植物源農(nóng)藥的提取分離及結構鑒定修改

一、基本概念1、提取：利用適當?shù)娜軇┗蚍椒?，將所要成分盡可能從原料中完全提出的過程。2、分離：將提取物中所含的各種成分一一分開，并將得到的單體加以精制的過程。第一節(jié)植物源農(nóng)藥的提取本文檔共85頁；當前第1頁；編輯于星期一\16點20分

水親水性有機溶劑親脂性有機溶劑二、提取方法超臨界流體萃取法（SFE）水蒸氣蒸餾法溶劑提取法升華法壓榨法溶劑本文檔共85頁；當前第2頁；編輯于星期一\16點20分（一）溶劑提取法根據(jù)天然成分的溶解性不同，選用對所需成分溶解度大而對其他成分溶解度小的溶劑，將所需成分從生物材料中溶解出來的一種提取方法。

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溶劑提取是指溶劑進入生物體細胞，溶解或分散其有用物質(zhì)而變成浸出物的全過程。包括浸潤、解吸和擴散三個階段。1、溶劑提取法的原理選擇溶劑依據(jù)相似相溶原理。本文檔共85頁；當前第4頁；編輯于星期一\16點20分

浸潤：滲透階段溶劑通過細胞壁滲透到細胞中。解吸：溶解階段細胞內(nèi)容物與細胞組織之間有親和力，溶劑破除這種親和力。擴散：置換階段利用細胞內(nèi)的滲透力產(chǎn)生的壓差而抽提出來，用溶劑占領內(nèi)容物的位置而將內(nèi)容物置換出來。本文檔共85頁；當前第5頁；編輯于星期一\16點20分

擴散過程表達式：dt:擴散時間F：擴散面積，以粉碎度表示濃度差D：擴散系數(shù)ds:在dt時間內(nèi)的擴散量本文檔共85頁；當前第6頁；編輯于星期一\16點20分2、選擇溶劑的要點*對所要成分溶解度大*沸點適中容易回收*低毒安全*廉價天然產(chǎn)物成分中，萜、甾等大環(huán)、稠環(huán)化合物極性小，易溶于氯仿、乙醚等；糖、苷等易溶于水、乙醇等極性溶劑中；酸堿性成分因存在狀態(tài)不同溶解性不同。最常用的溶劑為乙醇。本文檔共85頁；當前第7頁；編輯于星期一\16點20分3、溶劑的分類*強極性溶劑：水*親水性有機溶劑：能與水任意混溶（甲醇、乙醇、丙酮）*親脂性有機溶劑：不與水任意混溶，可分層（正丁醇、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、環(huán)己烷、石油醚）常用溶劑的極性大小順序：石油醚<四氯化碳<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇（甲醇）<水本文檔共85頁；當前第8頁；編輯于星期一\16點20分4、化合物的結構與親水性、親脂性的關系（1）分子結構中親水性基團（羧基、羥基、氨基）越多，極性越大，親水性越強，反之則親脂性越強。（2）分子中非極性部分越大，碳鏈越長或結構越大，則親脂性越強。（3）結構母核相同的成分，分子中功能基的極性越大，或極性功能基數(shù)量越多，則整個分子的極性越大，親水性越強，親脂性越弱。本文檔共85頁；當前第9頁；編輯于星期一\16點20分5、溶劑的選擇

(1)水：為價廉、易得、使用安全的強極性溶劑。適于提取無機鹽、糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機酸鹽、生物堿鹽、苷類等。(2)親水性有機溶劑：以乙醇最常用。高濃度提取親脂性成分，低濃度提取親水性成分。(3)

