在于其表達(dá)元件的差異。實(shí)驗(yàn)原理目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳啟動(dòng)子的強(qiáng)弱是對(duì)表達(dá)量有決定性影響的因素之一。從轉(zhuǎn)錄模式上看有組成型表達(dá)和誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá)。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄終止子核糖體結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子、終止子、核糖體識(shí)別序列操縱子序列及配套的調(diào)控基因誘導(dǎo)性表達(dá)所需要的元件多克隆位點(diǎn)

復(fù)制起始序列實(shí)驗(yàn)原理目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳用作分離的載體蛋白被稱為標(biāo)簽蛋白或標(biāo)簽多肽（Tag）。標(biāo)簽位于表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)的N端或者C端，能夠與目的基因融合表達(dá)（N端或者C端融合表達(dá)）。目前常用的標(biāo)簽有組氨酸標(biāo)簽（His-Tag）谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathioneStransferase）標(biāo)簽（GST-Tag）硫氧還蛋白（thioredoxin,Trx）標(biāo)簽麥芽糖結(jié)合蛋白（MaltoseBindingProtein,MBP）蛋白質(zhì)A（proteinA）纖維素結(jié)合位點(diǎn)（cellulosebindingdomain）標(biāo)簽等。一般對(duì)于小分子用較大的Tag（如GST）以獲得穩(wěn)定表達(dá)；而一般的基因多選擇小Tag（如His）減少對(duì)目的蛋白的影響。實(shí)驗(yàn)原理目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳篩選標(biāo)記/報(bào)告基因表達(dá)抗藥性基因，Amp是最常見的篩選標(biāo)記，kana，新霉素，四環(huán)素，紅霉素和氯霉素?？剐曰虻倪x擇要注意是否會(huì)對(duì)研究對(duì)象產(chǎn)生干擾，比如代謝研究中要留意抗性基因編碼的酶是否和代謝物相互作用。GFP（綠色熒光蛋白）是最常用的報(bào)告基因了，半乳糖苷酶，熒光素酶。一些融合表達(dá)Tag也有報(bào)告基因的功能。實(shí)驗(yàn)原理目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳常用表達(dá)載體pGEX系列載體是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)的載體。PtacPromoterAmppGEX-KGpET系列的載體是His6融合蛋白的表達(dá)載體。T7KanapET-14b實(shí)驗(yàn)原理目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳目的蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)lacIq（Lactose）lacI是大腸桿菌中l(wèi)ac操縱子（Operon）的調(diào)節(jié)基因，它所表達(dá)的阻遏蛋白是lac操縱基因（Operator）的抑制因子，抑制轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。當(dāng)有乳糖存在時(shí)，這種阻遏蛋白能與過量的乳糖結(jié)合而失去對(duì)操縱基因的抑制，使lac操縱子上的結(jié)構(gòu)基因lacZ（β-半乳糖苷酶)、lacY（透性酶)、lacA(乙?；D(zhuǎn)移酶）得以正常表達(dá)，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。IPTG（異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷)作為乳糖的類似物與lacI阻遏蛋白結(jié)合而使操縱基因不被抑制，因此IPTG經(jīng)常作為lac操縱子的誘導(dǎo)劑而使用。實(shí)驗(yàn)原理目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳AmpRPlasmidpGEX-KGGSTlacIqPtacPromoterAmprIPTG多克隆位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)原理目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳BamHINdeIBamHIcDNA酶切NdeI基因片段酶切后的目的基因

酶切

連接轉(zhuǎn)化篩選（藍(lán)白斑）鑒定（PCR、酶切、測(cè)序）原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建成功目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳原核表達(dá)的誘導(dǎo)條件IPTG濃度：誘導(dǎo)時(shí)間：～3h誘導(dǎo)溫度：15-42℃實(shí)驗(yàn)原理目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳目的蛋白質(zhì)的純化破碎細(xì)胞超聲破碎溶菌酶裂解從細(xì)胞蛋白中純化出GST和His融合蛋白GST可以通過谷胱甘肽-瓊脂糖親和層析進(jìn)行純化。由于GST對(duì)谷胱甘肽的親和力非常高，因此可以利用谷胱甘肽固化于瓊脂糖形成的親和層析樹脂對(duì)GST及其融合蛋白進(jìn)行純化，最后通過含有游離的谷胱甘肽的緩沖液,洗脫結(jié)合的GST融合蛋白。PolyHis多聚組氨酸能與多種過渡金屬或過渡金屬鰲和物結(jié)合，因此帶HIS-6的蛋白能結(jié)合與固化的Ni2+樹脂，用適當(dāng)?shù)木彌_液（PBS）洗沖洗去除其他雜蛋白后，再用可溶的競(jìng)爭(zhēng)性鰲合劑（咪唑）洗脫可以回收靶蛋白。實(shí)驗(yàn)原理目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳目的蛋白質(zhì)的檢測(cè)蛋白質(zhì)分子量的檢測(cè)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳目的蛋白質(zhì)的分析實(shí)驗(yàn)原理目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）是目前用于測(cè)定蛋白質(zhì)分子量最好的方法。

