基因工程的科學操作程序

基因工程的科學操作程序基因工程的基本操作程序（1）目的基因的獲?。?）（3）將目的基因導入受體細胞（4）目的基因的檢測與鑒定基因表達載體的構建基因工程的科學操作程序一、目的基因的獲取1、目的基因：主要指的是編碼蛋白質的結構基因，也可以是一些具有調控作用的因子。2、獲取方法：（1）從基因文庫中獲取目的基因；(未知序列）（2）利用PCR技術擴增目的基因；（已知序列）（3）通過DNA合成儀用化學方法直接合成（已知序列）基因工程的科學操作程序（一）從基因文庫中獲取目的基因1.什么叫基因文庫？將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫?；蛭膸?/p>

基因組文庫部分基因文庫（cDNA文庫）基因工程的科學操作程序基因組DNA文庫cDNA文庫基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較基因工程的科學操作程序補：原核細胞的基因結構非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結合位點啟動子終止子

RNA聚合酶能夠識別調控序列中的結合位點，并與其結合。轉錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。轉錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。基因工程的科學操作程序①不能轉錄為信使RNA，不能編碼蛋白質。：能轉錄相應的信使RNA，能編碼蛋白質編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細胞的基因結構②有調控遺傳信息表達的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結合位點。非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子基因工程的科學操作程序補：真核細胞的基因結構編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結合位點內含子外顯子能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內含子：外顯子：基因工程的科學操作程序真核細胞的基因結構編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列：有調控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA

聚合酶結合位點。非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內含子基因工程的科學操作程序結構基因外顯子內含子轉錄、加工修飾mRNA基因工程的科學操作程序原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質的______

和具有調控作用的______

區(qū)組成的原核細胞與真核細胞的基因結構比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質，原核細胞與真核細胞基因結構一樣長嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼基因工程的科學操作程序基因表達的計算在真核生物中，對應的是

的堿基數(shù)DNAmRNA蛋白質轉錄翻譯6 3 1氨基酸數(shù)堿基數(shù)？補充資料基因中外顯子基因工程的科學操作程序基因組文庫與部分基因文庫的關系基因工程的科學操作程序基因組文庫和部分基因文庫的比較文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動子基因中內含子基因多少物種間基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以基因工程的科學操作程序概念辨析基因文庫與基因庫基因庫是指某一生物群體中的全部基因?；蛭膸炫c基因克隆基因克隆是只包含某些特定基因或DNA片段的克隆?；蛭膸熘邪鵀閿?shù)眾多的克隆，建成后可供隨時選取其中任何一個基因克隆之用?；蚬こ痰目茖W操作程序基因組文庫的構建模式圖通過對受體菌的培養(yǎng)而儲存基因基因工程的科學操作程序2.基因文庫的構建方法（1）鳥槍法（2）反轉錄法（3）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法人工合成法（真核生物）多用于原核生物直接分離法基因工程的科學操作程序（1）鳥槍法：供體細胞中的DNA許多DNA片段運載體限制酶與載體連接受體細胞產生特定性狀導入外源DNA擴增目的基因分離(直接分離法)基因工程的科學操作程序以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，再反轉錄酶的催化下反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈DNA，即cDNA，從而獲得所需的基因。（2）反轉錄法（cDNA文庫的構建方法）基因工程的科學操作程序（3）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：根據(jù)已知蛋白質的氨基酸序列，推測出相應的信使RNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測出它的結構基因的核苷酸序列，再通過化學方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學合成基因工程的科學操作程序上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點？優(yōu)點缺點鳥槍法反轉錄法根據(jù)已知氨基酸合成DNA法操作簡便廣泛使用工作量大，盲目，分離出來的有時并非一個基因專一性強操作過程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術條件較高專一性最強僅限于合成核苷酸對較少的簡單基因基因工程的科學操作程序思考：如何從基因文庫中得到所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列；基因的功能；基因在染色體上的位置；基因的轉錄產物mRNA；

基因翻譯產物蛋白質等特性。注意：基因文庫中不是直接保管相應基因，而是保存受體菌，菌中含基因?；蚬こ痰目茖W操作程序（二）利用PCR技術擴增目的基因基因工程的科學操作程序1234522557294時間（min）溫度（℃）PCR反應PCR反應條件PCR過程PCR的特點適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍基因工程的科學操作程序模板DNA95℃基因工程的科學操作程序PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物基因工程的科學操作程序PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶基因工程的科學操作程序PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結束第2輪開始基因工程的科學操作程序PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq基因工程的科學操作程序PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結束基因工程的科學操作程序基因工程的科學操作程序①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術。③前提條件：_______________________；原料：___________、___________、__________________、________________。②原理：__________④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）⑤結果：聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段DNA復制已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸DNA引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增模板DNA基因工程的科學操作程序