親脂性有機溶劑：具有較強的選擇性，對揮發(fā)油、油脂、葉綠素、樹脂、內(nèi)酯、某些生物堿及一些苷元均可提取出來。優(yōu)缺點：沸點低，濃縮回收方便，但易燃、有毒、價貴，穿透力差。本文檔共85頁；當前第10頁；編輯于星期一\16點20分6、溶劑提取的方法溶劑提取的方法連續(xù)回流提取法煎煮法（煎中藥）滲漉法浸漬法（泡藥酒）本文檔共85頁；當前第11頁；編輯于星期一\16點20分

以水或稀醇反復提取，適于遇熱易破壞或揮發(fā)性成分及含淀粉、粘液質(zhì)較多的材料。（1）浸漬法

民間的藥酒浸制。本文檔共85頁；當前第12頁；編輯于星期一\16點20分

（2）滲漉法

以稀乙醇或酸、水作溶劑，先浸后滲，提取效率高于浸漬法。但溶劑用量大，對原料粒度要求高。實驗室簡單滲漉裝置本文檔共85頁；當前第13頁；編輯于星期一\16點20分

（3）煎煮法

以水為溶劑，對遇熱易破壞和揮發(fā)性成分有影響，對含多量淀粉、黏液質(zhì)的原料也不適用。

傳統(tǒng)的中藥煎制。本文檔共85頁；當前第14頁；編輯于星期一\16點20分

（5）連續(xù)回流提取法

循環(huán)使用揮發(fā)性的有機溶劑，在脂肪提取器中連續(xù)提取的方法。提取效率高，節(jié)省溶劑。但不適于熱不穩(wěn)定成分的提取。

也可采用混合溶劑，常用的有水和乙醇。不同比例的溶劑可提出不同成分，如CHCl3-C2H5OH(95:5) 可提取出強心甙、有機酸、葉綠素等。本文檔共85頁；當前第15頁；編輯于星期一\16點20分

索式提取器的組成本文檔共85頁；當前第16頁；編輯于星期一\16點20分索式提取器連續(xù)回流提取

萃取瓶（圓底燒瓶）冷凝管脂肪提取器濾紙筒虹吸管蒸汽管本文檔共85頁；當前第17頁；編輯于星期一\16點20分

7、影響溶劑提取法的因素（1）生物材料的粉碎度

材料細，面積大，擴散快，效果好。但是太細，吸附作用大，易糊化，擴散慢，同時植物細胞也會遭受破壞，大量蛋白質(zhì)、淀粉被提出，產(chǎn)生沉淀或膠束狀，影響提取?；ā⑷~可適當粗些，皮、莖、根宜細些。本文檔共85頁；當前第18頁；編輯于星期一\16點20分

（2）提取溫度

一般使用常溫，在不破壞有效成分的條件下加熱不要超過80?C。

溫度低提取時的雜質(zhì)少，溫度高時提取效率高；但含淀粉、粘液質(zhì)較多的材料，水提時避免熱提。本文檔共85頁；當前第19頁；編輯于星期一\16點20分

（3）提取時間

以提完為準，是否完全可以提取也做定性實驗，或薄層層析檢測，或以液體顏色判斷。

根據(jù)檢測結果確定是否需要延長提取時間。本文檔共85頁；當前第20頁；編輯于星期一\16點20分

（4）濃度差

根據(jù)擴散原理，造成提取液的濃度差可以提高提取的效率。

可采取的措施有：攪拌、更換溶劑。本文檔共85頁；當前第21頁；編輯于星期一\16點20分

（5）新技術的使用

超聲波、微波促提技術的應用，可以加快提取速度，提高提取效率。

目前實驗室廣泛使用的超聲波萃取儀是將超聲波換能器產(chǎn)生的超聲波通過介質(zhì)（通常是水）傳遞并作用于樣品，這是一種間接的作用方式，聲振強度較低，必須通過增加超聲波發(fā)生器功率（3300W）來提高萃取效率。但較大的超聲波功率，又會發(fā)出令人感覺不適的噪音。

