環(huán)巴胺對(duì)胃癌細(xì)胞BGC

環(huán)巴胺對(duì)胃癌細(xì)胞BGC【摘要】目的:探討環(huán)巴胺對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823增殖凋亡及Shh、Gli-1基因表達(dá)的影響。方法:采用MTT法檢測(cè)環(huán)巴胺對(duì)BGC-823細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng),倒置顯微鏡及AO/EB熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,RT-PCR檢測(cè)Shh、Gli-1mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果:環(huán)巴胺可明顯抑制BGC-823細(xì)胞的生長(zhǎng),呈時(shí)間劑量依賴性，并出現(xiàn)典型的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；經(jīng)32、64、96μmol·L－1的環(huán)巴胺作用24h后的凋亡率依次為%、%、%，明顯高于空白對(duì)照組的%(均)；Shh及Gli-1mRNA均表達(dá)，環(huán)巴胺可下調(diào)Gli-1mRNA表達(dá)，但對(duì)ShhmRNA表達(dá)無明顯影響。結(jié)論:環(huán)巴胺可以抑制胃癌細(xì)胞BGC-823增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)Gli-1基因表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】環(huán)巴胺；胃癌細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；Shh；Gli-1；基因表達(dá)

環(huán)巴胺(cyclopamine)是從藜蘆屬植物內(nèi)分離得到的一種異甾體類生物堿，因其致畸作用而于20世紀(jì)60年代被發(fā)現(xiàn)。1998年，環(huán)巴胺作為一種Hedgehog信號(hào)通路的阻斷劑在果蠅體中得到證實(shí)［1］。最近研究發(fā)現(xiàn),Hedgehog信號(hào)通路的異常激活可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［2］。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于環(huán)巴胺與胃癌的關(guān)系研究較少。本實(shí)驗(yàn)旨在研究環(huán)巴胺對(duì)胃癌細(xì)胞系BGC-823的體外生長(zhǎng)抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，并進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。

1材料和方法

材料

人胃癌細(xì)胞系BGC-823由解放軍第八一醫(yī)院全軍腫瘤中心惠贈(zèng)，環(huán)巴胺購(gòu)自Biomol公司，RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，胰蛋白酶、MTT、DMSO、AO/BE試劑盒購(gòu)自Sigma公司，AnnexinⅤ-FITC/PI試劑盒購(gòu)自BD公司，β-actin及Shh、Gli-1基因引物由Invitrogen公司合成，RT-PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；酶標(biāo)儀為BIORED550型，流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司FACSCalibur型。

方法

細(xì)胞培養(yǎng)BGC-823細(xì)胞加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4d傳代1次。

MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞,孵育過夜后，加入終濃度為、5、10、20、40、60、80、100μmol·L－1的環(huán)巴胺，另設(shè)空白調(diào)零組、陰性對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72h，用MTT法測(cè)每孔光密度值(OD570值)。抑制率=(1-藥物組平均OD570值/對(duì)照組平均OD570值)×100%［3］。

倒置顯微鏡觀察上述各組細(xì)胞于倒置顯微鏡下直接觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

AO/EB染色熒光顯微鏡觀察收集環(huán)巴胺作用24h的細(xì)胞及空白對(duì)照組細(xì)胞，制成濃度為1×107ml－1細(xì)胞懸液，取200μl細(xì)胞懸液加8μlAO/EB染液混勻，吸10μl混合液點(diǎn)于潔凈載玻片上，蓋玻片封片后，于熒光顯微鏡下觀察，按試劑盒說明書進(jìn)行結(jié)果判斷。

AnnexinⅤ/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率收集經(jīng)32、64、96μmol·L－1環(huán)巴胺作用24h的細(xì)胞及空白對(duì)照組細(xì)胞，用PBS洗滌2次,采用AnnexinⅤ和PI熒光染色流式細(xì)胞術(shù)定量分析細(xì)胞凋亡率。

RT-PCR法檢測(cè)Shh、Gli-1mRNA表達(dá)收集各組細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，按TaKaRa兩步法試劑盒提供的說明書進(jìn)行RT-PCR操作。Shh：上游引物為5′-GCGACTTCCTCACTTTCCTG-3′,下游引物為5′-CCGGTTGATGAGAATGGTG-3′；Gli-1：上游引物為5′-AGGAGTTCGTGTGCCACTG-3′，下游引物為5′-GGCATTGCTGAAGGCTTTAC-3′；內(nèi)參為β-actin。RT-PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，數(shù)字成像系統(tǒng)拍照分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以x-±s表示，利用軟件處理包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間的比較采用單因素方差分析；采用Probit回歸分析計(jì)算半數(shù)抑制濃度，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=。

