分子生物學(蛋白組學)

梁漱溟-做學問的八個境界形成主見發(fā)現(xiàn)不能解釋的事情融會貫通知不足以簡御繁運用自如一覽眾山小通透精髓-言簡意賅實用-會用-駕輕就熟歸納-系統(tǒng)化比較-推敲-設問求證-旁征博引問題-疑惑中心思想辨真?zhèn)?證優(yōu)劣-識差別文獻的閱讀-理解-掌握的八個步驟意義-方法-應用本文檔共74頁；當前第1頁；編輯于星期三\1點55分Inviewofproteinexpression,whatcancausethedifferenceincolorsensitivity?Feb26,2015Internet2本文檔共74頁；當前第2頁；編輯于星期三\1點55分

驗證Validation

闡明機制Mechanism

假說（基因型-候選基因）Hypothesis-CandidateGene求證Test

生物表象-疾?。ū硇停㏄henomenon

假說主導的生物系統(tǒng)科研思維邏輯PHTMV給予或剝奪候選基因功能GainorLossofCandidateGeneFunction

生物表象或疾病PhenomenonorDisease候選基因功能體現(xiàn)/喪失系統(tǒng)的組份-結(jié)構-功能Component-Structure-Function

候選基因-作用方式，等CandidateGene-style,etc.分子機制驗證于新的生物系統(tǒng)Mechanismvalidatedinanewbio-system本文檔共74頁；當前第3頁；編輯于星期三\1點55分LogicalEvolutionaryofBiochemistryLiu(2010)AnnRevBiochem分析-研究

組份-結(jié)構-功能某種生命癥象重構系統(tǒng)分子功能干預

樣品分析

揭示分子機制組份-結(jié)構-功能分子特性分子復合物代謝-調(diào)節(jié)環(huán)路轉(zhuǎn)基因動物模型Knock-outKnock-inScientificInterrogationStrategy4本文檔共74頁；當前第4頁；編輯于星期三\1點55分Inviewofproteinexpression,whatcancausethedifferenceincolorsensitivity?Feb26,2015Internet5本文檔共74頁；當前第5頁；編輯于星期三\1點55分

驗證Validation

闡明機制Mechanism

生物表象或疾病TraitorDisease求證Test

多個組學數(shù)據(jù)（DateofMultiomes）

數(shù)據(jù)主導的生物系統(tǒng)科研思維邏輯DTTMVorDDTMV

表型組數(shù)據(jù)（DateofPhenome）

本文檔共74頁；當前第6頁；編輯于星期三\1點55分BiologicalSystemsMultiple-OmicsfromMultiomestoPhenomeRitchie(2015)NatRevGenetic,Synder(2012)Cell-Trait本文檔共74頁；當前第7頁；編輯于星期三\1點55分PhenotypicOutcomesGeneratedGenetically&EpigeneticallybyMulti-OmesRitchie(2015)NatRevGeneticEstrogen→carcinogenicbyproduct→DNAdamage→cancercells↑←dysregulationofcellcycleCYPmutant↑↓↑COMTmutant↑DNArepairXRCC↓↓本文檔共74頁；當前第8頁；編輯于星期三\1點55分Complex-TraitPhenotypesRevealedbyMulti-OmesRitchie(2015)NatRevGenetAsystemsgenomicsapproachestoachieveamorethoroughandinformativeinterrogationofgenotype-phenotypeassociation,throughbuildingamultivariatemodelassociatedwithgivenoutcomes本文檔共74頁；當前第9頁；編輯于星期三\1點55分CategorizationofMulti-StagedAnalysisofPhenotypeRitchie(2015)NatRevGenet本文檔共74頁；當前第10頁；編輯于星期三\1點55分CategorizationofMeta-DimensionalAnalysisRitchie(2015)NatRevGenet本文檔共74頁；當前第11頁；編輯于星期三\1點55分IntroductiontoProteome&ProteomicsTostudyproteinmolecules,theprinciplesofproteinseparationandquantification,andtheidentityanalysisofproteincharacterizationhavetobedeveloped.Proteome

indicatestheentireofproteinscompletelyexpressedbyagenomeoratissueoracelltype.(theentirety)Proteomicsistostudyquantitativechangeinexpressionlevelsofprotein,

