分子生物學(xué)基因突變

基因突變

&

相關(guān)技術(shù)Dr.LiuJi本文檔共104頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分

NaturalSelectionFebruary12th,2009markedthe200thbirthdayforfamousevolutionscientist

CharlesDarwin(02/12/1809-04/19/1882),

wholaidthefoundationsfortheevolutiontheory-mutation&naturalselection.AsperDarwin,mutationprovidesnewtraitsforspecies,andthenthenature"selects"thosespecieswithadvantageousheritabletraits-theprocessDarwincalled

"naturalselection".

本文檔共104頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分NaturalSelection本文檔共104頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分ScienceandResearch本文檔共104頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分如果要對(duì)近幾年的社會(huì)話題按照“敏感指數(shù)”排出一個(gè)名次的話，轉(zhuǎn)基因食品的安全問題恐怕至少要入圍三甲。究其背后的原因，如果不是轉(zhuǎn)基因食品在安全性問題上確有遮掩、隱瞞的話，那么我們就該反思，是不是真正地了解了“轉(zhuǎn)基因食品的安全性到底是怎么一回事兒？”轉(zhuǎn)基因食品的安全問題本文檔共104頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分Evolution

Mutationsareenginesofnaturalselection

本文檔共104頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分Spiralgoat

本文檔共104頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分Georgewasallmouth

Theeyeshaveit本文檔共104頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分BacktotheWater本文檔共104頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分本文檔共104頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分Science:科學(xué)家揭示

人類長(zhǎng)相各異的原因

人類的長(zhǎng)相各異，沒有兩個(gè)人長(zhǎng)相完全相同的。是什么導(dǎo)致了人面部形態(tài)各異呢？遺傳學(xué)證據(jù)顯示父母和子女長(zhǎng)相類似，但是哪些因素使得DNA調(diào)控如此精確，使得兩個(gè)人長(zhǎng)相不同呢？伯克利國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家揭示了增強(qiáng)子在面部發(fā)育中發(fā)揮重要作用。相關(guān)報(bào)道發(fā)表在近期的Science雜志上。該文章的通訊作者AxelVisel博士稱其研究結(jié)果表明很可能人類基因組中的數(shù)千個(gè)增強(qiáng)子都不同程度的參與到面部發(fā)育過程中。本文檔共104頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分該研究總共分析了四千多個(gè)可能與面部發(fā)育相關(guān)的增強(qiáng)子序列，建立了增強(qiáng)子序列的基因組圖譜。此外他們還細(xì)致分析了其中200個(gè)基因增強(qiáng)子的活性。子女遺傳了父母的基因，但是由于增強(qiáng)子的存在，在面部發(fā)育過程中基因活性不盡相同，最終導(dǎo)致面部發(fā)育結(jié)果不完全相同。該結(jié)果還提示遺傳學(xué)家，增強(qiáng)子的特異突變也會(huì)在新生兒缺陷中發(fā)揮作用。有助于開發(fā)更好的診斷和治療措施。本文檔共104頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分FineTuningofCraniofacialMorphologybyDistant-ActingEnhancers

CatiaAttanasio,AlexS.Nord,YiwenZhu,MatthewJ.Blow,ZirongLi,DeniseK.Liberton,HarrisMorrison,IngridPlajzer-Frick,AmyHolt,RoyaHosseini,SengthavyPhouanenavong,JenniferA.Akiyama,MalakShoukry,VeenaAfzal,EdwardM.Rubin,DavidR.FitzPatrick,BingRen,BenediktHallgrímsson,LenA.Pennacchio,AxelViselTheshapeofthehumanfaceandskullislargelygeneticallydetermined.However,thegenomicbasisofcraniofacialmorphologyisincompletelyunderstoodandhypothesizedtoinvolveprotein-codinggenes,aswellasgeneregulatorysequences.Weusedacombinationofepigenomicprofiling,invivocharacterizationofcandidateenhancersequencesintransgenicmice,andtargeteddeletionexperimentstoexaminetheroleofdistant-actingenhancersincraniofacialdevelopment.Weidentifiedcomplexregulatorylandscapesconsistingofenhancersthatdrivespatiallycomplexdevelopmentalexpressionpatterns.Analysisofmouselinesinwhichindividualcraniofacialenhancershadbeendeletedrevealedsignificantalterationsofcraniofacialshape,demonstratingthefunctionalimportanceofenhancersindefiningfaceandskullmorphology.Theseresultsdemonstratethatenhancersareinvolvedincraniofacialdevelopmentandsuggestthatenhancersequencevariationcontributestothediversityofhumanfacialmorphology.doi:10.1126/science.1241006本文檔共104頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分運(yùn)動(dòng)和咖啡因