過程：變性、退火、延伸三步曲變性：加熱至90～95℃雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至55～60℃部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結合延伸：加熱至70～75℃以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈變性退火延伸基因工程的科學操作程序⑥過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈基因工程的科學操作程序思考？1個DNA分子進行PCR擴增,循環(huán)4次，理論上至少需要幾個引物？2×（2n-1）(n為循環(huán)次數(shù))（24-1）×2=30基因工程的科學操作程序模板DNA

特異性引物耐熱DNA聚合酶

dNTPsMg2+

PCR體系基本組成成分一對寡核苷酸序列：與目的基因的起始段互補PCR總結：基因工程的科學操作程序PCR的基本反應步驟變性90-95?C延伸70-75?C退火55-60?CPCR總結：基因工程的科學操作程序Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)40506070809010010080604020基因工程的科學操作程序基因工程的科學操作程序PCR技術擴增與DNA復制的比較PCR技術DNA復制相同點原理原料條件不同點解旋方式場所酶結果堿基互補配對四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復制細胞核內熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細胞內的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個DNA分子基因工程的科學操作程序PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點重復30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

基因工程的科學操作程序反轉錄法：

以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA雜交雙鏈(單鏈RNA/單鏈DNA)單鏈DNA反轉錄酶DNA聚合酶雙鏈DNA(目的基因)核酸酶H（三）化學方法人工合成目的基因基因工程的科學操作程序根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：

根據(jù)已知蛋白質的氨基酸序列，推測出相應的信使RNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測出它的結構基因的核苷酸序列，再通過化學方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學合成基因工程的科學操作程序從基因文庫中獲取利用PCR技術擴增利用化學方法人工合成歸納：獲取目的基因的方法基因工程的科學操作程序用一定的_________切割質粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。用_____________切斷目的基因，使其產生_________________。將切下的目的基因片段插入質粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組

DNA分子（重組質粒）限制酶黏性末端同一種限制酶相同的黏性末端切口DNA連接酶1.過程:二、構建表達載體——

核心基因工程的科學操作程序質粒DNA分子限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質粒）同一種過程:基因工程的科學操作程序2.基因表達載體的目的（1）使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用?；蚬こ痰目茖W操作程序科學家在培育抗蟲棉時，經歷了多次失敗，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質粒中，然后導入棉花的受精卵中，結果抗蟲基因在棉花體內沒有表達。然后在插入抗蟲基因的質粒中插入啟動子(抗蟲基因首端)，導入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W家又在有啟動子、抗蟲基因的質粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導入棉花受精卵，結果成長的植株，有了抗蟲能力。資料:基因工程的科學操作程序思考：作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務嗎？為什么？（P15）

不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。必須構建上述元件的主要理由是：基因工程的科學操作程序（1）生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體生物中無法轉錄；（3）目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記；（4）為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調控元件，如增強子（增強基因啟動子工作效率的順式作用序列，能夠在相對于啟動子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都發(fā)揮作用。）等；（5）有時需要確定目的基因表達的產物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做成目的基因與標識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等?；蚬こ痰目茖W操作程序3.基因表達載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因基因工程的科學操作程序調節(jié)基因操縱基因結構基因RNA聚合酶半乳糖苷酶酶酶

RNA聚合酶啟動子RNA聚合酶啟動子：位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質?；蚬こ痰目茖W操作程序思考1：

表達載體為什么一定要有啟動子？（1）生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能有利于基因的表達；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體細胞無法轉錄。基因工程的科學操作程序思考2：終止子的作用是什么？