andtheirapplicationtodrugdiscovery,diagnosticsandtherapy.(thequantity)Therightstrategythroughproteomicswouldbeappliedtoquantitativelyanalyzetheinducedbiologicalchangesversustheinherentbackgroundexpressionofavarietyofproteinsinsourcesamplestoidentifythedifferenceinproteinexpressionthatmaycausedisease.(comparisonviadifferentialproteinexpression)12本文檔共74頁；當前第12頁；編輯于星期三\1點55分定義：蛋白組與蛋白組學蛋白質(zhì)組（Proteome）在一個細胞、一個組織、一個個體內(nèi)，由基因組編碼的所有全部的蛋白質(zhì)組分。蛋白質(zhì)組學（Proteomics）:研究蛋白質(zhì)組的科學。蛋白質(zhì)的種類、數(shù)量（2維電泳2DE,液相層析LC,質(zhì)譜分析MS,蛋白質(zhì)免疫共沉淀IP&Westernblotting,核糖體輪廓分析RibosomeProfiling）蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與其它生物大分子的相互作用（酵母雙雜交Y2H,熒光共振的能量傳遞FRET,染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP）蛋白質(zhì)的生物學功能（pathway,circuitry）研究策略（i）組級研究proteome-wideinvestigation(ii)差減比較（subtractivecomparison）13本文檔共74頁；當前第13頁；編輯于星期三\1點55分組學研究的基本策略組級的輪廓研究（Ome-wideProfiling）Massive-Highthroughput-Parallel大規(guī)模-高產(chǎn)出-平行對照（全部、所有）。差別-差減比對（differential-subtractivecomparison）有比較就有鑒別；差別因子就是差別表觀的動因，動因是事物發(fā)生機制的線索與事物演變的預設軌道（差別、差異）。14本文檔共74頁；當前第14頁；編輯于星期三\1點55分AnnotationofSubtractiveComparisonofProteome甲乙兩樣品間蛋白質(zhì)的差別：A+b-c-d+e-F-G乙-樣品：B-C-D-E-F-G甲-樣品：A-B-C-D-E?)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)組級規(guī)模的蛋白質(zhì)輪廓分析與差減比較組級范圍的蛋白質(zhì)的差別：種類-數(shù)量次要差異蛋白-疾病關聯(lián)次要差異蛋白形成原因-機制主要差異蛋白-疾病關聯(lián)主要差異蛋白形成原因-機制致病機制-疾病診斷-治療方案-疾病預后15本文檔共74頁；當前第15頁；編輯于星期三\1點55分Inviewofproteinexpression,whatcancausethedifferenceincolorsensitivity?Feb26,2015Internet16本文檔共74頁；當前第16頁；編輯于星期三\1點55分蛋白質(zhì)組復雜性蛋白質(zhì)組復雜性，（i）是指蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)數(shù)量-氨基酸序列常與基因組的基因數(shù)量-核苷酸序列不一致（ii）蛋白質(zhì)的功能結(jié)構與修飾的多樣性（iii）蛋白復合物的組成-功能-分布的多樣性基因轉(zhuǎn)錄的始點與終點是可變的。初始mRNA常經(jīng)歷可選擇性剪接，或反式剪接。蛋白質(zhì)常經(jīng)歷翻譯后的修飾，如，P,Ub,Me,poly(ADP),etc。蛋白質(zhì)多以復合物的形式既參與細胞的代謝活動又參與細胞的組成結(jié)構。17本文檔共74頁；當前第17頁；編輯于星期三\1點55分OverviewonTechnology&ResourceinProteomicsCelis(2003)CancerCell18本文檔共74頁；當前第18頁；編輯于星期三\1點55分三個主要應用于蛋白組學的技術與方法2-維電泳（2-DementionalElectrophoresis2DE）液相層析（LiquidChromatographyLC）質(zhì)譜分析（MassSpectrometryMS）生物信息學（Bioinformatics）19本文檔共74頁；當前第19頁；編輯于星期三\1點55分Spatial&TemporalProteinExpressionTimecourseofexpressionLocationofexpressionTissue-orOrgan-specificexpressionCell-specificexpressionMultipleTestsforProteinIDMSanalysisPMF&P/rDeterminationofN-&C-terminalAAMoleculeWeight,pIDifferencesbetweenSamplesHealthyvsdiseaseInducedvsbackgroundSpeciesvsspeciesOverviewonProteinID&AbundanceDIGE-orLC-MSProteinMicroarrayDatabaseSearchProteinResponse&CoordinationSignalingPathwayMetabolicPathwayProteinParticipatinginDevelopmentProliferationDifferentiationMatterMetabolismAnnotationofProteomicsStrategy蛋白質(zhì)表達的輪廓分析蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)細胞綜合功能差減對比組設立蛋白質(zhì)時-空表達差別分析多重驗證蛋白質(zhì)ID*蛋白質(zhì)組學的研究策略20本文檔共74頁；當前第20頁；編輯于星期三\1點55分HPLC-MS*TechnologicalStrategy(GE-LC-MS-Database)toProteomicsGapelo(2010)Proteomics21本文檔共74頁；當前第21頁；編輯于星期三\1點55分2-維電泳層析分離樣品蛋白質(zhì)制備質(zhì)譜分析肽質(zhì)量指紋(PMF)、峰值比率(P/R)胰蛋白酶電泳蛋白斑點膠切割與酶消化*蛋白質(zhì)組學研究策略的方法程序蛋白質(zhì)類別與豐度比對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫22本文檔共74頁；當前第22頁；編輯于星期三\1點55分Celis(2003)CellCancerCell23本文檔共74頁；當前第23頁；編輯于星期三\1點55分ConceptiononExperimentalPlanningBiologicalReplicates:(i)forcellcultures,animalandplantexperimentsusuallythreebiologicalexperimentstendtobesufficienttodetectinducedbiologicalvariationsonthebackground(ii)forpatientsinclinical,itisadvisedtoanalyzeatleastsixpatientsforcontrol,dieased,andtreatedsamples,ormore.PoolingofSamples:YesorNo?No!Poolingofsamplesisonlyperformedforcreatinganinternalstandardfordifferentialgelelectrophoresis(DIGE).Pre-fractionationofSamples:YesorNo?Yes,itwillincreasethenumberofidentifications.WhatistheBestWorkflowforproteinanalysistoStartWith?2-Dgelallowshigh-throughputanalysisontheproteinlevel.24本文檔共74頁；當前第24頁；編輯于星期三\1點55分DIGE原理