超聲波促提原理：本文檔共85頁；當前第22頁；編輯于星期一\16點20分

為物理過程，無化學反應，不改變生物活性，高能量的超聲波產(chǎn)生的強大壓力，可造成植物細胞壁及生物體破裂，導致胞內(nèi)物質(zhì)釋放、擴散、溶解。實驗室用小型超聲儀工業(yè)生產(chǎn)用超聲儀本文檔共85頁；當前第23頁；編輯于星期一\16點20分

微波輔助技術是利用樣品中目標物分子在微波電磁場的作用下，從原來的熱運動狀態(tài)轉為跟隨微波交變電磁場而快速排列取向，將微波能量轉化為樣品內(nèi)的能量，從而加速目標物從固相進入溶劑相的過程。微波促提原理：本文檔共85頁；當前第24頁；編輯于星期一\16點20分

具有穿透力強，加熱效率高，操作簡便、快速、節(jié)能、高效等特點。缺點：化學成分的結構易發(fā)生變化，繼而導致生物活性的改變。

微波提取尤其要注意能量的控制，被提取物質(zhì)的穩(wěn)定性。工業(yè)生產(chǎn)用微波提取罐本文檔共85頁；當前第25頁；編輯于星期一\16點20分

（二）水蒸氣蒸餾法

適于具有揮發(fā)性，能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞的有效成分結構的提取。如揮發(fā)油、小分子生物堿、酚類、游離醌類等。

水蒸氣蒸餾法是將水蒸氣通入不溶或難溶于水但有一定揮發(fā)性的有機物質(zhì)中，使該有機物在低于100℃

的溫度下，隨著水蒸氣一起蒸餾出來。原理：道爾頓分壓定律本文檔共85頁；當前第26頁；編輯于星期一\16點20分

水蒸氣蒸餾裝置

常用的水蒸氣蒸餾裝置，包括水蒸氣發(fā)生器、蒸餾、冷凝和接受器四個部分。本文檔共85頁；當前第27頁；編輯于星期一\16點20分

最常用的是二氧化碳超臨界萃取法，環(huán)保、成本低、提取分離一步完成。分子的極性、沸點和分子量的大小與其在二氧化碳超臨界流體中的溶解性密切相關。（三）超臨界流體萃取法

超臨界二氧化碳流體(SFE-CO2)臨界點(31.1℃)相當接近室溫本文檔共85頁；當前第28頁；編輯于星期一\16點20分

利用超臨界條件下流體的特殊性能對樣品進行提取，是20世紀80年代迅速發(fā)展起來的一種提取方法。

超臨界流體不但具有與液體接近的密度，有很強的穿透性，接近或超過溶劑的提取效率；而且具有與氣體相近的擴散的性能，提取效率越高。常用的超臨界流體有CO2、乙烷、丙烷等。本文檔共85頁；當前第29頁；編輯于星期一\16點20分

與普通有機溶劑提取法相比，超臨界CO2萃取技術具有無毒、常溫、不易燃、無污染等特點，可確保原有的色、香、味不因受熱破壞；更為可貴的是在萃取過程中可同時對萃取物進行分離純化。該技術適宜于萃取高價值的油脂（包括天然功能性油脂）、精油、內(nèi)酯等極性較低的天然產(chǎn)物有效成分。

超臨界CO2提取的特點。本文檔共85頁；當前第30頁；編輯于星期一\16點20分

CO2

鋼瓶

冷溫槽

高壓泵恒溫箱

控溫面板

接受瓶

流量計

CO2

原料

玻璃珠

脫脂棉

萃取柱

超臨界CO2

萃取實驗裝置示意圖本文檔共85頁；當前第31頁；編輯于星期一\16點20分

液體CO2由高壓泵加壓到萃取工藝要求的壓力并傳送到換熱器，將CO2流體加溫到萃取工藝所需溫度后進入萃取器，在此完成萃取過程。負載溶質(zhì)的CO2流體在分離器中改變溫度壓力，溶解度降低使萃取物得以分離。分離萃取物后的CO2流體再經(jīng)換熱器液化后回到儲罐中循環(huán)使用。超臨界CO2提取操作流程本文檔共85頁；當前第32頁；編輯于星期一\16點20分

