CaMK-II在脊髓背角LTP中調(diào)節(jié)AMPA受體GluR1亞單位的磷酸化

CaMKII在脊髓背角LTP中調(diào)節(jié)AMPA受體GluR1亞單位的磷酸化

作者：信文君，許繼田，宮慶娟，魏緒紅，張彤，李永勇，劉先國

【摘要】【目的】研究鈣/鈣調(diào)素調(diào)依賴性蛋白激酶II在大鼠脊髓背角C纖維誘發(fā)電位長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)中對α-氨基羥甲基異惡唑丙酸(AMPA)受體GluR1亞單位磷酸化的影響，探討長時(shí)程增強(qiáng)的分子機(jī)制?！痉椒ā坷秒娚砗蚖esternblot方法，檢測脊髓背角LTP后30min和3hAMPA受體GluR1亞單位Ser831和Ser845位點(diǎn)磷酸化水平，同時(shí)在強(qiáng)直刺激前，脊髓局部給予CaMKII特異性抑制劑KN-93，檢測GluR1亞單位Ser831和Ser845磷酸化水平變化。【結(jié)果】強(qiáng)直刺激后30min、3h，脊髓背角AMPA受體GluR1亞單位Ser831和Ser845磷酸化水平明顯增加。脊髓背角局部給予KN-93，阻斷了LTP的誘導(dǎo)并且也阻止了GluR1亞單位Ser831和Ser845磷酸化水平的增加?！窘Y(jié)論】強(qiáng)直刺激可導(dǎo)致GluR1亞單位Ser831和Ser845激活且它的激活可能是通過CaMKII來實(shí)現(xiàn)的。

【關(guān)鍵詞】鈣調(diào)依賴性蛋白激酶Ⅱ;長時(shí)程增強(qiáng)；GluR1；KN-93；磷酸化作用；脊髓背角

[JSUNYat-senUniv(MedSci),2007,28(3):241-245]長時(shí)程增強(qiáng)是突觸傳遞效率的長時(shí)程增強(qiáng)，海馬LTP被認(rèn)為是學(xué)習(xí)和記憶的突觸模型[1]，由于C纖維與脊髓背角淺層神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系傳導(dǎo)傷害感受信息，因此電刺激C纖維或者是神經(jīng)損傷引起的脊髓背角LTP被認(rèn)為是痛記憶的一種形式，一些在海馬LTP中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如蛋白激酶A、蛋白激酶C、鈣調(diào)依賴性蛋白激酶II等，在脊髓背角LTP中也有作用[4，5]。由于CaMKII在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛，且在與記憶有關(guān)的海馬腦區(qū)密度非常高，因此CaMKII被認(rèn)為是與LTP和記憶最為密切的激酶。CaMKII的磷酸化對于海馬LTP是非常關(guān)鍵，它的激活可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，且抑制劑可阻止LTP誘導(dǎo)。CaMKII的激活能夠磷酸化AMPA受體，從而提高它的單通道電導(dǎo)性。

AMPA受體是GluR1～GluR44個(gè)亞單位組成的多聚體，在海馬LTP中介導(dǎo)快速的突觸電流。在所有的AMPA受體亞單位中，GluR1對于成熟動(dòng)物海馬LTP的建立非常重要。GluR1有兩個(gè)主要的磷酸化位點(diǎn)，Ser831和Ser845，它們的磷酸化作用可改變AMPA受體的功能。體外研究已經(jīng)證實(shí)，CaMKII可以使GluR1Ser831發(fā)生磷酸化，而PKA可磷酸化Ser845位點(diǎn)[10]。

脊髓背角C纖維誘發(fā)電位LTP與海馬LTP和中樞敏感化有相同的機(jī)制[11]。然而，在脊髓LTP中，目前還沒有證據(jù)顯示GluR1哪一個(gè)位點(diǎn)被激活，我們先前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CaMKII在脊髓LTP的誘導(dǎo)和維持起關(guān)鍵作用，但CaMKII是否也影響AMPA受體的磷酸化水平，這依然不太清楚。因此，本研究將檢測脊髓背角LTP期間，GluR1可能被激活的位點(diǎn)；強(qiáng)直刺激后，脊髓局部應(yīng)用CaMKII選擇性抑制劑KN－93是否抑制GluR1磷酸化水平的升高。

1材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

體質(zhì)量250~280g的SD雄性大鼠，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，分籠飼養(yǎng)。KN-93購于sigma公司，溶解于少量二甲亞楓，配制成1mmol/L的儲(chǔ)存液，后用ACSF稀釋成工作濃度(100μmol)，DMSO的終濃度不超過％。

