實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒DNA的提取和瓊脂糖凝膠電泳專(zhuān)題培訓(xùn)課件

載體構(gòu)建過(guò)程一、質(zhì)粒DNA的提取及電泳檢測(cè)二、目的基因的PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)三、DNA的定性定量分析及酶切產(chǎn)物檢測(cè)質(zhì)粒雙酶切PCR產(chǎn)物雙酶切四、酶切產(chǎn)物及PCR產(chǎn)物的純化及檢測(cè)五、DNA的連接及檢測(cè)六、大腸桿菌的培養(yǎng)和超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞的制備七、質(zhì)粒DNA的原核轉(zhuǎn)化和藍(lán)白斑篩選酶切產(chǎn)物+酶切產(chǎn)物T載體+PCR產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：6學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)類(lèi)型：綜合性 每組人數(shù)：4人／組實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取及

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的技術(shù)和方法。

一、堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA質(zhì)粒按復(fù)制方式分為兩種類(lèi)型：松弛型質(zhì)粒20～200個(gè)拷貝/細(xì)胞嚴(yán)緊型質(zhì)粒1～2個(gè)拷貝/細(xì)胞實(shí)驗(yàn)背景

質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)一種自我復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子，能穩(wěn)定地獨(dú)立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。大多數(shù)來(lái)自細(xì)菌的質(zhì)粒是雙鏈、共價(jià)閉合環(huán)狀的分子，以超螺旋形式存在；質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，稱(chēng)為開(kāi)環(huán)DNA；如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂，則形成線狀DNA。當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA電泳時(shí)，同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動(dòng)速度要比開(kāi)環(huán)和線狀分子的泳動(dòng)速度快。由pUC18載體改建而成，在pUC18載體的MCS處的Xba

I和Sal

I識(shí)別位點(diǎn)之間插入了EcoR

V識(shí)別位點(diǎn)，用EcoR

V進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3＇端添加“T”而成。因大部分耐熱性DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)都有PCR

產(chǎn)物的3＇末端添加一個(gè)“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率。復(fù)制起點(diǎn)篩選標(biāo)記基因多克隆位點(diǎn)

二、實(shí)驗(yàn)原理

高堿細(xì)菌的細(xì)胞壁破裂，內(nèi)容物釋放①染色體DNA斷裂成不同長(zhǎng)度的線性雙鏈DNA；②線性雙鏈DNA片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性。①質(zhì)粒DNA不發(fā)生斷裂，保持雙鏈閉合環(huán)狀；②雙鏈DNA并不完全分離。高酸中和至中性變性的染色體DNA與變性的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎片凝聚成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物質(zhì)粒DNA又恢復(fù)天然構(gòu)型，溶解在上清液中純化RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去殘留的蛋白質(zhì)

SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性，所以SDS處理細(xì)菌細(xì)胞后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的破裂，從而使質(zhì)粒DNA以及基因組DNA從細(xì)胞中同時(shí)釋放出來(lái)。釋放出來(lái)的DNA遇到強(qiáng)堿性(NaOH)環(huán)境，就會(huì)變性。然后，用酸性乙酸鉀來(lái)中和溶液，使溶液處于中性，質(zhì)粒DNA將迅速?gòu)?fù)性，而基因組DNA，由于分子巨大，難以復(fù)性。離心后，質(zhì)粒DNA將在上清中，而基因組DNA則與細(xì)胞碎片一起沉淀到離心管的底部。通過(guò)這種方法即可將質(zhì)粒DNA從細(xì)菌中提取出來(lái)。三、儀器、材料與試劑

(一)儀器1．恒溫培養(yǎng)箱2．恒溫?fù)u床3．臺(tái)式離心機(jī)4．高壓滅菌鍋

(二)材料1．含連接外源基因質(zhì)粒的E.coli

2．1.5mLEppendorf管3．吸頭、微量移液器SolutionI

50mmol／L葡萄糖25mmol／LTris·HCl(pH8.0)10mmol／LEDTA(三)主要試劑溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl組成(保護(hù)、緩沖)葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,減少抽提過(guò)程中的機(jī)械剪切作用,防止破壞質(zhì)粒(保護(hù)作用)EDTA

的作用是絡(luò)合掉鎂等二價(jià)金屬離子,防止DNA酶對(duì)質(zhì)粒分子的降解作用（保護(hù)作用）Tris-HCl使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作用）SolutionII