20世紀50年代初進入試驗階段，如從石油中脫瀝青。

70、80年代SFE用于食品香料的提取。

90年代從植物藥中提取目標成分，如從蛇床子、桑白皮、茵陳蒿中提取活性成分。本文檔共85頁；當前第33頁；編輯于星期一\16點20分

（四）升華法

將固體物質(zhì)受熱氣化，遇冷又凝結為固體的方法。樟木中的樟腦，茶葉中的咖啡因的提取。2-莰酮咖啡因本文檔共85頁；當前第34頁；編輯于星期一\16點20分

1、將茶葉與95%乙醇回流2h；2、濾出茶葉，濃縮提取液至適當體積；3、濃縮液與生石灰粉混合，攪成漿狀，用蒸發(fā)皿在蒸汽浴上蒸干，除去水份；4、在蒸發(fā)皿上蓋一張刺孔向上的濾紙，再在濾紙上罩一個大小適合且頸部塞有棉花的漏斗；5、用酒精燈隔石棉網(wǎng)加熱，適當控制溫度，白色咖啡因在濾紙上結晶。實驗室提取咖啡因步驟：本文檔共85頁；當前第35頁；編輯于星期一\16點20分

本文檔共85頁；當前第36頁；編輯于星期一\16點20分升華本文檔共85頁；當前第37頁；編輯于星期一\16點20分

借助機械外力的作用，將油脂從榨料中擠壓出來的過程。在壓榨過程中，主要發(fā)生的是物理變化，如物料變形、油脂分離、摩擦發(fā)熱、水分蒸發(fā)等。但由于溫度、水分、微生物等的影響，同時也會產(chǎn)生某些生物化學方面的變化，如蛋白質(zhì)變性、酶的鈍化和破壞、某些物質(zhì)的結合等。壓榨時，榨料粒子在壓力作用下內(nèi)外表面相互擠緊，致使其液體部分和凝膠部分分別產(chǎn)生兩個不同過程，即油脂從榨料空隙中被擠壓出來及榨料粒子變形形成堅硬的油餅。（五）壓榨法本文檔共85頁；當前第38頁；編輯于星期一\16點20分

第二節(jié)天然產(chǎn)物的分離與精制一、一般分離方法1、萃取法2、沉淀分離法3、結晶和重結晶4、膜分離二、柱色譜法1、吸附柱色譜2、分配柱色譜3、離子交換柱色譜4、凝膠柱色譜5、大孔樹脂柱色譜6、親和柱色譜本文檔共85頁；當前第39頁；編輯于星期一\16點20分

1)影響分離的因素①分離因子β，分配系數(shù)Kβ=Ka/Kb，Ka>Kb

K=CU/CL

CU、CL為被分離物質(zhì)在上相和下相中濃度

1、萃取法

利用混和物中各成分在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)不同而達到分離的方法。本文檔共85頁；當前第40頁；編輯于星期一\16點20分