會(huì)改變你的DNA

你可能會(huì)認(rèn)為不管做任何事情，自己的DNA都是不會(huì)受影響而改變的。但在某種意義上說，這一想法是錯(cuò)誤的。在3月Cell出版社的《細(xì)胞代謝》雜志上，研究人員發(fā)表報(bào)告稱當(dāng)身體處于健康狀態(tài)時(shí)，不怎么運(yùn)動(dòng)的男性和女性在運(yùn)動(dòng)鍛煉幾分鐘后，他們體內(nèi)的DNA會(huì)出現(xiàn)瞬間變化。更讓人驚奇的是，這項(xiàng)研究表明我們?cè)绯亢鹊目Х戎锌Х纫虺煞忠部赡軙?huì)以相同方式影響肌肉中的DNA。本文檔共104頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分女性攜帶離婚基因A-allele

者離婚率高出五成

很多時(shí)候，當(dāng)婚姻出現(xiàn)問題時(shí)，人們會(huì)把責(zé)任怪罪在男方頭上，認(rèn)為男士的花心導(dǎo)致了婚姻破裂。在近期的BiologicalPsychiatry雜志上刊登的一項(xiàng)研究成果表明，據(jù)瑞典斯德哥爾摩卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院的最新研究發(fā)現(xiàn)，婚姻出現(xiàn)破裂也有可能是女性體內(nèi)攜帶的一種基因作祟所致。一種叫A-allele的催產(chǎn)素受體基因會(huì)在女性體內(nèi)搞怪，讓女性對(duì)婚姻關(guān)系中偶爾出現(xiàn)的不和諧插曲缺乏耐心，脾氣暴躁，從而提高離婚率。女性處于生產(chǎn)期和哺乳期時(shí)體內(nèi)會(huì)自行分泌催產(chǎn)素，這種激素能拉近女性和后代間的關(guān)系。不過若催產(chǎn)素分泌異常就會(huì)攪亂大腦對(duì)感情問題的處理能力，催生叫A-allele的“離婚基因”。研究人員調(diào)查了1800名女性后發(fā)現(xiàn)攜帶這種基因的女性離婚率高50%。本文檔共104頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分概念及分類誘因與特點(diǎn)突變與疾病突變與遺傳工程技術(shù)突變的檢測(cè)基因突變概要Amutationhascausedthisgardenmossrose(百葉薔薇)toproduceflowersofdifferentcolors.Thisisasomaticmutationthatmayalsobepassedoninthegermline本文檔共104頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分

概念：基因突變：基因組DNA分子中發(fā)生堿基的增添、缺失或改變而引起的基因結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而引起遺傳表型的改變。一、概念及分類本文檔共104頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分Illustrationsoffivetypesofchromosomalmutations.本文檔共104頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分本文檔共104頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分Cellswithoneadditionalsetofchromosomes,foratotalof69chromosomes,arecalledtriploid本文檔共104頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分Whenanindividualhastwoormorecellpopulationswithadifferentchromosomalmakeup,thissituationiscalledchromosomalmosaicism.本文檔共104頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分Inabalancedtranslocation,piecesofchromosomesarerearrangedbutnogeneticmaterialisgainedorlostinthecell.本文檔共104頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分Mitochondriaprovidethecell’senergy.本文檔共104頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分本文檔共104頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分基因突變指一個(gè)基因變?yōu)樗牡任换?，是基因分子結(jié)構(gòu)或化學(xué)組成上的改變。染色體的結(jié)構(gòu)及數(shù)目改變本文檔共104頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分突變分類（遺傳信息的改變）突變分類堿基改變密碼效應(yīng)點(diǎn)突變（pointmutation）堿基插入突變（baseinsert）堿基缺失突變（basedeletion）同義突變（synonymousmutation）錯(cuò)義突變（missensemutation）無義突變（nonsensemutation）移碼突變（frame-shiftingmutation）本文檔共104頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分堿基改變點(diǎn)突變：DNA被化學(xué)修飾或復(fù)制時(shí)發(fā)生錯(cuò)配，使一個(gè)堿基變成另一個(gè)堿基。堿基插入突變：DNA鏈中插入1個(gè)或多個(gè)堿基（轉(zhuǎn)座子Tn），突變后可引起DNA序列閱讀框架改變。堿基缺失突變：DNA鏈中1個(gè)或多個(gè)堿基發(fā)生丟失，突變后可引起DNA序列閱讀框架改變。突變分類本文檔共104頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分本文檔共104頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分基因突變的密碼效應(yīng)分類同義突變：堿基被替代后沒有密碼子改變，其產(chǎn)物AA序列也無變化。錯(cuò)義突變：堿基序列的改變引起AA序列改變。無義突變：某個(gè)堿基改變使某個(gè)AA的密碼子成為蛋白質(zhì)合成的終止密碼子。纈氨酸GUAHb中一條鏈