DifferentialImagingofGelElectrophoresis

電泳膠熒光差別影像分析不同蛋白樣品標記不同染料，1:1混合。1st–等電電泳聚焦

（蛋白等電點）。2nd–SDS-聚丙烯凝膠電泳

（蛋白分子量）。電泳膠分離激光差別掃描的影像-分析

（電泳膠的單個與重疊影像圖上的蛋白質(zhì)斑點位置-色度提示蛋白質(zhì)ID與豐度）。DIGE電泳影像上的蛋白質(zhì)斑點位置，代表該類蛋白質(zhì)分子量和等電點；斑點色度代表該類蛋白質(zhì)在對比的樣品中其含量上的差別。25本文檔共74頁；當前第25頁；編輯于星期三\1點55分熒光差別掃描與影像紀錄依樣品標記的染料選擇激光波長鑒別蛋白質(zhì)類別與豐度依蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫單個、重疊電泳影像分析依蛋白電泳斑點位置-色度（檢測-對照）蛋白質(zhì)標記不同染料蛋白質(zhì)樣品（檢測：對照）1:1混合2-維電泳分離（Mw&pI）DIGE方法程序26本文檔共74頁；當前第26頁；編輯于星期三\1點55分等電點電泳聚焦IEF

IsoelectricElectrophoresisFocusingIEFforPurposes:1stdimensionalfractionationofproteinmixturesinhigh-resolution2-DelectrophoresisPre-fractionationofproteinmixturesaccordingtochargeFortheseparationofveryheterogeneousmixturesoftrypticpeptides等電點電泳聚焦理論基礎

IEF是在含有pH梯度膠上進行的。蛋白質(zhì)是帶電荷的，帶正或負電荷取決于(i)蛋白分子結(jié)構,和(ii)環(huán)境pH.環(huán)境pH:在堿性緩沖液,蛋白帶負電荷；在酸性緩沖液，蛋白帶正電荷。

