天麻萌發(fā)菌蜜環(huán)菌培養(yǎng)技術規(guī)程

前??言 III1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術語和定義 13.1萌發(fā)菌 13.2蜜環(huán)菌 13.3菌材 13.4母種 13.5原種 13.6栽培種 14萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌的培養(yǎng) 24.1培養(yǎng)條件 24.2菌種培養(yǎng) 24.2.1萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌一級菌種（母種）培養(yǎng) 24.2.1.1PDA培養(yǎng)基制備 24.2.1.2菌種選擇 24.2.1.3分離方法 24.2.1.4菌種純化 34.2.2萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌二級菌種（原種）培養(yǎng) 34.2.2.1萌發(fā)菌二級菌種培養(yǎng) 34.2.2.2蜜環(huán)菌二級菌種培養(yǎng) 34.2.3萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌三級菌種（栽培種）培養(yǎng) 34.2.3.1萌發(fā)菌三級菌種培養(yǎng) 34.2.3.2蜜環(huán)菌三級菌種培養(yǎng) 34.2.4菌種保藏 34.2.4.1一級菌種保藏 34.2.4.2二級菌種和三級菌種保藏 34.3蜜環(huán)菌枝培養(yǎng) 44.3.1樹種選擇 44.3.2培養(yǎng)時間 44.3.3培養(yǎng)方法 44.4蜜環(huán)菌材培養(yǎng) 44.4.1菌種準備 44.4.2樹種選擇 44.4.3培養(yǎng)時間 44.4.4木材準備 44.4.5場地選擇 44.4.6培養(yǎng)方法 44.4.7培養(yǎng)管理 54.4.7.1調節(jié)濕度 54.4.7.2調節(jié)溫度 55菌種質量 55.1母種質量 55.1.1直接觀察 55.1.2顯微鏡檢查 55.1.3觀測菌絲長速 55.1.4耐高溫測試 55.1.5吃料能力鑒定 55.2栽培種質量 55.2.1質量指標 55.2.2驗收規(guī)則 66標志、包裝、運輸、貯藏 66.1標志 66.2包裝 66.3運輸 66.4貯藏 6前??言本標準根據(jù)GB/T1.1－給出的規(guī)則編制。本標準由隴南市農(nóng)牧局提出。本標準起草單位:隴南市農(nóng)業(yè)科學研究所、甘肅省中草藥資源開發(fā)利用工程技術研究中心本標準主要起草人：王義存、喬旭、張杰、楊廣孝、楊正文、尹玉保、武建華隴南市天麻萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌培養(yǎng)技術規(guī)程范圍本標準規(guī)定了隴南市天麻萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌培養(yǎng)技術的術語和定義、萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌菌種的培養(yǎng)。本標準適用于隴南市天麻主產(chǎn)區(qū)及其它同類氣候環(huán)境區(qū)域天麻萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌固體菌種的生產(chǎn)。