谷氨酸

GAA本文檔共104頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分本文檔共104頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分基因突變的其他分類方式

形態(tài)突變生化突變致死突變按突變的表型特征分類:

突變發(fā)生后出現(xiàn)的表型改變是多種多樣的，有的可能十分微弱，需要精細(xì)的生化技術(shù)才能檢測(cè)出與野生型（WT)的差別，有的突變的表型效應(yīng)可能如此之大，以致產(chǎn)生形態(tài)上的嚴(yán)重缺陷甚至死亡。本文檔共104頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分1、形態(tài)突變(morphologicalmutation):突變主要影響生物體的外在可見的形態(tài)結(jié)構(gòu)，故又稱可見突變。如形狀、大小、色澤等的改變。2、生化突變(biochemicalmutations):突變影響生物的代謝過程。導(dǎo)致一個(gè)特定的生化功能的改變或喪失。

（1）失去功能的突變：突變事件通常是破壞性的，多數(shù)情況下，突變事件導(dǎo)致功能的喪失，完全喪失基因功能的突變稱為無效突變(nullmutation)。通常喪失功能的突變是隱性的，有時(shí)候也可以是顯性的。（2）獲得功能的突變:突變事件引起的遺傳隨機(jī)變化有可能使之獲得某種新的功能。3、致死突變(lethalmutation):

影響生物體的生活力，導(dǎo)致個(gè)體死亡的一類突變。

條件致死突變(conditionallethalmutations)：在某些條件下能成活，而在某些條件下是致死的。例如T4噬菌體的溫度敏感突變型在25℃時(shí)能在E.coli宿主細(xì)胞中正常生長(zhǎng)，形成噬菌斑，但在42℃

時(shí)就不能生長(zhǎng)。本文檔共104頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分按發(fā)生突變的細(xì)胞分類

基因突變可以發(fā)生在體細(xì)胞或生殖細(xì)胞中，這兩種突變有完全不同的后果。體細(xì)胞突變生殖細(xì)胞突變1、體細(xì)胞突變(somaticmutations):在保持分裂的身體組織的一個(gè)細(xì)胞發(fā)生突變，這個(gè)細(xì)胞便成為一群相同突變細(xì)胞的祖先。在發(fā)育過程中，體細(xì)胞突變事件發(fā)生的愈早，對(duì)表型的影響就愈大。體細(xì)胞突變一般不能遺傳給后代。2、生殖細(xì)胞突變(germinalmutation)：生殖細(xì)胞突變發(fā)生在種系(germline)中。如果突變的性細(xì)胞參與受精過程，那么突變基因就會(huì)傳給下一代。最典型的例子是性連鎖遺傳的血友病突變?cè)跉W洲王室通過維多利亞女王在其整個(gè)家系中的遺傳。本文檔共104頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分二、突變誘因及特點(diǎn)自發(fā)性突變

DNA復(fù)制過程中偶然堿基配對(duì)出現(xiàn)錯(cuò)誤，突變頻率低(10-9~10-10)

。誘變劑的作用誘變劑（mutagen）外源誘發(fā)突變的因素，種類繁多，突變頻率高，是自然突變的100-1000倍

。主要有以下幾種：突變誘因本文檔共104頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分（1）物理因素：紫外線、電離輻射等。（2）

生物因素：病毒、真菌、細(xì)菌等（3）化學(xué)因素：①烷化劑本文檔共104頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分

②堿基類似物:如5-BrU5-BrU引起DNA堿基改變示意圖

③其他化學(xué)誘變劑:羥胺、亞硝酸鹽等本文檔共104頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分基因突變表現(xiàn)出以下幾個(gè)方面的普遍特征：(一)突變的平行性、重演性和可逆性