蛋白等電點(pI):在某個pH,蛋白所帶的凈電荷為零

。IPG非移動pH梯度膠

immobilizedpHgradientIPGStripforIEFpH10.0Cathode(-)pH3.0Anode(+)pH10→327本文檔共74頁；當前第27頁；編輯于星期三\1點55分等電點聚焦原理：蛋白依等電點在pH梯度膠上分離兩性電解質(zhì)與pH梯度:兩性電解質(zhì)（含有多個氨基與多個羧基的脂肪酸分子）的混合物，在電場條件下，自動排列形成pH梯度，負極具有高pH值，正極具有低pH值。兩性電解質(zhì)特性:(i)在等電點，具有高緩沖和溶解性(ii)良好電導性(iii)無生物學效應(iv)小分子量兩性電解質(zhì)膠:2%(w/v)電解質(zhì),4%(T)電泳膠&3%(C)交聯(lián)度IPG非移動pH梯度膠條:(i)當?shù)鞍咨蠘佑贗PG，蛋白可以帶正、負電荷或零電荷(ii)正電荷蛋白向負極移動，并停留在相當于它等電點的pH處；負電荷蛋白向正極移動，停留在相當于它等電點的pH處。28本文檔共74頁；當前第28頁；編輯于星期三\1點55分ImmobilizedpHGradientPolyacrylamideTheGeneralStructureofImmobiline(Ampholyte)29本文檔共74頁；當前第29頁；編輯于星期三\1點55分ThePrincipleofIsoelectricElectrophoresisFocusing+H+-H+OrientationofelectricfieldvspHgradientProteinchargedwithcationoranion30本文檔共74頁；當前第30頁；編輯于星期三\1點55分*2-DimensionalElectrophoresisExample:Protein2-DE(-)DecreasingpI(+)(-)DecreasingMr(+)LehningerPrincipleofBiochemistryp95(-)(+)pH10pH3斑點位置，代表某類蛋白質(zhì)的等電點和分子量31本文檔共74頁；當前第31頁；編輯于星期三\1點55分不同蛋白樣品標記不同染料:染料標記幫助區(qū)分不同樣品來源的同類蛋白質(zhì)在混合樣品中的含量。混合蛋白質(zhì)樣品(1:1),進行2-維電泳:不同來源的同類蛋白質(zhì)，在電泳中可行進在電泳膠上同一位置，但，具有不同的染料顏色。激光差別掃描:依不同染料選擇不同掃描波長，則，不同蛋白樣品來源的蛋白質(zhì)呈現(xiàn)各自顏色的電泳膠影像。結(jié)果分析-閱讀:蛋白斑點的位置代表蛋白質(zhì)類別，斑點的顏色代表該蛋白含量或相對含量。單個電泳膠影像和多個電泳膠影像重疊的分析閱讀。*電泳膠熒光差別影像DIGEDifferentialImagingofGelElectrophoresis32本文檔共74頁；當前第32頁；編輯于星期三\1點55分MinimalLabelingofLysinewithCyDye0Cx30minGE(2004)2-DElectrophoresisLysineLabeling(minimallabeling)Inpractice400pmolofdyeisaddedto50ugofprotein.Inthiswayonly3-5%oftheproteinswillreceiveatag(95-97%remainunlabeled)Labelingreaction:noIPGbuffer,noreductant,pH8.5,0ocx30minwithdye,theepsilon-aminosidegroupoflysineislabeledwithdye.33本文檔共74頁；當前第33頁；編輯于星期三\1點55分SaturationLabelingofCysteinewithCyDyeCysteineLabeling(saturationlabeling)Thehighsensitivity,downto1000humancells(around2.5ugprotein)couldprovidegood2-DELabelingreaction:noIPGbuffer;TCEPreductantpH8.0,37oC1h;dyeaddedpH8.0,37oC30min;thethiogroupofcysteinelabeledwithdyes(Cy3orCy5).34本文檔共74頁；當前第34頁；編輯于星期三\1點55分*DIGE方法程序35本文檔共74頁；當前第35頁；編輯于星期三\1點55分*ProcedureforDIGEofProteinSamplesGE(2004)2-DElectrophoresis蛋白樣品標記染料熒光差別影像蛋白質(zhì)2-DE分離蛋白斑點位置-色度分析36本文檔共74頁；當前第36頁；編輯于星期三\1點55分ExampleforDIGEImageDifferentialWavelength

ProteomicsinPracticep6937本文檔共74頁；當前第37頁；編輯于星期三\1點55分Cy3redCy5blueCy2greenIEFSDSImageAnalysisSchematicforDIGEProcedureWestermeier(2008)ProteomicsinPractice38本文檔共74頁；當前第38頁；編輯于星期三\1點55分2-DEofMouseLiverExtractGE(2004)2-DElectrophoresis39本文檔共74頁；當前第39頁；編輯于星期三\1點55分2-DEofProteinsStainedwithSyproRuby(A)&DeepPurpleStrain(B)AndProteinSpot3-DPlotAnalysisDE(2004)2-DElectrophoresis40本文檔共74頁；當前第40頁；編輯于星期三\1點55分ExperimentalStrategyofGE&MSApplication:FusionProteinTagGavin(2002)NatureConstructoffusionproteintagConstructoffusiongeneHRCreateofexpressionlocioffusionprotein41本文檔共74頁；當前第41頁；編輯于星期三\1點55分Example:DataAnalysisviaBioinformaticsinProteomicsGavin(2002)NatureActual:Theory42本文檔共74頁；當前第42頁；編輯于星期三\1點55分層析柱