0.4mol/LNaOH，2％SDS,用前等體積混合

溶液II：由SDS（十二烷基硫酸鈉）與NaOH組成(裂解、變性)SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性（裂解細(xì)胞和蛋白質(zhì)變性作用）NaOH（PH>12）的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性（DNA變性作用）溶液III：HAc和KAc組成的高鹽溶液(復(fù)性，分離)HAc溶液能中和溶液Ⅱ的堿性，使染色體DNA變性而發(fā)生纏繞，并使質(zhì)粒DNA復(fù)性。KAc會(huì)與SDS形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去；溶液中的DNA也會(huì)與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒DNA分離。SolutionIII

5mol／L乙酸鉀60mL冰乙酸11．5mL水28．5mL

TE緩沖液

10mmo1／LTris·HCl1mmo1／LEDTA(pH8.0)胰RNA酶溶液將RNA酶溶于10mmo1/LTris·HCl(pH7．5)和15mmo1/LNaCl中，配成10mg/mL的濃度，于100℃加熱15min，緩慢冷卻至室溫，保存于-20℃。

四、實(shí)

驗(yàn)步驟加1.5ml培養(yǎng)物于EP管，12000g×30S

除去上清，加入冰的200μl溶液I，劇烈振蕩EP管，室溫3min

加入300μl溶液II，快速顛倒數(shù)次，冰浴3min

加入400μl冰溶液III，溫和振蕩10s，冰浴5min，12000g×5min轉(zhuǎn)移上清到新EP管，加入等體積酚/氯仿(1:1)，溫和振蕩，冰浴3min，12000g×5min

上層水相轉(zhuǎn)移到新EP管，加入2倍體積無(wú)水乙醇，顛倒混勻，-20℃冰箱中放置15min，12000g10min

棄上清，沉淀中加1ml70%乙醇，12000g×5min

去上清，管平放室溫靜置10min，20μlTE溶解DNA

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的方法和技術(shù)。2.瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNADNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng),DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖—磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。DNA分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。二、實(shí)驗(yàn)原理

凝膠電泳不僅可分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。如上次實(shí)驗(yàn)提取的質(zhì)粒DNA，有3種構(gòu)型,這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移率不同。溴化乙錠在紫外光照射下能發(fā)射熒光，當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中從負(fù)極向正極泳動(dòng)時(shí)，溴化乙錠從正極向負(fù)極移動(dòng)，這樣溴化乙錠分子就會(huì)嵌入DNA分子中形成絡(luò)合物，使DNA在紫外光下發(fā)射很強(qiáng)的熒光。在溴化乙錠足夠的情況下，熒光的強(qiáng)度正比于DNA的含量，這樣就可以檢測(cè)DNA的濃度。因此電泳后呈3條帶，超螺旋質(zhì)粒DNA泳動(dòng)最快，其次為線狀DNA，最慢的為開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA。

三、儀器、材料與試劑

(一)儀器

1．微波爐

2．瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)

3．移液器

4．凝膠成像系統(tǒng)

(二)試劑

1．（1）5×TBE(50倍體積的TBE貯存液）配1000mL5×TBETris54g

硼酸27.5g

0.5mol／LEDTA20mLpH8.0或（2）50×TAE(50倍體積的TAE貯存液）

Tris242g

乙酸57mL

0.5mol／LEDTA100mLpH8.02．凝膠加樣緩沖液(6x)3．瓊脂糖4．溴化乙錠溶液(EB)0.5ug／mL

四、實(shí)驗(yàn)步驟(一)、稱(chēng)取0.5g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入50mL0.5xTAE緩沖液，置微波爐或水浴加熱至完全溶化，溫度降至60℃左右時(shí)加入少許EB溶液，搖勻，則為1％瓊脂糖凝膠液。(二)膠板的制備1．將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。

2．將冷到60℃左右的瓊脂糖凝膠液，加入EB后，緩緩倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面(不要形成氣泡)。注意：溴化乙錠為致癌物，須戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染環(huán)境。

3．待膠凝固后，取出梳子，放在電泳槽內(nèi)。4．加入電泳緩沖液至電泳槽中。

(三)加樣用移液槍將已加入上樣緩沖液的DNA樣品加入加樣孔(記錄點(diǎn)樣順序及點(diǎn)樣量)。(四)電泳1．接通電泳槽與電泳儀的電源(注意正負(fù)極，DNA片段從負(fù)極向正極移動(dòng))。DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過(guò)5V/cm。2．當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距凝膠前沿1~2cm處，停止電泳。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在紫外燈(360nm或254