(二)突變的多方向性與復(fù)等位基因(三)隨機(jī)性——生物個(gè)體發(fā)育的任何時(shí)期

體細(xì)胞突變——不遺傳給后代生殖細(xì)胞突變——遺傳給后代(四)廣泛性和有害性（多數(shù)）基因突變的一般特征

本文檔共104頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分1.平行性

是指親緣關(guān)系相近的物種因遺傳基礎(chǔ)較近似而發(fā)生相似基因突變的現(xiàn)象。

如小麥有早熟、晚熟的變異類型，屬于禾本科的其它物種如大麥、黑麥、燕麥、水稻、玉米等同樣存在這些變異類型。

2.重演性

相同的基因突變可以在同種生物的不同個(gè)體間重復(fù)發(fā)生，稱為重演性。

同一基因突變?cè)诓煌膫€(gè)體上均可能發(fā)生。

不同群體中發(fā)生同一基因突變的頻率相近。突變的平行性、重演性和可逆性

本文檔共104頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分

3.可逆性：基因突變的發(fā)生方向是可逆的?！镎蛔?forwardmutation)：顯性基因A隱性基因a；★反突變(reversemutation)：隱性基因a顯性基因A?！锿ǔＵJ(rèn)為：野生型基因是正常、有功能基因；而最初基因突變往往是野生型基因突變而喪失功能、發(fā)生功能改變，表現(xiàn)為隱性基因。所以反突變又稱為回復(fù)突變(backmutaiton)。

通常用u表示正突變頻率、v表示反突變頻率，則：

正突變u

野生型===========突變型一般u>v反突變v本文檔共104頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分突變的多方向性：指基因突變可以多方向發(fā)生，即基因內(nèi)部多個(gè)突變部位分別改變后會(huì)產(chǎn)生多種等位基因形式。例如：A基因不同部位發(fā)生改變產(chǎn)生突變基因a1、a2、a3等對(duì)A均表現(xiàn)為隱性的基因。新基因可能均是無功能的，也可能各具不同功能。這些復(fù)等位基因可以從野生型基因突變產(chǎn)生，也可以從其它任何一個(gè)突變基因突變產(chǎn)生。突變的多方向性與復(fù)等位基因本文檔共104頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分復(fù)等位基因(multipleallele)：

位于同一基因位點(diǎn)上的多種等位基因。在二倍體與異源多倍體中，同一位點(diǎn)只能有一對(duì)基因，最多存在兩種等位基因形式；因此復(fù)等位基因的各種形式會(huì)存在于生物群體的不同個(gè)體中。等位基因概念本文檔共104頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分

人類紅細(xì)胞表面抗原的特異性由3個(gè)復(fù)等位基因IA，IB，i決定?！锲渲蠭A，IB對(duì)i均為顯性；★

IA，IB間為共顯性?！?/p>

3種基因兩兩組合可能形成6種基因型、4種紅細(xì)胞表面抗原反應(yīng)類型，如下表所示(其中用IO表示i)：人類ABO血型的復(fù)等位基因

本文檔共104頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分三、基因突變與疾病人類所有疾病均可視為基因病按照參與疾病發(fā)生過程的基因性質(zhì)和來源，基因病可分為三種：GeneMutationsandDisease基因型genotype表型phenotype正常/異常單基因病多基因病獲得性基因病正常/異常本文檔共104頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分基因突變與疾病代謝性疾病神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病發(fā)育缺陷腫瘤早老癥本文檔共104頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分NoSymptomsSevereSymptoms

MildSymptomsNoSymptoms

DiseaseInheritanceisComplex本文檔共104頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分SearchingDiseaseFamilies本文檔共104頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分本文檔共104頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分血友病突變?cè)诰S多利亞女王及其整個(gè)家系中的遺傳本文檔共104頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分突變與疾病Tumor/Cancer本文檔共104頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分早老癥早衰癥全稱早年衰老綜合癥，又稱兒童早老癥，屬遺傳病。Hutchinson于1886年首先報(bào)告雖然本病為一種先天遺傳性疾病，但還不能確定是常染色體隱性還是顯性遺傳。本病為一綜合征，特點(diǎn)為發(fā)育延遲，至嬰兒時(shí)期就發(fā)生進(jìn)行性老年性退行性改變?；颊呱眢w的老化過程十分快速。而罹患此病孩童的年齡很少超過13歲，大約每八百萬個(gè)新生兒之中有一位患有此疾。本文檔共104頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分赫-吉綜合征(HGPS)本文檔共104頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分日本京都大學(xué)靈長(zhǎng)類研究所副教授大石高生的研究小組發(fā)現(xiàn)了年齡小但面相衰老的“早衰癥”猴子，并將此發(fā)現(xiàn)發(fā)表在了美國科學(xué)雜志上。該小組目標(biāo)通過猴子細(xì)胞制造出的人工多功能干細(xì)胞(iPS)使機(jī)體各種細(xì)胞變異，體外再現(xiàn)早衰癥病狀，以此幫助衰老研究。大石教授表示“不僅希望揭開早衰癥的病理，同樣想要研究人類正常衰老的課題”。本文檔共104頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分著色性干皮?。╔P）