：靜止相-層析基質(zhì)，它與蛋白樣品中的各類蛋白組分具有差別的親和結(jié)合力；移動相-蛋白樣品和層析洗脫液，層析洗脫液可以降低-減弱層析基質(zhì)與蛋白組分間的親和結(jié)合力。液相層析原理：蛋白質(zhì)樣品是處于液相中，樣品內(nèi)的各個蛋白質(zhì)組份與層析基質(zhì)之間的不斷結(jié)合-解離作用的強弱差異，決定著各個蛋白質(zhì)組份通過層析基質(zhì)所需要時間的長短，即決定各個蛋白質(zhì)組份通過層析基質(zhì)的慢-快。在層析過程中，弱相互作用的蛋白，最先通過層析柱；強相互作用的蛋白，最后通過層析柱。如此，各個蛋白質(zhì)組份與層析柱的相互作用的強弱不同，它們通過層析柱的次序就有先有后，因而達到各個蛋白質(zhì)組份經(jīng)層析基質(zhì)逐個被分離。液相層析原理43本文檔共74頁；當前第43頁；編輯于星期三\1點55分2-DLC:2-dimensionalliquidchromatographyIEX:ionexchangechromatographyRPC:reversephasechromatographyMALDI:matrixassistantleaserdesorptionionizationHMW:highmolecularweightPMF:peptidemassfingerprintviam/zvalueP/r:theratioofpeaksatsamemass/zvaluebetweendiffsamplesConcentration&HMWcutoffProteinIsolation蛋白質(zhì)提?。ńM織-細胞-體液）蛋白質(zhì)消化，免疫親和分離2-次液相層析(離子交換和反相層析）4.質(zhì)譜分析(PMF&P/R)鑒別蛋白ID與豐度蛋白數(shù)據(jù)庫比對蛋白質(zhì)層析-質(zhì)譜分析的方法程序44本文檔共74頁；當前第44頁；編輯于星期三\1點55分*舉例：離子交換層析分離蛋白質(zhì)的原理圖示Thesequentialorderofproteinstodisassociatefromthesolid-phase(SP)isreversetoproteinaffinitywithSP.Weak(highpI)Strong(lowpI)+++Pr-Pr-Pr2-Peaksequential-site:ProteinIDPeakheight:proteinabundanceProteinscoulddifferentiallyassociatewiththesolid-phase(SP)byproteins’physicalandchemicalcharacteristicsi.e.proteinstronglyorweaklytoassociatewithSP.AnionExchangeChromatography45本文檔共74頁；當前第45頁；編輯于星期三\1點55分MolecularWeightHydrophobicGroupOppositeChargedIonLigandSpecificityHydrophobicGroupofProteins

PrincipleinChromatographicPurificationGE(2004)Handbook46本文檔共74頁；當前第46頁；編輯于星期三\1點55分ColumnChromatographyLehningerPrinciplesofBiochemistryp9047本文檔共74頁；當前第47頁；編輯于星期三\1點55分48本文檔共74頁；當前第48頁；編輯于星期三\1點55分*離子交換層析(IECorIEX)蛋白帶正負電荷不一

:蛋白的化學結(jié)構，溶液的pH值蛋白帶電量不一:溶液的pH值與蛋白的等電點之間的差距帶電荷的蛋白與帶相反電荷的介質(zhì)（離子交換柱）相互作用，作用的強弱正比于蛋白所帶凈電荷的量影響因素：鹽溶度，洗脫液pH

TheoreticalProteinTitrationCurveASuitableIonExchangerSelectionCationExchangerAnionExchanger49本文檔共74頁；當前第49頁；編輯于星期三\1點55分強結(jié)合的蛋白質(zhì)，最后解離被洗脫(具有較低pI的蛋白質(zhì))弱結(jié)合的蛋白質(zhì)，最先解離于離子層析柱，最先被洗脫(具有較高pI的蛋白質(zhì))洗脫液的梯度改變(鹽溶度-pH)蛋白質(zhì)(負)結(jié)合于陰離子交換層析柱(陽)樣品蛋白質(zhì)經(jīng)處理而帶負電荷pHHtoLAnionConcLtoH*舉例:蛋白質(zhì)經(jīng)陰離子交換層析柱的分離50本文檔共74頁；當前第50頁；編輯于星期三\1點55分蛋白質(zhì)被離子化為陽離子或陰離子。離子蛋白在電場或磁場內(nèi)飛行。由于離子蛋白質(zhì)質(zhì)量的差異決定了具有不同質(zhì)量的離子蛋白質(zhì)飛過電場或磁場的快慢。小質(zhì)量離子蛋白-飛行快，大質(zhì)量-飛行慢檢測儀捕獲每一個離子蛋白質(zhì)，依據(jù)它們的飛行時間(TOF)或質(zhì)量/電荷比值(m/z,質(zhì)-荷比值)，進行排序(TOF=m/z)，