根據(jù)β值的大小可決定分離采用的方法

β>100,簡單的一次萃取，可基本分離。β≈10，數(shù)次乃至10余次萃取，CCD法β≦2，100次以上萃取，DCCC法，HSCCC法β≈1，不能分離可以根據(jù)PC法計算β值，選擇理想的分離條件。本文檔共85頁；當前第41頁；編輯于星期一\16點20分2.沉淀分離法根據(jù)溶解度的不同，控制溶液條件使溶液中的化合物或離子分離的方法統(tǒng)稱為沉淀分離法。方法的主要依據(jù)是溶度積原理。本文檔共85頁；當前第42頁；編輯于星期一\16點20分根據(jù)沉淀劑的不同，沉淀分離也可以分成用無機沉淀劑的分離法、用有機沉淀劑的分離法和共沉淀分離富集法。沉淀分離法和共沉淀分離法的區(qū)別主要是：沉淀分離法主要使用于常量組分的分離（毫克量級以上）；而共沉淀分離法主要使用于痕量組分的分離（小于1mg/mL）。常用的沉淀分離方法及試劑1、無機沉淀劑氫氧化物、硫化物、其它沉淀劑。2、有機沉淀劑草酸、銅試劑、銅鐵試。本文檔共85頁；當前第43頁；編輯于星期一\16點20分3.結晶和重結晶在化學里面，熱的飽和溶液冷卻后，溶質(zhì)以晶體的形式析出，這一過程叫結晶。重結晶是將晶體溶于溶劑或熔融以后，又重新從溶液或熔體中結晶的過程。重結晶可以使不純凈的物質(zhì)獲得純化，或使混合在一起的鹽類彼此分離。本文檔共85頁；當前第44頁；編輯于星期一\16點20分重結晶提純法的一般過程1、溶劑選擇2、固體物質(zhì)的溶解3、雜質(zhì)的除去4、晶體的析出5、晶體的收集和洗滌6、晶體的干燥本文檔共85頁；當前第45頁；編輯于星期一\16點20分4.膜分離利用膜的選擇性分離實現(xiàn)料液的不同組分的分離、純化、濃縮的過程稱作膜分離①液膜分離過程分為乳化液膜和固定液膜的分離過程；②合成膜的分離過程包括微過濾、超過濾、反滲透、氣體滲透分離、滲透蒸發(fā)、滲析及電滲析等過程。本文檔共85頁；當前第46頁；編輯于星期一\16點20分

二：柱色譜1.吸附柱色譜

吸附分類物理吸附：無選擇性吸附，吸附-解吸附發(fā)生迅速，吸附劑如硅膠、氧化鋁、活性炭等；化學吸附：不可逆吸附，如堿性氧化鋁對酚酸性成分的吸附；酸性硅膠對生物堿的吸附等；半化學吸附：聚酰胺對酚酸類、醌類的氫鍵吸附。本文檔共85頁；當前第47頁；編輯于星期一\16點20分

吸附原理：相似相吸

影響吸附過程的三要素：吸附劑（固定相）溶質(zhì)（被分離物質(zhì)）溶劑（洗脫劑、展開劑、流動相）

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2、硅膠、氧化鋁

極性吸附劑：載樣量大，吸附力強硅膠：有中性、酸性之分，適用于各類成分分離。氧化鋁：有中性、酸性、堿性之分，不適合于分離酸性成分，多用于分離生物堿。本文檔共85頁；當前第49頁；編輯于星期一\16點20分

①被分離物質(zhì)吸附力與結構的關系

被分離物質(zhì)極性大，吸附力強，難洗脫，Rf值小。官能團極性大小排列順序：-COOH>Ar-OH>R-OH>R-NH2、RNHR’、RNR’R’’>RCONRR’>RCHO>RCOR’>RCOOR’>ROR’>RH②溶劑（洗脫劑）的極性與洗脫力的關系洗脫劑極性越大，洗脫力越強；本文檔共85頁；當前第50頁；編輯于星期一\16點20分

大黃酸大黃素大黃酚酸性最強酸性其次酸性最弱溶于NaHCO3溶于Na2CO3溶于NaOH本文檔共85頁；當前第51頁；編輯于星期一\16點20分

例：從黃花夾竹桃果仁中分離到七種強心苷成分，根據(jù)極性大小推測從硅膠柱上的洗脫順序。

名稱RR’黃夾苷ACHO(D-glc)2黃夾苷BCH3(D-glc)2黃夾次苷ACHOH黃夾次苷BCH3H黃夾次苷CCH2OHH黃夾次苷DCOOHH單乙酰黃夾次苷BCH3H