著色性干皮病(xrodermapigmentosaXP)與共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥一樣，屬DNA修復(fù)缺陷所致的遺傳性共濟(jì)失調(diào)綜合征。XP是常染色體隱性遺傳病，具有遺傳異質(zhì)性。著色性干皮病是一種發(fā)生在暴露部位的色素變化，萎縮，角化及癌變的遺傳性疾病，屬常染色體隱性遺傳病。本文檔共104頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分21三體綜合癥患兒（先天愚型）白化病患者Duchenne肌營養(yǎng)不良癥（假性肌肥大型）唇裂與腭裂本文檔共104頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分MitochondrialMutatorMiceValidatethemtDNAMutationTheoryforMammalianAging本文檔共104頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分本文檔共104頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分本文檔共104頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分本文檔共104頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分研究基因突變與疾病關(guān)系時(shí)應(yīng)注意的問題致病突變與基因多態(tài)性：基因中某種突變?cè)谌巳褐邪l(fā)生頻率>1%，屬于基因多態(tài)性，該突變?yōu)橹行酝蛔?。發(fā)生頻率<1%則可能屬于致病突變，但須首先確證在人群中只在病患個(gè)體出現(xiàn)該突變，其次是在病患家系中也只有患病者出現(xiàn)該突變。單基因遺傳疾病與主要基因突變有關(guān)，如堿基置換、插入、缺失等多基因病涉及突變和候選易感基因數(shù)量眾多鑒定致病或與疾病相關(guān)的基因變異體是關(guān)鍵常見病稀有變異體常見變異體常見病本文檔共104頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分人類基因突變及疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫HMGD-HumanGeneMutationdbSVD-SequencevariationdbHGBASE-HumanGenicBi-AllelicSequencesdbTheSNPconsortium

dbSNP-Humansinglenucleotidepolymorphism(SNP)db

ListofmutationdatabasesfromOMIM

ListofmutationdatabasesfromIMT(Finland)

ADB-Albinismdb(Mutationsinhumangenescausingalbinism)Alpha-glucosidase-Informationabouthumanacidalpha-glucosidase(GSD-II)ARmutations-HumanandrogenreceptormutationdbAntithrombinmutationdb

AsthmaandAllergygenedb

本文檔共104頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分人類基因突變及疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫

TSC-TSC(TSC1/TSC2)variationdbTSC2-Cardiff-RotterdamTuberousSclerosis(TS)db(Tuberin;TSC2)TGDB-TumorgenedbVMD2mutation-HumanVMD2mutationdbvWFmutation-HumanvonWillebrandfactor(vWF)mutationdbWRN-HumanWRNmutationdb(Warnerdisease)WT1mutation-HumanWT1mutationdbX-ALDmutation-HumanABCD1mutationdb本文檔共104頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分人類基因突變及疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫OTCase-Humanornithinetranscarbamylase(OTCase)websiteCytochromeP450allelesnomenclature

p53mutationdb-UniversityofTokyop53mutationdbGermlinep53mutationdb-UniversityofPraguedbofgermlinep53mutationsPAHdb-Humanphenylalaninehydroxylase(PAH)mutationdbPAX6mutation-HumanPAX6mutationdbPrion-PrionandpriondiseasewebsiteRAG1base-HumanRAG1mutationdbRAG2base-HumanRAG2mutationdbRB1base-Humanretinoblastoma-associatedprotein(RB)mutationdbRetNet-RetinalInformationNetworkRetinaInternationalScientificNewsletter-InformationonRetinalgenes,proteinsanddiseases本文檔共104頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分人類基因突變及疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫FBN1mutation-Humanfibrillin1mutationdb(Marfansyndrome)G6PD-HumanG6PDdeficiencyresourceGaltmutation-Humangalactose-1-phosphateuridylyltransferasemutationdb(Galactosemia)HEXAdb-HumanHexosaminidaseAmutationdb(Tay-sachsdisease)IL2RGbase-HumanIL2RG(Interleukin-2receptorgamma)mutationdb(X-SCID)L1CAMmutation-HumanL1CAMmutationdbLDLRmutation-HumanLDLRmutationdb(Familialhypercholesterolemia)LQTSdb-LongQTsyndromedbNCF1base-HumanNCF1mutationdbNCF2base-HumanNCF2mutationdbNeuromusculardiseaseswebsite

NCL-NeuronalCeroidLipofuscinosesmutationdb本文檔共104頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分人類基因突變及疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫BIOMDB-DbofmutationscausingtetrahydrobiopterindeficienciesBLMbase-HumanBLMmutationdb(Bloomsnydrom)BTKbase-HumanBTKmutationdb(X-linkedagammaglobulinemia)CD40Lbase-HumanCD40ligandmutationdbCOL1/3mutation-HumanTypeIandIIIcollagenmutationdbCFTRmutation-Humancysticfibrosismutationdb(CFTR)EMDdb-HumanEmerin(EMD)mutationdb(Emery-Dreifussmusculardystrophy)KMeyeDB-EyediseasegenesdbFVIImutation-HumanFactorVIImutationdbHAMSTeRS-HumanFactorVIIImutationdb(HaemophiliaA)HAeMB-HumanFactorIXmutationdb(HaemophiliaB)本文檔共104頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分定點(diǎn)突變技術(shù)（想變就變）