SDS是一種強(qiáng)陰離子型去污劑，能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，強(qiáng)還原劑例如β巰基乙醇和二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂，通過加熱使蛋白質(zhì)解離。解離后的氨基酸側(cè)鏈與SDS結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。實(shí)驗(yàn)原理目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳蛋白質(zhì)中加入SDS并加熱，SDS分子上的非極性區(qū)(黃色尾巴)會(huì)與蛋白質(zhì)上的非極性區(qū)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性，成為一線狀長(zhǎng)條分子，上面布滿SDS分子。SDS分子的極性區(qū)(洋紅色圓點(diǎn))，則露在外面，以增加親水性。SDS是一種陰離子表面活性劑，能打斷氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白質(zhì)分子間的天然的電荷差異。SDS最終使蛋白質(zhì)變成具有高負(fù)電荷的線狀分子。目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳97.0kDa目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳誘導(dǎo)、培養(yǎng)37℃恒溫?fù)u床電泳檢測(cè)HoeferminiVEVerticalElectrophoresisSystem

儀器與設(shè)備目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳LB培養(yǎng)基、Amp、IPTG30%丙烯酰胺貯液1.0MTris(PH6.8)(濃縮膠),1.5MTris(PH8.8)(分離膠)10%SDS，10%過硫酸銨（AP），四甲基乙二銨（TEMED）1XTris-甘氨酸電泳緩沖液：25mMTris,250mM甘氨酸，0.1%SDS1xSDS上樣緩沖液：50mMTris-HCl（），100mMDTT，2%SDS，10%甘油，0.1%溴酚藍(lán)染色液：90甲醇：90冰乙酸：20水＋0.5gR-250脫色液：90甲醇：90冰乙酸：20水實(shí)驗(yàn)試劑目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳實(shí)驗(yàn)步驟目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳培養(yǎng)誘導(dǎo)樣品制備SDS凝膠檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳1）挑取單菌落，接入3ml含氨芐青霉素（50ug/ml）的LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)過夜。2）取50ul過夜培養(yǎng)物接入3ml含氨芐青霉素（50ug/ml）的LB培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)2h以上，至對(duì)數(shù)中期（）。3）吸出500ul未經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物放在一個(gè)微量離心管中，室溫高速離心1min，沉淀懸浮于100ul1xSDS凝膠加樣緩沖液，100度加熱3min，室溫高速離心1min，冰上放置。4）在剩余培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度1mmol/L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)3h，取500ul樣品放于微量離心管中，室溫高速離心1min。5）沉淀懸浮于100ul1xSDS凝膠加樣緩沖液，100度加熱3min，室溫高速離心1min，冰上放置，待全部樣品處理完后上樣。目的蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測(cè)目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳6）將電泳槽玻璃板洗凈，吹干，并用凡士林封邊,安裝好7）配12%分離膠，將配好的分離膠立即倒入凝膠槽內(nèi)，至凝膠槽高三分之二處，加蒸餾水密封。待膠凝固后（約需30min倒掉水，用吸水紙吸干8）配5%濃縮膠將配好的濃縮膠立即倒入凝膠槽內(nèi)（以插入梳子不溢出為宜），插入梳子9）待膠凝固后，拔出梳子，放入電泳槽中10）制備好的樣品加入上樣孔11）連接電泳儀12）打開電源，調(diào)整電壓至80V，待樣品跑過濃縮膠（大約需

30min）后將電壓調(diào)至120V，待指示劑（溴酚蘭）到達(dá)凝膠的底部距離下緣1cm時(shí)停止電泳，大約需2h，電泳結(jié)束。SDS目的基因的原核誘導(dǎo)的具體表達(dá)及SDSPAGE凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠配制（miniVE）12％分離膠5%濃縮膠H2O2.45ml2.05ml30%丙稀酰胺3.0ml0.5mlTris緩沖液1.9ml（1.5MpH8.8）375ul（1.0MpH6.8）10%SDS75ul30ul10%過硫酸銨75ul30ulTEMED3ul3ul注：1.丙稀酰胺為神經(jīng)毒劑，使用時(shí)