單乙酰黃夾次苷BR’’=COCH3, 其它R’’=H本文檔共85頁；當前第52頁；編輯于星期一\16點20分

3、活性炭----非極性吸附劑

①吸附力與結構的關系分子量大者>分子量小者芳香族>脂肪族，活性炭和芳香族均有平面型分子的緣故。含OH、COOH、NH2多者>少者本文檔共85頁；當前第53頁；編輯于星期一\16點20分

3、活性炭----非極性吸附劑

②溶劑的洗脫力

吡啶>15%酚/醇>7%酚/H2O>醇>含水醇>H2O黃酮、生物堿的富集，糖的分離，脫色等。③應用本文檔共85頁；當前第54頁；編輯于星期一\16點20分

4、聚酰胺（Polyamide）

由己酰胺聚合成的一類高分子化合物。分離原理：主要通過酰胺與酚、酸、醌等化合物形成氫鍵，吸附能力取決于氫鍵的強弱。本文檔共85頁；當前第55頁；編輯于星期一\16點20分2.分配柱色譜液-液柱色譜法，其固定相和流動相均為液體，液態(tài)固定相又稱固定液，被涂漬在惰性材料載體上構成固定相。分配柱色譜法的優(yōu)點是：穩(wěn)定性高，重現(xiàn)性好，適用樣品的類型廣等。

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固定相極性小于流動相，如HPLC反相色譜柱、反相薄層色譜板。固定相：硅膠的硅醇基與烷基結合，如RP-2、RP-8、RP-18，親脂性：RP-18>RP-8>RP-2流動相（洗脫劑）：MeOH-H2O；CH3CN-H2O洗脫順序：分離極性大的成分，極性大者先被洗脫出來。本文檔共85頁；當前第57頁；編輯于星期一\16點20分

固定相的表面修飾

本文檔共85頁；當前第58頁；編輯于星期一\16點20分3.離子交換色譜離子交換色譜中的固定相是一些帶電荷的基團，這些帶電基團通過靜電相互作用與帶相反電荷的離子結合。如果流動相中存在其他帶相反電荷的離子，按照質(zhì)量作用定律，這些離子將與結合在固定相上的反離子進行交換。固定相基團帶正電荷的時候，其可交換離子為陰離子，這種離子交換劑為陰離子交換劑；固定相的帶電基團帶負電荷，可用來與流動相交換的離子就是陽離子，這種離子交換劑叫做陽離子交換劑。本文檔共85頁；當前第59頁；編輯于星期一\16點20分陰離子交換柱的功能團主要是－NH2，及－NH3：陽離子交換劑的功能團主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3離子交換柱及-SO3H離子交換劑屬于強離子交換劑，它們在很廣泛的pH范圍內(nèi)都有離子交換能力；-NH2及-COOH離子交換柱屬于弱離子交換劑，只有在一定的pH值范圍內(nèi)，才能有離子交換能力。離子交換色譜主要用于可電離化合物的分離，例如，氨基酸自動分析儀中的色譜柱，多肽的分離、蛋白質(zhì)的分離，核苷酸、核苷和各種堿基的分離等。

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4、凝膠層析（GelPenetrationChromatography,GPC）

①葡聚糖凝膠

交聯(lián)葡聚糖是由一定平均分子量的葡聚糖和交聯(lián)劑（一般為環(huán)氧氯丙烷）以醚橋的形式互相交聯(lián)形成的三維空間網(wǎng)狀結構高分子材料，是水不溶性的白色球狀顆粒，酸性環(huán)境能水解，堿中穩(wěn)定。

在樣品通過一定孔徑的凝膠固定相時，由于流經(jīng)路徑的不同，使不同相對分子量的組分得以分離的方法。本文檔共85頁；當前第61頁；編輯于星期一\16點20分

表面有孔隙，其大小決定于聚糖與交聯(lián)劑的配比及反應條件。

商品型號即按凝膠的交聯(lián)度大小分類，并以吸水量來表示，英文字母G代表葡聚糖凝膠，后面的數(shù)字表示每克凝膠吸水量，再乘以10的值，G-25的吸水量為每克2.5ml。