定點(diǎn)突變：為了了解基因突變與其產(chǎn)物對(duì)個(gè)體表型的關(guān)系，有目的地在離體條件下制造位點(diǎn)特異突變。定點(diǎn)突變技術(shù)廣泛應(yīng)用與基因表達(dá)調(diào)控、遺傳和蛋白質(zhì)工程研究

定點(diǎn)突變技術(shù)包括：

各種核酸酶和突變劑制造突變技術(shù)

寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)突變

PCR定點(diǎn)突變四、突變與遺傳工程技術(shù)本文檔共104頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分基因會(huì)發(fā)生突變，突變可以自發(fā)也可以誘發(fā)。但在加拿大生物化學(xué)家M·史密斯（1932-2000）發(fā)明定點(diǎn)突變法之前，突變株的產(chǎn)生必須經(jīng)由自然界或用化學(xué)等方法誘使基因體突變，這種突變屬于隨機(jī)突變。史密斯發(fā)明的定點(diǎn)突變法卻是有目的的，該法可經(jīng)由設(shè)計(jì)好的寡核苷酸，在任何一個(gè)基因片段上進(jìn)行隨意或設(shè)計(jì)好的突變。也就是說，這種突變是預(yù)先設(shè)定好的，所以也有人將該法稱為"反遺傳法"。有意思的是，這一給生命科學(xué)研究及應(yīng)用

領(lǐng)域帶來革命性突破的方法，竟然是史密斯

和其同事在喝咖啡時(shí)閑聊出來的。

定點(diǎn)突變法不僅廣泛用于基因工程領(lǐng)域，還

可用于農(nóng)業(yè)培育抗蟲、抗病的良種，用于醫(yī)

學(xué)矯正遺傳病、治療癌癥等。本文檔共104頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分定點(diǎn)突變

定點(diǎn)突變是指通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因組，也可以是質(zhì)粒）中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點(diǎn)突變等。定點(diǎn)突變能迅速、高效的提高DNA所表達(dá)的目的蛋白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段。本文檔共104頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能，二者之間的關(guān)系是蛋白質(zhì)組研究的重點(diǎn)之一。對(duì)某個(gè)已知基因的特定堿基進(jìn)行定點(diǎn)改變、缺失或者插入，可以改變對(duì)應(yīng)的氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，對(duì)突變基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行研究有助于人類了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，探討蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)/結(jié)構(gòu)域。利用定點(diǎn)突變技術(shù)改造基因：如野生型的綠色熒光蛋白（wtGFP）是在紫外光激發(fā)下能夠發(fā)出微弱的綠色熒光，經(jīng)過對(duì)其發(fā)光結(jié)構(gòu)域的特定氨基酸定點(diǎn)改造，GFP能在可見光的波長(zhǎng)范圍被激發(fā)（吸收區(qū)紅移），且發(fā)光強(qiáng)度比原來強(qiáng)百倍，甚至出現(xiàn)黃色熒光蛋白（YFP)，藍(lán)色熒光蛋白(BFP)等。定點(diǎn)突變技術(shù)的潛在應(yīng)用領(lǐng)域很廣，比如研究蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)、改造酶的不同活性或者動(dòng)力學(xué)特性，改造啟動(dòng)子或者DNA作用元件，引入新的酶切位點(diǎn)，提高蛋白的抗原性或者是穩(wěn)定性、活性、研究蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，以及藥物研發(fā)、基因治療等等方面。本文檔共104頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分BAL31核酸酶消化產(chǎn)生單/雙向突變體

________________________________BAL31是從海洋細(xì)菌Alteromonasespejianasp中分離到的鈣依賴性核酸酶。BAL31有：

3’—5’外切核酸酶活性從雙鏈DNA去除單鏈核苷酸。

5’—3’外切酶活性，有效切割單鏈DNA。消化單鏈DNA的內(nèi)切酶活性。能緩慢切割多種扭曲的

DNA底物兩種外切酶活性使BAL31能消化DNA的兩個(gè)末端以縮短雙鏈本文檔共104頁；當(dāng)前第69頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分BAL31消化產(chǎn)生雙向突變體限制酶U消化產(chǎn)生線性質(zhì)粒DNA在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行BAL31消化已消化好的DNA片段重新環(huán)化本文檔共104頁；當(dāng)前第70頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分BAL31消化產(chǎn)生單向突變體限制酶A消化產(chǎn)生線性質(zhì)粒DNA在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行BAL31消化已消化好的DNA片段進(jìn)行限制酶B消化凝膠電泳純化靶DNA片段本文檔共104頁；當(dāng)前第71頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分凝膠電泳純化靶DNA片段將消化的靶DNA重新克隆進(jìn)新質(zhì)粒載體本文檔共104頁；當(dāng)前第72頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)突變