手術(shù)準(zhǔn)備及電生理記錄

烏拉坦腹腔注射麻醉，行常規(guī)氣管插管和頸靜脈插管，在腰4～腰6間行椎板切除術(shù)，暴露腰膨大。游離左側(cè)坐骨神經(jīng)，使用雙極氯化銀電極刺激坐骨神經(jīng)。除用于記錄的脊髓節(jié)段外，暴露的神經(jīng)組織均用石蠟油覆蓋。頸外動(dòng)脈插管持續(xù)監(jiān)測動(dòng)脈血壓~kPa(80～100mmHg)。用熱反饋系統(tǒng)使大鼠肛溫維持在~℃。脊髓背角C纖維誘發(fā)電位的記錄方法如文獻(xiàn)所述[12]。用鎢絲微電極進(jìn)行細(xì)胞外記錄，電極深度在脊髓表面下100~500?滋m。用數(shù)/模轉(zhuǎn)換器以10kHz的速度處理和儲(chǔ)存數(shù)據(jù)。以C纖維誘發(fā)電位的幅度作為參數(shù)。單方波刺激分離的左側(cè)坐骨神經(jīng)誘發(fā)脊髓背角電位，強(qiáng)直刺激誘導(dǎo)C纖維誘發(fā)電位LTP。坐骨神經(jīng)的刺激點(diǎn)到脊髓背角的記錄點(diǎn)約為11cm。

Westernblotting

方法如文獻(xiàn)所述[5，13]，分離大鼠L4～L6段脊髓，取刺激同側(cè)脊髓背角，于pH、15mmol/LTrisbuffer的裂解液中勻漿，裂解液成份見文獻(xiàn)，冰上超聲。4℃，13000×g離心15min，取上清。加樣于SDS凝膠上，200V電泳45min，后100V、1h轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫封閉1h，一抗孵育1h，漂洗3次，用耦合辣根過氧化物酶的二抗孵育1h，漂洗3次，ECL顯色1～3min，曝光。計(jì)算機(jī)灰度掃描，定量分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理，所用數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用非參數(shù)檢驗(yàn)比較均數(shù)間差異。取?琢=。

2結(jié)果

強(qiáng)直刺激激活脊髓背角GluR1亞單位

首先用Westernblotting方法檢查脊髓背角LTP后不同時(shí)間刺激同側(cè)AMPA受體GluR1亞單位蛋白總量及磷酸化的表達(dá)。結(jié)果顯示GluR1亞單位磷酸化和蛋白總量的位置大約都是110ku，且LTP后30min和3h，GluR1蛋白總量與對照組無顯著差別，然而GluR1Ser831和Ser845磷酸化水平與對照組相比明顯增加，LTP后30min和3h，Ser831磷酸化水平分別是對照組的和倍；同樣Ser845磷酸化水平分別增加和倍。

CaMKII抑制劑KN-93對AMPA受體GluR1磷酸化的影響

在強(qiáng)直刺激前30min脊髓局部應(yīng)用100μMKN-93，發(fā)現(xiàn)KN-93完全抑制了LTP的誘導(dǎo)。強(qiáng)直刺激后C纖維的反應(yīng)幅度與基線無區(qū)別(FriedmanANOVA,P,n=6,圖4A,opencircle)，而%的DMSO不影響LTP的誘導(dǎo)。

為了證明KN-93對脊髓背角LTP的影響是由于GluR1沒有被激活所導(dǎo)致，在強(qiáng)直刺激后30min，取脊髓樣品進(jìn)行Westernblot檢測。結(jié)果顯示：與DMSO組相比，KN-93明顯降低了GluR1Ser831和Ser845的磷酸化水平，與只給予測試刺激的對照組無任何差別。相反，DMSO既不能阻斷LTP的誘導(dǎo)，也不能降低GluR1的磷酸化水平。

3討論

本研究用電生理和免疫印跡方法檢測了(1)脊髓背角LTP期間，AMPA受體GluR1亞單位不同位點(diǎn)的磷酸化情況，(2)KN-93對GluR1亞單位磷酸化的影響。發(fā)現(xiàn)強(qiáng)直刺激30min和3h后，脊髓背角AMPA受體GluR1亞單位Ser831和Ser845磷酸化水平明顯升高；脊髓局部應(yīng)用CaMKII抑制劑KN-93抑制了LTP的誘導(dǎo)，且阻斷AMPA受體GluR1亞單位磷酸化水平的升高。結(jié)果顯示強(qiáng)直刺激激活GluR1亞單位，其磷酸化是通過CaMKII來調(diào)節(jié)的。

AMPA受體是離子型谷氨酸受體，介導(dǎo)快速興奮性突觸傳遞。海馬中它是與CaMKII作用的關(guān)鍵蛋白之一[14]。大量的研究表明傷害性刺激可以激活背角淺層傳入纖維的谷氨酸能突觸和突觸后神經(jīng)元的AMPA受體[12，15]。脊髓局部應(yīng)用AMPA受體阻斷劑，NBQX，可顯著抑制正常和炎癥疼痛大鼠的C纖維誘發(fā)的背角神經(jīng)元的反應(yīng)[16]?；谒羞@些證據(jù)，我們認(rèn)為AMPA受體GluR1亞單位的磷酸化作用對于LTP的誘導(dǎo)和維持是非常關(guān)鍵的。