交聯(lián)度大→網(wǎng)狀結構越緊密→孔隙越小→吸水膨脹越少。本文檔共85頁；當前第62頁；編輯于星期一\16點20分

型號吸水量（ml/g）床體積（ml/g）分離范圍最小溶脹時間肽與蛋白質(zhì)多糖室溫沸水G-101.02~3小于700小于70031G-151.52.5~3.5小于1500小于150031G-252.54~61000~5000100~500062G-505.09~111500~3萬500~1萬62G-757.512~153000~7萬1000~5萬243G-1001015~20400015萬1000`10萬485G-1501520~305000~40萬1000~15萬725G-2002030~405000~80萬1000~20萬725凝膠的型號與使用范圍本文檔共85頁；當前第63頁；編輯于星期一\16點20分

②層析原理

絕大部分在水溶液中進行，凝膠顆粒在適當溶劑中浸泡，待充分膨脹后裝入層析柱，加樣后用同一溶液洗脫。在洗脫過程中，較小的分子滲入凝膠，較大的分子隨溶液流動，分子量小的物質(zhì)（阻滯作用大）可通過凝膠網(wǎng)孔進入粒子內(nèi)部，然后擴散出來，故流程長，移動速度慢，后流出色譜柱，分子量大的物質(zhì)沉凝膠粒子間孔隙，隨洗脫液移動，流程短，移動速度快，先流出色譜柱。本文檔共85頁；當前第64頁；編輯于星期一\16點20分

不同的化合物由于其大小差異，在流經(jīng)GPC柱時，不同分子量的化合物流經(jīng)體積不同（大分子不能或難以進入凝膠網(wǎng)格結構的內(nèi)部，直接從凝膠顆粒之間穿過，保留時間短；而小分子恰恰相反，保留時間較長）而得以分離。本文檔共85頁；當前第65頁；編輯于星期一\16點20分

常用術語Vt——床體積，凝膠裝柱以后，柱床所占的體積。Vo——外水體積，柱床內(nèi)存在于凝膠外面的水相體積。Vi——內(nèi)水體積，凝膠顆粒內(nèi)部所含的水相體積。Vg——凝膠本身體積。相互關系：Vt=Vo+Vi+VgVe——洗脫體積，自樣品加入時算起，至流出組分最大濃度出現(xiàn)時，所流出的體積。本文檔共85頁；當前第66頁；編輯于星期一\16點20分

同一類型化合物，洗脫特征與組分分子量有關。

Ve=K1-K2logM

說明不同組分流經(jīng)凝膠柱時，按分子量大小順序流出，分子量大的，洗脫體積小，最先流出，當條件固定時，Ve重現(xiàn)性很好。

按此特性可測大分子物質(zhì)的分子量。本文檔共85頁；當前第67頁；編輯于星期一\16點20分

用已知分子量的物質(zhì)分別相繼上柱（5mg），流出液按每管2~4ml收集，通過硫酸蒽酮顯色，再經(jīng)紫外檢測，分別求得洗脫體積Ve。再用藍色葡聚糖測出柱床的外水體積Vo，按Ve/Vo與分子量對數(shù)關系作圖，得標準曲線，最后將待測物質(zhì)分子量用少水溶解上柱，在同樣條件下測定Ve，根據(jù)Ve/Vo，查標準曲線，測得物質(zhì)分子量。局限性：