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB191包裝儲運圖示標志GB5749生活飲用水衛(wèi)生標準GB9687食品包裝用聚乙烯成型品衛(wèi)生標準GB9688食品包裝用聚丙烯成型品衛(wèi)生標準NY5099無公害食品食用菌栽培基質安全技術要求術語和定義萌發(fā)菌天麻（GastrodiaelataBl.）種子的萌發(fā)靠小菇屬(Mycena)一類真菌菌絲侵染種胚提供營養(yǎng)而萌發(fā)，這類促進天麻種子萌發(fā)的真菌稱為天麻種子萌發(fā)菌。主要包括：紫萁小菇(Mycenaosmundicola)、石斛小菇(Mycenadendrobii)、蘭小菇(Mycenaorchicola)和開唇小菇(Mycenaanoectochila)。蜜環(huán)菌蜜環(huán)菌（Armillariamellea）是擔子菌綱傘菌目真菌，天麻種子萌發(fā)后，其所需營養(yǎng)逐漸由蜜環(huán)菌供給，是天麻不可缺少的互惠共生菌。菌材生有蜜環(huán)菌或萌發(fā)菌的木棒、樹枝、樹葉統(tǒng)稱為菌材。菌材是培養(yǎng)天麻所必備的材料，包含：菌棒：指生長有蜜環(huán)菌的木棒。菌棒采用直徑4～10cm的木棒，主要用于培養(yǎng)天麻。菌枝：指生長有蜜環(huán)菌的樹枝。菌枝采用直徑2～3cm的樹枝，是培養(yǎng)天麻的補充材料。菌葉：指生長有萌發(fā)菌的樹葉。菌葉是萌發(fā)菌三級種的主要組成。母種從菌索、子實體、著生菌絲體的天麻塊莖，經(jīng)各種方法分離得到的純菌絲體培養(yǎng)物及其繼代培養(yǎng)物，以玻璃試管為培養(yǎng)容器和單位，也稱一級種、試管種。原種由母種移植、擴大培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物。常以菌種瓶或聚丙烯塑料袋為容器，也稱二級種。栽培種由原種移植、擴大培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物。常以塑料袋為容器。栽培種只能用于栽培，不可再次擴大繁殖菌種。萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌的培養(yǎng)培養(yǎng)條件萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌的培養(yǎng)必須在無菌條件下進行，需要有接種室、接種箱或超凈工作臺、接種工具；菌種培養(yǎng)室、恒溫培養(yǎng)箱、菌種培養(yǎng)架；高壓蒸氣滅菌鍋、電熱干燥箱，紫外滅菌燈；菌種保藏用電冰箱；化學藥品，試管、天平等。菌種和基質質量標準應符合NY5099的規(guī)定和要求。使用水源符合GB5749的要求。菌種培養(yǎng)萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌一級菌種（母種）培養(yǎng)PDA培養(yǎng)基制備PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml、pH5～6。配制方法：將馬鈴薯切片，加水煮沸30min，用紗布過濾，取濾液1000ml并放入瓊脂加熱，使之全部融化，最后加入葡萄糖，溶解后調節(jié)pH為5～6。然后將培養(yǎng)基趁熱分裝于試管內，經(jīng)高壓滅菌（1.5kg/cm2）30min。取出后按25°斜度放置冷卻后接種。消毒滅菌：接種室滅菌每立方米用40%的甲醛溶液8ml，高錳酸鉀5g進行熏蒸。先關閉窗戶，取甲醛溶液裝入容器中，再放入高錳酸鉀，人隨之離開接種室，關閉房門，熏蒸1h即可。熏蒸后應隔1d使用。菌種選擇使用正規(guī)菌種廠生產(chǎn)的優(yōu)良品種；或采收天麻種子發(fā)芽后的原球莖、蘭科植物中的根部、誘導培養(yǎng)萌發(fā)菌子實體。