______________________________TCAGGCT雜交退火DNA聚合酶（klenow）,4dNTPT4DNA連接酶ATP轉(zhuǎn)染大腸桿菌用32P-標(biāo)記的寡核苷酸做雜交探針篩選噬菌斑，分離突變體本文檔共104頁；當(dāng)前第73頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分本文檔共104頁；當(dāng)前第74頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)突變Kunkel法在dut-，ung-F’大腸桿菌中培養(yǎng)重組M13噬菌體，制備單鏈模板DNA模板中尿嘧啶取代了胸腺嘧啶（20-30個(gè)尿嘧啶/模板）磷酸化的誘變寡核苷酸DNA聚合酶，dNTP，DNA連接酶轉(zhuǎn)染野生型大腸桿菌ung+被尿嘧啶取代的DNA鏈被降解由體外合成的DNA鏈所產(chǎn)生的噬斑本文檔共104頁；當(dāng)前第75頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分Kunkel法總結(jié)本文檔共104頁；當(dāng)前第76頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分硫代磷核苷酸誘變法原理：限制性核酸內(nèi)切酶AvaⅠ，

AvaⅡ，

BanⅢ，

HindⅡ，

NciⅠ，

PstⅠ，PvuⅠ等不能切割有硫代磷核苷酸衍生物取代正常核苷酸形成的DNA。

用硫代磷核苷酸如dCTPαS

及dNTPs,在DNA聚合酶催化和DNA連接酶作用下，形成異源dsDNA分子，再用NciⅠ消化該異源dsDNA分子，可獲的高效率的定點(diǎn)突變分子。特點(diǎn)：可獲得很高的突變率（點(diǎn)突變，缺失和插入突變）本文檔共104頁；當(dāng)前第77頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分硫代磷核苷酸誘變法流程雜交退火TCAGGCT硫化核苷酸，DNA聚合酶1.NciⅠ核酸酶2.核酸外切酶DNA聚合酶和連接酶轉(zhuǎn)化并篩選突變體本文檔共104頁；當(dāng)前第78頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分單點(diǎn)定點(diǎn)突變

Stratagene公司QuikChangeSite-directedMutagenesiskit準(zhǔn)備突變的質(zhì)粒必須是從常規(guī)E.coli中經(jīng)純化試劑盒(Miniprep)或者氯化銫純化抽提的質(zhì)粒。設(shè)計(jì)一對(duì)包含突變位點(diǎn)的引物（正、反向），和模版質(zhì)粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循環(huán)延伸”(所謂的循環(huán)延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端終止，再經(jīng)過反復(fù)加熱褪火延伸的循環(huán)，這個(gè)反應(yīng)區(qū)別于滾環(huán)擴(kuò)增，不會(huì)形成多個(gè)串聯(lián)拷貝)，正反向引物的延伸產(chǎn)物退火后配對(duì)成為帶缺刻的開環(huán)質(zhì)粒。DpnI酶切延伸產(chǎn)物，由于原來的模版質(zhì)粒來源于常規(guī)大腸桿菌，是經(jīng)dam甲基化修飾的，對(duì)DpnI敏感而被切碎（DpnI識(shí)別序列為甲基化的GATC，GATC在幾乎各種質(zhì)粒中都會(huì)出現(xiàn)，而且不止一次），而體外合成的帶突變序列的質(zhì)粒由于沒有甲基化而不被切開。本文檔共104頁；當(dāng)前第79頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分操作