1、要有標準樣。

2、不同的待測物質(zhì)要有不同的標準樣。本文檔共85頁；當前第68頁；編輯于星期一\16點20分

操作技術：溶脹：不同凝膠溶脹時間不一樣，G-100室溫下最小水化時間72h，除微顆粒。目的：充分吸水，各孔隙舒張，以利于物質(zhì)分子通過。裝柱：柱內(nèi)加少量洗脫液，排除底部氣泡，然后將凝膠漿倒入，讓其自然沉降，打開出口，柱床表面不再下沉即緊密。裝好的柱應不含氣泡，柱床表面平坦。本文檔共85頁；當前第69頁；編輯于星期一\16點20分

平衡：用3倍床體積洗脫液讓柱平衡流動2-3天，至流速恒定。加樣：平衡后，床表面應有1~2cm的洗脫液，用吸管沿柱壁加入，打開出口，當上面液體剛好全部滲入柱內(nèi)時，滴加洗脫液，注意不能振動床表面。

上樣品要體積小，濃度大，這樣峰形好。本文檔共85頁；當前第70頁；編輯于星期一\16點20分

洗脫：一般用水和電解質(zhì)溶液，如酸、堿、鹽的溶液及緩沖溶液。加入5cm以上洗脫液時，可接高位瓶中的洗脫液，洗脫分階段洗脫和梯度洗脫收集：分部收集器收集。檢出：蛋白質(zhì)、核苷酸、多肽用紫外光譜儀在280nm、260nm、230nm測吸光度值，以樣品體積（或管數(shù)）為橫座標，吸光度為縱座標，畫出洗脫曲線。本文檔共85頁；當前第71頁；編輯于星期一\16點20分5、大孔樹脂柱色譜大孔吸附樹脂的吸附實質(zhì)為一種物體高度分散或表面分子受作用力不均等而產(chǎn)生的表面吸附現(xiàn)象，這種吸附性能是由于范德華引力或生成氫鍵的結果。同時由于大孔吸附樹脂的多孔結構使其對分子大小不同的物質(zhì)具有篩選作用。通過上述這種吸附和篩選原理，有機化合物根據(jù)吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附樹脂上經(jīng)一定溶劑洗脫而達到分離、純化、除雜、濃縮等不同目的。吸附樹脂的表面發(fā)生吸附作用后，會使樹脂表面上溶質(zhì)的濃度高于溶劑內(nèi)溶質(zhì)的濃度，其結果引起體系內(nèi)放熱和自由能的下降。本文檔共85頁；當前第72頁；編輯于星期一\16點20分大孔吸附樹脂按其極性大小和所選用的單體分子結構不同，可分為非極性、中極性和極性三類。（1）非極性大孔吸附樹脂非極性大孔吸附樹脂是由偶極矩很小的單體聚合制得的不帶任何功能基，孔表的疏水性較強，可通過與小分子內(nèi)的疏水部分的作用吸附溶液中的有機物，最適于極性溶劑中吸附非極性物質(zhì)，也稱為芳香族吸附劑，例如苯乙烯、二乙烯苯聚合物。本文檔共85頁；當前第73頁；編輯于星期一\16點20分（2）中等極性大孔吸附樹脂中等極性大孔吸附樹脂是含酯基的吸附樹脂，且多功能團的甲基丙烯酸酯作為交聯(lián)劑。其表面兼有疏水和親水兩部分。既可極性溶劑中吸附非極性物質(zhì)，又可由非極性溶劑中吸附極性物質(zhì)，也稱為脂肪族吸附劑，例如聚丙烯酸酯型聚合物。（3）極性大孔吸附樹脂極性大孔吸附樹脂是指含酰胺基、氰基、酚羥基等含氮、氧、硫極性功能基的吸附樹脂，它們通過靜電相互作用吸附極性物質(zhì)，如丙烯酰胺。本文檔共85頁；當前第74頁；編輯于星期一\16點20分6.親和色譜親和色譜也稱為親和層析，是一種利用固定相的結合特性來分離分子的色譜方法。親和色譜在凝膠過濾色譜柱上連接與待分離的物質(zhì)有一