用以上材料分離培養(yǎng)菌種。分離方法組織分離萌發(fā)菌分離：將天麻種子萌發(fā)的原球莖用自來水沖洗干凈，然后用無菌水沖洗數(shù)次，置于滅過菌的小培養(yǎng)皿中，原球莖用0.1％氯化汞溶液浸泡消毒1～2min，用滅菌小剪刀剪成2～3段，在金霉素液中蘸一下，即可接人PDA平面培養(yǎng)基中，置于25℃恒溫箱內培養(yǎng)，3～10d即可發(fā)出菌絲。蜜環(huán)菌分離：將蜜環(huán)菌索或天麻塊莖，或天麻原球莖，或蘭科植物的根分別用水洗凈表面泥土，然后切取需要的部份組織，用無菌水沖洗3次，放入0.1%氯化汞溶液浸泡1min；再用無菌水沖洗3次，洗去殘存的藥液，置于無菌培養(yǎng)皿內?；驅⒕鞯炔牧戏謩e剪成1cm長的小段或小塊，在青霉素液（20μg/ml）中浸片刻，用滅菌濾紙吸去表面附著水液，然后接種于斜面培養(yǎng)基上，置25℃恒溫培養(yǎng)，3～7天左右，開始分別長出白色菌絲和菌索。分離子實體時，用無菌水沖洗消毒殘存藥液后，用滅菌濾紙吸凈水珠，再用解剖刀從菌蓋中縱向剖開子實體，在菌柄及菌蓋交界處取其0.5cm的一塊組織置于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。孢子分離將開傘的子實體截去菌柄的下半部，用70%的酒精在菌蓋表面及菌柄部分進行揩擦消毒，然后菌褶向下插在孢子收集裝置的支架上。將支架放于無菌培養(yǎng)皿中，用鐘罩或大燒杯罩住以收集孢子。孢子落于皿內后，用接種針挑取少許，接于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)。菌種純化萌發(fā)菌選用菌落生長速度較為一致的菌絲體，用消毒的接種鏟連同培養(yǎng)基一起切取菌絲，轉移到新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，重復轉接可獲純菌種。蜜環(huán)菌在培養(yǎng)基上接種點處剛產(chǎn)生菌索分枝時，選擇其中生長旺盛而幼嫩的菌索，用接種鏟截取長2～3mm移入斜面培養(yǎng)基上，在25℃恒溫下培養(yǎng)，菌索長滿培養(yǎng)基后即為純化的一級菌種。萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌二級菌種（原種）培養(yǎng)萌發(fā)菌二級菌種培養(yǎng)培養(yǎng)基成分：青、樺木等闊葉樹的木屑70%、麩皮或米糠26%、蔗糖1%、石膏粉1%、磷酸二氫鉀1.5%、硫酸鎂0.5%，加水適量。將以上成分充分拌勻，含水量65%，即用手捏培養(yǎng)基可略有滴水為度，然后裝瓶，在瓶中心打直徑1cm的圓孔，深達培養(yǎng)基2/3處。蓋好瓶蓋，高壓蒸氣滅菌（1.5kg/cm2）1h，冷卻后接種。在接種室內，將菌絲連同約蠶豆大小的母種，接于培養(yǎng)基的圓孔中，1支母種可接原種5～10瓶（袋）左右，蓋好瓶蓋后置25℃培養(yǎng)室培養(yǎng)。蜜環(huán)菌二級菌種培養(yǎng)培養(yǎng)基成分為闊葉樹鋸木屑30%，麥麩10%及小樹枝段，水適量。制作時，先將手指粗的樹枝截成長1.5cm的小段，在水中浸泡12h充分吸水，然后與鋸木屑、麥麩拌勻、加水濕透，裝入500ml廣口瓶中，每瓶裝入樹枝段50～60段，以瓶容量的4/5為宜，再加水少量，蓋瓶蓋后高壓滅菌（1.5kg/cm2）1h，冷卻后，接入母種，置于25℃恒溫培養(yǎng)，30天～45天蜜環(huán)菌絲和菌索可長滿全瓶。萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌三級菌種（栽培種）培養(yǎng)萌發(fā)菌三級菌種培養(yǎng)取殼斗科植物落葉70%、木屑10%、麥麩15%、硫酸鎂0.5%，磷酸二氫鉀1.5%、尿素1%、蔗糖1%、石膏1%，水適量。