繪制出質(zhì)譜圖（離子蛋白質(zhì)質(zhì)量對離子蛋白質(zhì)檢測信號強度作圖）。數(shù)據(jù)分析經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比對(肽質(zhì)量指紋PMF&峰值比率P/R），鑒別-定量樣品中蛋白質(zhì)的類別-含量。*質(zhì)譜分析原理MassSpectrometryMS51本文檔共74頁；當前第51頁；編輯于星期三\1點55分*質(zhì)譜分析原理

蛋白質(zhì)離子化帶正或負電荷離子蛋白質(zhì)飛經(jīng)電場或磁場檢測儀捕獲離子蛋白質(zhì)，計量飛行時間（TOF）或，質(zhì)-荷比值（m/z）數(shù)據(jù)分析與比對蛋白數(shù)據(jù)庫，依據(jù)

PMF(TOForm/z)&P/R;52本文檔共74頁；當前第52頁；編輯于星期三\1點55分定義DefinitionTOF(timeofflight):離子蛋白質(zhì)飛經(jīng)電場所需要的時間。蛋白質(zhì)的質(zhì)量不同，則它們飛經(jīng)電場的快慢不一、所需要的時間長短不同。小質(zhì)量離子蛋白-飛行快，大質(zhì)量離子蛋白-飛行慢m/z(masspercharge)：質(zhì)-荷比，單位電荷的離子蛋白質(zhì)所具有的質(zhì)量。蛋白質(zhì)的氨基酸的組成不一（種類-數(shù)量的不一），就具有不同的質(zhì)-荷比。PMF(peptidemassfinger)：能夠代表某類蛋白質(zhì)組成特征的一組多肽的特征質(zhì)量譜圖，被稱為肽質(zhì)量指紋。P/R(peakratio)：峰值比率，質(zhì)譜圖中的所檢測到的離子蛋白質(zhì)的信號強度的比較，代表著所檢測到的離子蛋白質(zhì)的相對含量。53本文檔共74頁；當前第53頁；編輯于星期三\1點55分PrincipleforMassSpectrometryMicallef(2010)JHematol&OncolProteinsIonizedwithchargecationoranionProteinsIonizedtoflightthroughelectricfieldProteinsIonizedtobesequentiallycapturedbyDetectorviaTOFMatrix-assistedlaserdesorptionionizationElectrosprayionization54本文檔共74頁；當前第54頁；編輯于星期三\1點55分PrincipleforMassSpectrometrySchematicofQuadrupoleTOFHybridAnalyzerWestermeier(2008)ProteomicsinPracticeProteincouldbeionized,representedasm/z.(M/Zvalue)Differentproteinshavingdifferentialm/zvaluemaybeseparatedbyelectricfield,bigion(bigm/z)takesmoretimeofflyingthroughtheelectricfield.(TOF)Detectorcansequentiallycaptureionshavingpassedtheelectricfield,smallion(smallm/z)flyingfastermayfirstbecaptured,andbigiontobelatercaptured.55本文檔共74頁；當前第55頁；編輯于星期三\1點55分Example:MSDataDiagram56本文檔共74頁；當前第56頁；編輯于星期三\1點55分2x6x*圖示質(zhì)譜分析原理1xMedialLargeSmall57本文檔共74頁；當前第57頁；編輯于星期三\1點55分質(zhì)譜數(shù)據(jù)的提呈和閱讀蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)譜圖就是該樣品中的各個離子蛋白質(zhì)的質(zhì)-荷比值對它的信號強度作圖。X-軸(m/z，質(zhì)-荷比值):依離子蛋白質(zhì)的質(zhì)-荷比值或離子蛋白質(zhì)飛行時間進行排序。