體外許多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，GluR1的活性是通過Ser831和Ser845的磷酸化實(shí)現(xiàn)的[17]，它們可以被許多激酶調(diào)節(jié)，如CaMKII、PKA和PKC。在腦內(nèi)，CaMKII需要激活30min才能使AMPA受體磷酸化并且對LTP的誘導(dǎo)和維持發(fā)揮最大作用。我們先前的研究已經(jīng)顯示脊髓背角LTP可使CaMKII的磷酸化至少維持3h，但脊髓LTP中，GluR1的激活是否也需要CaMKII磷酸化需進(jìn)一步證明。本研究中，強(qiáng)直刺激前30min脊髓局部加入CaMKII選擇性抑制劑，KN-93，阻斷了GluR1亞單位在Ser831和Ser845位點(diǎn)的磷酸化。脊髓LTP期間，CaMKII磷酸化GluR1Ser831位點(diǎn)與海馬的結(jié)果相一致。然而，我們不知道為什么KN-93能夠阻斷GluR1Ser845位點(diǎn)的磷酸化，因?yàn)轶w外實(shí)驗(yàn)表明它是PKA的磷酸化作用位點(diǎn)。KN-93也許是通過間接的方式實(shí)現(xiàn)的。我們已經(jīng)知道CaMKII能夠使NMDA受體激活，促使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高[18]。KN-93阻斷了Ca2+內(nèi)流和Ca2+-鈣調(diào)復(fù)合物的形成，從而可能導(dǎo)致腺苷酸環(huán)化酶和PKA的水平降低，以至阻斷GluR1Ser845位點(diǎn)的磷酸化。

總之，本研究不僅證明了脊髓LTP可使AMPA受體GluR1亞單位Ser831和Ser845發(fā)生磷酸化，而且它們的激活可能是被CaMKII所調(diào)節(jié)。

【參考文獻(xiàn)】

BLISSTV,LOMOT.Long-lastingpotentiationofsynaptictransmissioninthedentateareaoftheanaesthetizedrabbitfollowingstimulationoftheperforantpath[J].JPhysiol，1973，232(2):331-356.

SANDKUHLERJ.Learningandmemoryinpainpathways[J].Pain,2000,88(2):113-118.

LIUXG,SANDKUHLERJ.Long-termpotentiationofC-fiber-evokedpotentialsintheratspinaldorsalhornispreventedbyspinalN-methyl-D-asparticacidreceptorblockage[J].NeurosciLett,1995,191(1-2):43-46.

楊紅衛(wèi),胡曉東,張紅梅,等.KN-93抑制脊髓背角C-纖維誘發(fā)電位LTP的誘導(dǎo)和早期維持[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)科學(xué)版,2003,24(4):321-324.

XINWJ,LIMT,YANGHW,etal.Roleofphospho-calcium/calmodulin-dependentproteinkinaseIIintheinductionandmaintenanceoflong-termpotentiationofC-fiber-evokedfieldpotentialsinspinaldorsalhornoftherat[J].ShengLiXueBao,2004,56(1):83-88.

LISMANJ,SCHULMANH,CLINEH.ThemolecularbasisofCaMKIIfunctioninsynapticandbehaviouralmemory[J].NatRevNeurosci,2002,3(3):175-190.

GIESEKP,FEDOROVNB,FILIPKOWSKIRK,etal.AutophosphorylationatThr286ofthealphacalcium-calmodulinkinaseIIinLTPandlearning[J].Science,1998,279(5352):870-873.

NICOLLRA,MALENKARC.Contrastingpropertiesoftwoformsoflong-termpotentiationinthehippocampus[J].Nature,1995,377(6545):115-118.

HAYASHIY,SHISH,ESTEBANJA,etal.DrivingAMPAreceptorsintosynapsesbyLTPandCaMKII:requirementforGluR1andPDZdomaininteraction[J].Science,2000,287(5461):2262-2267.

BANKETG,BOWIED,LEEH,etal.ControlofGluR1AMPAreceptorfunctionbycAMP-dependentproteinkinase[J].JNeurosci,2000,20(1):89-102.

LIP,WILDINGTJ,KIMSJ,etal.Kainate-receptor-mediatedsensorysynaptictransmissioninmammalianspinalcord[J].Nature,1999,397(6715):161-164.

LIUX,SANDKUHLERJ.Characterizationoflong-termpotentiationofC-fiber-evokedpotentialsinspinaldorsalhornofadultrat:essentialroleofNK1andNK2receptors[J].JNeurophysiol,1997,78(4):1973-1982.

XINWJ,GONGQJ,XUJT,etal.TheroleofphosphorylationofERKininductionandmaintenanceofLTPoftheC-fiberevokedfieldpotentialsinspinaldorsalhorn[J].JNeurosciRes,2006,84(5):934-943.

LISMANJE,ZHABOTINSKYAM.Amodelofsynapticmemory:aCaMKII/PP1switchthatpotentiatestransmissionbyorganizingan