經(jīng)拌勻后裝袋，高壓蒸氣滅菌（1.5kg/cm2）1h，冷卻后接入二級菌種，封好袋子，移入培養(yǎng)室培養(yǎng)。蜜環(huán)菌三級菌種培養(yǎng)培養(yǎng)料和培養(yǎng)方法與二級菌種培養(yǎng)相同。在高壓滅菌冷卻后，每瓶接入二級樹枝菌種1～2段，在25℃恒溫培養(yǎng)30d～45d，蜜環(huán)菌絲和菌索可長滿全瓶，可用于培養(yǎng)菌枝和菌材。菌種保藏一級菌種保藏當一級菌種長滿試管后，用牛皮紙包扎好，放入0℃～4℃的冰箱中，每隔3個月轉管培養(yǎng)1次。使用時，應從冰箱中取出先經(jīng)適應常溫后再轉管培養(yǎng)。包裝儲運標志符合GB191的要求。二級菌種和三級菌種保藏二、三級菌種可在冷涼、干燥、清潔的室內保藏，室溫在0℃～10℃，保藏期2～3個月。蜜環(huán)菌枝培養(yǎng)樹種選擇用作菌材的樹木應是闊葉落葉樹種。常見來培養(yǎng)菌材的樹種有：樺樹、野櫻桃、法國梧桐、桃樹、青崗櫟、板栗、水冬瓜、刺槐、槲櫟、橡樹等，以甜、澀味、質硬耐腐的樹種為宜。培養(yǎng)時間應根據(jù)需要，一般應在菌材培養(yǎng)期之前2個月進行。培養(yǎng)方法選擇直徑1～2cm的樹枝，斜砍成長3～4cm的小段。其次，挖長2米，寬1米，深30cm的坑；坑底先鋪1cm厚濕潤樹葉，然后擺一層樹枝，再放入菌種，在菌種上再擺一層樹枝，蓋一薄層沙土，以覆蓋填滿樹枝間空隙為度?？梢来味逊?～10層，蓋10cm厚沙土，再蓋一層樹葉保溫保濕。一般2個月可培養(yǎng)好菌種。蜜環(huán)菌材培養(yǎng)菌種準備菌枝是培養(yǎng)菌材最好的菌種。選擇菌枝表面附著棕紅色、幼嫩、有白色生長點、無雜菌污染的做菌種。也可用培養(yǎng)好的優(yōu)質菌材作菌種。樹種選擇同4.3.1。培養(yǎng)時間選擇在秋、冬季至春初培養(yǎng)菌材。木材準備選直徑3～5cm的樹木，鋸成長20cm的木段，若樹木直徑在10cm以上，應將木段劈成2～4塊，在木段的一面或兩面每隔3～4cm砍一個魚鱗口，深度至木質部為度。場地選擇應選擇在天麻種植場地附近，減少菌材搬運；坡度應小于20°和向陽的山地，土壤以土層深度，疏松透氣，排水良好的砂壤土，要有灌溉水源的地方為宜。培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法有多種，現(xiàn)以窖培法為例。挖窖長2m，寬1米，深30cm。將窖底挖松整平，鋪一層1cm厚的樹葉，平放一層樹木段，如是干木段應提前一天用水浸泡24h，在樹木段之間放入菌枝4～5根，灑一些清水，澆濕樹木段和樹葉，然后用沙土或腐殖土填滿樹木段間空隙，并略高于樹木段為宜。再放入第二層樹木段，樹木段間放入菌枝后，如上法蓋一層土。如此依次放置多層，蓋土厚10cm成龜背狀略高于地面，最后覆蓋樹葉保溫保濕。培養(yǎng)管理調節(jié)濕度主要是保持菌材窖內填充物及樹木段內適宜的含水水量即50%左右。應注意勤檢查，根據(jù)培養(yǎng)窖內濕度變化進行澆水和排水。調節(jié)溫度蜜環(huán)菌索在6℃～28℃能夠生長，超過30℃生長受抑制，同時雜菌易繁殖。在18℃～20℃溫度條件適宜蜜環(huán)菌生長。在春秋低溫季節(jié)，可覆蓋塑料薄膜提高窖內溫度。培養(yǎng)窖上蓋枯枝落葉或草能夠保溫保濕。菌種質量母種質量直接觀察對引進的菌種，首先用肉眼觀察包裝是否合乎要求，棉塞有無松動，試管、玻璃瓶或塑料袋有無破損，棉塞和管瓶或袋中有無雜菌和病蟲侵染，菌絲色澤是否正常，有無發(fā)生老化，受光面是否產(chǎn)生子實體，含水量是否標準等