流程圖本文檔共104頁；當(dāng)前第80頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分后來推出的QuikChangeXLsite-directedmutagenesiskit則是針對(duì)大于8Kb的質(zhì)粒的定點(diǎn)突變的，通過優(yōu)化試劑特別是其感受態(tài)細(xì)胞（XL10-Gold），使得較大的質(zhì)粒的定點(diǎn)突變也一樣簡(jiǎn)單。QuikChange由于操作簡(jiǎn)單快速，效率高（>80%）而受到普遍歡迎，光是2012年的前9個(gè)月就有超過400篇發(fā)表的論文中用到這個(gè)產(chǎn)品。本文檔共104頁；當(dāng)前第81頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分多位點(diǎn)定點(diǎn)突變?cè)诟脑烀傅幕钚曰蛘邉?dòng)力學(xué)特性，研究蛋白之間的相互作用位點(diǎn)等研究過程中，單點(diǎn)突變不能滿足實(shí)驗(yàn)的需要，重復(fù)進(jìn)行單點(diǎn)突變也非常浪費(fèi)時(shí)間。因而Stratagene公司又推出了QuikChangeMultiSite-DirectedMutagenesiskit。最多一次實(shí)驗(yàn)可以引入5個(gè)定點(diǎn)突變。原理就是準(zhǔn)備多個(gè)帶突變的引物（同方向，對(duì)同一單鏈模版），退火后全部突變引物（不超過5個(gè)）都結(jié)合在同一環(huán)狀單鏈模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一個(gè)引物就停止，各片斷經(jīng)連接成環(huán)，和單鏈模版組成雜和環(huán)，DpnI消化雙鏈模版，也消化雜和環(huán)中的模版，只留下新合成的帶多個(gè)突變的單鏈環(huán)（mutantssDNA），得以轉(zhuǎn)化E.coli，形成雙鏈質(zhì)粒。資料表明，引入3個(gè)定點(diǎn)突變的效率為60%，5個(gè)定點(diǎn)突變的效率為30%。得到的其他質(zhì)粒是帶有較少定點(diǎn)突變的質(zhì)粒。這樣，一次實(shí)驗(yàn)可以得到不同數(shù)目突變的質(zhì)粒，對(duì)于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系也是有用的。本文檔共104頁；當(dāng)前第82頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分PCR定點(diǎn)突變

____________重疊延伸PCR誘變

試驗(yàn)概要：擴(kuò)增的DNA片段在預(yù)設(shè)突變處重疊(2次PCR)，再與兩個(gè)與原始片段互補(bǔ)的側(cè)翼引物進(jìn)行第3次PCR特點(diǎn)：需兩個(gè)突變誘導(dǎo)引物，兩個(gè)側(cè)翼引物，3次PCR。誘變率極高大引物PCR定點(diǎn)誘變?cè)囼?yàn)概要：兩輪PCR，2個(gè)側(cè)翼引物，其中一個(gè)為預(yù)設(shè)突變引物，第一輪PCR后，大引物不需純化，第一輪退火溫度較低，第二輪較高（72℃）特點(diǎn)：簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)，平均誘變效率可達(dá)80％本文檔共104頁；當(dāng)前第83頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分PCR原理示意圖本文檔共104頁；當(dāng)前第84頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分PA5’PA’5’PA5’PA’5’PA5’PA’5’PA5’PA’5’PB5’PC5’PA5’PB5’PA’5’PC5’5’5’PCR-1PCR-1PCR-2PCR-2混合，變性，退火重疊延伸PCR定點(diǎn)突變本文檔共104頁；當(dāng)前第85頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分5’5’5’5’PB5’PC5’5’5’PCR-3DNA聚合酶本文檔共104頁；當(dāng)前第86頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分本文檔共104頁；當(dāng)前第87頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分大引物PCR定點(diǎn)誘變5‘3’5‘3’引物2引物3PCR產(chǎn)生大引物引物1突變體PCR2本文檔共104頁；當(dāng)前第88頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分本文檔共104頁；當(dāng)前第89頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分五、突變的檢測(cè)

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strandconformationpolymorphism,SSCP

）等位基因特異性PCR（allelespecificPCR

）毛細(xì)管電泳法（capillaryelectrophoresis）測(cè)序（sequencing）DNA芯片（chip）本文檔共104頁；當(dāng)前第90頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分PCR-RFLP:多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)--限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RestrictionfragmentlengthPolymorphism，RFLP)

原理：PCR產(chǎn)物－限制性內(nèi)切酶切－多態(tài)性分析，DNA發(fā)生重排后，酶切位點(diǎn)發(fā)生改變。

優(yōu)點(diǎn)：具有分辯率高，無需標(biāo)記,重復(fù)性好，簡(jiǎn)便快速直觀等。主要用于核酸變異性分析與比較,微生物的分群分型分亞型，癌基因分析，遺傳病的診斷等。

局限：只能應(yīng)用突變引起限制性酶切位點(diǎn)改變的情況下，一次只能完成一個(gè)特定位點(diǎn)突變篩選，檢測(cè)效率低。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性本文檔共104頁；當(dāng)前第91頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分PCR-RFLP原理示意本文檔共104頁；當(dāng)前第92頁；編輯于星期三\1點(diǎn)57分聚合酶鏈反應(yīng)一單鏈構(gòu)象多態(tài)性（

PCR-SSCP）原理：是將經(jīng)擴(kuò)增的D