?。欤?前，大（慢）-后Y-軸(SignalIntensity，信號強度):用計數(shù)檢測儀，測量每個離子蛋白質(zhì)的信號強度（每秒計數(shù)或電壓），離子蛋白質(zhì)被檢測的信號強度代表該離子蛋白質(zhì)的含量。注：所測得的信號強度并不能精確反映該離子蛋白質(zhì)的數(shù)量，但其之間是相關的，這是由于許多干擾因素所致。如，離子大小，離子速率，離子的電荷數(shù)；設置標準內(nèi)參可校正誤差。58本文檔共74頁；當前第58頁；編輯于星期三\1點55分質(zhì)譜數(shù)據(jù)解讀:PMF&P/R蛋白數(shù)據(jù)庫：蛋白質(zhì)可被水解為許多肽段，每一個肽段都有其特定的分子質(zhì)量與理化特性，如此許多蛋白質(zhì)的信息匯集總和即為蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，它可作為實驗中被檢測蛋白質(zhì)的比對參考。每類蛋白質(zhì)因其固有的氨基酸組成與序列，在質(zhì)譜分析中可被電離為一組特定的多肽肽段。能夠代表某類蛋白質(zhì)特征的一組特定多肽的特征質(zhì)量譜圖被稱為肽質(zhì)量指紋(PMF)。肽質(zhì)量指紋代表蛋白質(zhì)的類別，即，PMF=ProteinID每個蛋白質(zhì)離子的信號強度，即峰值高低，即為該蛋白質(zhì)離子在此系統(tǒng)中被檢測到的數(shù)量（豐度）。峰值比率(P/R)，在任意兩個蛋白質(zhì)離子的位點上，兩個峰值間的比率就代表著這兩類蛋白質(zhì)離子在此系統(tǒng)內(nèi)的相對豐度。因此，

P/R=蛋白質(zhì)相對豐度ProteinAbundancerelative59本文檔共74頁；當前第59頁；編輯于星期三\1點55分質(zhì)譜分析揭示蛋白質(zhì)的信息肽質(zhì)量指紋能揭示蛋白質(zhì)的部分序列信息：

在質(zhì)譜分析中，由于分子碰撞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)斷裂總是出現(xiàn)質(zhì)量數(shù)值特定的成對互補離子—N-末端的離子系列(b-離子)和C-末端的離子系列(y-離子)—據(jù)此，邏輯推繹出蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序。肽質(zhì)量指紋能揭示蛋白質(zhì)的組成信息：如，蛋白的酸性氨基酸的羧基可以被酯化修飾。在某種條件下，質(zhì)譜分析（經(jīng)比對原初蛋白的質(zhì)譜）即可揭示這類細微的分子修飾的質(zhì)量改變。質(zhì)譜分析揭示某些蛋白質(zhì)特性：如，蛋白翻譯后的修飾。據(jù)估計，人類蛋白組含有105潛在的磷酸化位點。蛋白翻譯后修飾可改變原初蛋白的質(zhì)量，質(zhì)譜分析可鑒別這類因修飾發(fā)生改變的蛋白質(zhì)質(zhì)量。60本文檔共74頁；當前第60頁；編輯于星期三\1點55分*Example:質(zhì)譜分析揭示小肽的氨基酸組成及序列

Campbell(2002)DiscoveringTheprotonatedtotalpeptidemassis1410.6(13-aapeptide).ThepeptidetobeionizedintoN-terminalions(b-ions)andC-terminalions(y-ions).Thealignmentoftheseions,fromsmalltolargeaccordingtotheirm/z,auniquemassspectrumforthepeptide.Thesignalintensity(theheight)ofeachionrepresentstheabundanceofthefragmentioninsystem.Contrastofb-ionstoy-ionscouldinferthepeptidesequence.CampbellAM(2002):p18761本文檔共74頁；當前第61頁；編輯于星期三\1點55分