終止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉錄。是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來。思考3：標記基因有什么作用？基因工程的科學操作程序①載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構。注意②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵。③啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少。④目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去?；蚬こ痰目茖W操作程序基因工程技術路線基因工程的科學操作程序三、將目的基因導入受體細胞常用的受體細胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌、酵母菌和動植物細胞等。將目的基因導入受體細胞的原理：借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。（一）轉化：目的基因進入_________內，并且在受體細胞內維持_____和_____的過程受體細胞穩(wěn)定表達基因工程的科學操作程序（二）方法將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入微生物細胞農桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細胞基因工程的科學操作程序1.將目的基因導入植物細胞農桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法基因工程的科學操作程序（1）農桿菌轉化法①特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力②原理：Ti質粒上的T-DNA可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上?；蚬こ痰目茖W操作程序③轉化過程:Ti質粒目的基因構建表達載體導入植物細胞插入植物細胞染色DNA表達新性狀轉入農桿菌基因工程的科學操作程序基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。（2）基因槍法適用于單子葉植物基因工程的科學操作程序（3）花粉通道法植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆螅ǚ坌纬傻幕ǚ酃苓€未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。適用于被子植物基因工程的科學操作程序胚珠花藥花絲柱頭花柱子房壁子房雄蕊雌蕊基因工程的科學操作程序2.將目的基因導入動物細胞（1）方法：顯微注射法（將基因表達載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）思考：為什么要用受精卵而不用體細胞？基因工程的科學操作程序（2）操作程序:提純含目的基因表達載體取受精卵顯微注射移植到子宮受精卵發(fā)育新性狀動物基因工程的科學操作程序常用法：Ca2+處理常用菌：大腸桿菌微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA3.將目的基因導入微生物細胞思考：為什么要用Ca2+處理受體細胞？用Ca2＋處理，增加細菌細胞壁的通透性基因工程的科學操作程序受體生物植物動物微生物受體細胞導入方法受精卵體細胞受精卵細胞/個體農桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術用Ca2+處理成感受態(tài)細胞采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導入目的基因的作法正確的是（）

A.將毒素蛋白注射到受精卵中

B.將編碼毒素蛋白的DNA序列，與質粒重組，導入細菌，用該細菌感染棉的體細胞，再進行組織培養(yǎng)

C.將編碼毒素蛋白的DNA序列，與質粒重組，注射到棉的子房并進入受精卵

D.將編碼毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中BC基因工程的科學操作程序四、目的基因的檢測與鑒定檢測:是否插入目的基因是否轉錄是否翻譯鑒定:分子水平鑒定個體生物學水平鑒定基因工程的科學操作程序1、檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因①首先取出轉基因生物的基因組DNA；（1）方法:DNA分子雜交（2）過程:②

將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記,以此做探針；③

使探針和轉基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中。（一）檢測基因工程的科學操作程序基因探針：是一段帶有檢測標記，且序列已知的，與目的基因互補的核酸序列?；蛱结樛ㄟ^分子雜交與目的基因結合，產生雜交信號，能從浩翰的基因組中把目的基因顯示出來?；蚬こ痰目茖W操作程序DNA分子雜交示意圖采用一定的技術手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈?；蚬こ痰目茖W操作程序（二）鑒定（個體生物學水平）2、檢測目的基因是否轉錄出了mRNA3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等①方法:分子雜交方法:抗原-抗體雜交②過程:用上述探針和轉基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉錄出了mRNA?；蚬こ痰目茖W操作程序提取（3）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)基因工程的科學操作程序若不能表達，要對抗蟲基因再進行修飾。怎樣檢驗抗蟲基因在棉細胞內是否表達呢？沒有抗蟲基因的棉植株有抗蟲基因的棉植株棉鈴蟲蟲沒有死蟲被殺死沒有表達目的基因表達基因工程的科學操作程序類型步驟檢測內容方法結果顯示分子檢測第一步目的基因是否進入受體細胞DNA分子雜交（DNA和DNA之間）是否成功顯示出雜交帶第二步目的基因是否轉錄出mRNA分子雜交技術（DNA和mRNA之間）是否成功顯示出雜交帶第三步目的基因是否翻譯出蛋白質抗原—抗體雜交是否成功顯示出雜交帶個體水平鑒定包括抗蟲、抗病的接種實驗，以確定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程產品與天然產品的活性比較，以確定功能是否相同等。目的基因的表達和檢測基因工程的科學操作程序提示：

①DNA分子雜交技術首先提取受體細胞中的DNA，然后高溫解成單鏈，再與同位素標記的DNA探針雜交；

②抗原－抗體雜交所用到的抗體是用表達出的蛋白質注射動物進行免疫，產生相應的抗體，并提取出而來的?；蚬こ痰目茖W操作程序歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學方法人工合成構建基因表達載體目的基因、啟動子、終止子、標記基因將目的基因導入受體細胞轉化法（微生物）、農桿菌轉化法（植物）、顯微注射法（動物）目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉錄、翻譯基因工程的科學操作程序為什么要構建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體內提取不行嗎？構建基因文庫是獲取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過反轉錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構建基因文庫。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個體發(fā)育的不同階段表達的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構建基因文庫?；蚬こ痰目茖W操作程序利用大腸桿菌可以生產出人的胰島素，聯(lián)系前面有關細胞器功能的知識，結合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？有些蛋白質肽鏈上有共價結合的糖鏈，這些糖鏈是在內質網和高爾基復合體上加工完成的，內質網和高爾基復合體存在于真核細胞中，大腸桿菌不存在