質(zhì)譜分析：蛋白質(zhì)特異結(jié)合位點的染色質(zhì)組蛋白的修飾變化Vermeulen(2010)Cell142:967-980ChIP-ProteinMSAnalysis62本文檔共74頁；當前第62頁；編輯于星期三\1點55分Figure6.TripleSILACPulldownsRevealingHistoneModificationCrosstalkThree-dimensionalrepresentationoftheMSsignalofanSgf29peptideidentifiedinatriplepulldownSILACexperiment(them/zscaleisthexaxis,thechromatographicretentiontimeistheyaxis,andtheMS-signalisthezaxis).Eachgroupofsignalsrepresentsthenaturalisotopepatternofthepeptide.TherelativeintensitiesofthetripletpeakoftheSgf29peptideindicatesthepreferenceofbindingtothemodificationstates(unmethylatedhistoneH3peptide[leftpeak],H3K4me3peptide[middlepeak],andthedouble-modifiedH3K4me3/H3K9,14Acpeptide[rightpeak]).Sameas(A)foraPHF8peptideidentifiedinthesametriplepulldown.NuclearextractsderivedfromHeLacellswereincubatedwiththeindicatedhistonepeptides.TheamountofSgf29proteinboundtothesepeptideswasdeterminedbywesternblottingusinganantibodyagainstendogenousSgf29.BacteriallysatesexpressingrecombinantHis-taggedSgf29wereincubatedwiththeindicatedpeptides.Followingincubationandwashes,theamountofboundSgf29proteinwasdeterminedbywesternblottingusingananti-Hisantibody.NotethatSgf29doesnotbindtoapeptidecontainingH3K9,14acetylationandthatthebindingofSgf29toH3K4me3isnotaffectedbyasymmetricdimethylationofH3R2.(E–G)Three-dimensionalrepresentationofanHP1a(E),Orc5(F),andCDYL(G)peptideidentifiedinatriplepulldownSILACexperiment.ThespectrashowtheMS-signalrepresentingtherelativebindingofthesepeptidestotheunmethylatedhistoneH3peptide(leftpeak),theH3K9me3peptide(middlepeak),andthedouble-modifiedH3K9me3/H3S10Ppeptide(rightpeak).HistonepeptidepulldownsinHeLanuclearextractswereperformedwiththeindicatedpeptides.TheamountofHP1aandCDYLbindingtothesepeptideswasdeterminedbywesternblottingusinganantibodyagainstHP1aandCDYL.63本文檔共74頁；當前第63頁；編輯于星期三\1點55分*質(zhì)譜分析應用:蛋白定量分析

如何鑒別不同來源樣品的蛋白種類與數(shù)量的差別分子標簽：用不同質(zhì)量的分子標簽標記不同的蛋白樣品，就是為了在樣品蛋白組的比較分析中，區(qū)分-鑒別同一類蛋白質(zhì)的不同樣品來源，這是基于質(zhì)譜分析能很好區(qū)分不同的分子標簽的細微質(zhì)量差別，如同位素。在質(zhì)譜分析中,由于不同來源的同類蛋白質(zhì)標記著質(zhì)量細微差別的不同的分子標簽，就具有不一致但極為相似的質(zhì)-荷比值(m/z)；它們的峰值比率(P/R)就代表著該類蛋白質(zhì)在不同來源的樣品中的相對含量。在質(zhì)譜分析中，用不同分子標簽進行樣品標記的方法：蛋白消化：在O18

標記的水中。代謝標記：使用重氨基酸

（S35orN15

）同構異質(zhì)的分子標簽

，如，重質(zhì)量-ICAT或輕質(zhì)量-ICAT同質(zhì)異構的分子標簽（具有不同的核磁共振）如，iTRAQ64本文檔共74頁；當前第64頁；編輯于星期三\1點55分*舉例:不同質(zhì)量同位素經(jīng)代謝標記于蛋白質(zhì)樣品

Campbell(2002)Discoveringp189不同的蛋白樣品標記著不同質(zhì)量的同位素?；旌蠘悠罚?:1），電泳分離，部分酶消化。質(zhì)譜分離與分析：(1)在每個m/z位點,出現(xiàn)成對的峰，意味著標記著不同質(zhì)量同位素的同一類蛋白質(zhì)，前峰代表輕同位素標記的蛋白質(zhì)，后峰為重同位素標記的同一類蛋白質(zhì)。(2)在每個m/z位點,成對峰的比率代表著那個蛋白質(zhì)在不同樣品中的相對豐度。123PMFAAseq&constituentofprotein***65本文檔共74頁；當前第65頁；編輯于星期三\1點55分*質(zhì)譜圖的解讀（Massgram）成對峰-等高:不同樣品中的同類蛋白質(zhì)因標記不同質(zhì)量的同位素而具有相鄰的質(zhì)-荷比值并具有相似的含量。成對峰-不等高:不同樣品中的同類蛋白質(zhì)有著含量上的差別。單個峰:某類蛋白質(zhì)只存在于一個樣品中。2-DE(A:B=1:1),蛋白電泳分離，&斑點切割與消化B-樣品蛋白標記為N14A-樣品蛋白標記為N15質(zhì)譜分析與閱讀(PMF&P/R)am/zIntensitybm/zIntensitycm/zIntensity66本文檔共74頁；當前第66頁；編輯于星期三\1點55分*舉例:質(zhì)譜分析揭示蛋白質(zhì)的磷酸化修飾不同的蛋白樣品標記著不同質(zhì)量的同位素?；旌蠘悠罚?:1），電泳分離，部分酶消化。質(zhì)譜分離與分析：蛋白質(zhì)磷酸化，即為Xp;蛋白質(zhì)未磷酸化，即為X。在Xp位點上，峰值比率表示為