2結(jié)果

環(huán)巴胺對(duì)BGC-823細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，～100μmol·L－1的環(huán)巴胺對(duì)BGC-823細(xì)胞有生長(zhǎng)抑制作用，呈時(shí)間劑量依賴性，各組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()。24、48、72h的IC50依次為、、μmol·L－1。

倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

正常的BGC-823細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈圓梭形，核與染色質(zhì)均勻，核漿比值較大。經(jīng)環(huán)巴胺作用24h后，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，部分細(xì)胞變圓漂浮，部分細(xì)胞固縮、分解，出現(xiàn)細(xì)胞碎片。

AO/EB熒光顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

經(jīng)環(huán)巴胺作用24h后，細(xì)胞核呈現(xiàn)典型的固縮狀、圓珠狀或碎裂成點(diǎn)狀，并出現(xiàn)不同的核質(zhì)體染色：活細(xì)胞核質(zhì)體均勻染成綠色，早期凋亡細(xì)胞核質(zhì)體染成亮綠色，晚期凋亡染成橙色，壞死細(xì)胞染成橙紅色。

環(huán)巴胺對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823凋亡率的影響

隨著環(huán)巴胺作用濃度的增加，細(xì)胞凋亡率也逐漸增加，32、64、96μmol·L-1環(huán)巴胺作用24h后的細(xì)胞凋亡率依次為%、%、%,而空白對(duì)照組的凋亡率為%，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()。

環(huán)巴胺對(duì)Shh、Gli-1mRNA表達(dá)的影響

在BGC-823細(xì)胞中存在Shh、Gli-1mRNA的異常表達(dá)；32、64、96μmol·L-1環(huán)巴胺作用24h后，Shh、Gli-1mRNA的表達(dá)情況見圖3。經(jīng)圖像處理系統(tǒng)分析得出Shh、Gli-1及β-actin的灰度值，以β-actin灰度值為參照，得出Shh、Gli-1mRNA表達(dá)的半定量結(jié)果：隨環(huán)巴胺濃度增加，ShhmRNA表達(dá)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異()，Gli-1mRNA表達(dá)有減少趨勢(shì)()。

3討論

環(huán)巴胺是一種異甾體類生物堿，能與Hedgehog信號(hào)通路中的Smoothened蛋白結(jié)合，從而抑制該蛋白活性。在20世紀(jì)60至80年代，人們對(duì)環(huán)巴胺的研究?jī)H限于其在胚胎發(fā)育期的致畸作用;最近研究發(fā)現(xiàn),環(huán)巴胺在成體中具有抗腫瘤作用，且在胰腺癌、膽管癌、卵巢癌、肝癌等的體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)中均得到證實(shí)［4-7］，但關(guān)于其在胃癌細(xì)胞中的研究，國(guó)內(nèi)尚未見相關(guān)報(bào)道。

本研究以胃癌細(xì)胞系BGC-823為細(xì)胞模型，探討環(huán)巴胺對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制。MTT法結(jié)果顯示，環(huán)巴胺對(duì)BGC-823細(xì)胞有增殖抑制作用，且呈劑量和時(shí)間依賴性，其中劑量效應(yīng)關(guān)系較顯著。環(huán)巴胺劑量低于5μmol·L-1時(shí)，對(duì)細(xì)胞抑制作用不明顯；當(dāng)劑量從5μmol·L-1增至100μmol·L-1時(shí)，隨著劑量的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用也逐漸增強(qiáng)。倒置顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)環(huán)巴胺處理的BGC-823細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。AnnexinⅤ/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示隨著藥物劑量增加，細(xì)胞凋亡率逐漸升高。以上結(jié)果表明環(huán)巴胺有對(duì)抗胃癌細(xì)胞BGC-823的作用，但其機(jī)制尚不明確。

國(guó)外有研究指出Hedgehog信號(hào)通路可能與胃癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)［8-12］。Hedgehog信號(hào)通路是自我更新信號(hào)通路之一，在人類胚胎發(fā)育過程中調(diào)控細(xì)胞增殖分化，胚胎發(fā)育成熟后進(jìn)入失活狀態(tài)［13］。Hedgehog信號(hào)通路主要由糖蛋白配體Shh、跨膜蛋白受體Ptched、跨膜蛋白Smo、核轉(zhuǎn)錄因子Gli-1及下游靶基因組成。正常發(fā)育成熟細(xì)胞不表達(dá)Shh配體，Smo受體與Ptched結(jié)合而活性被抑制，核轉(zhuǎn)錄因子Gli-1被磷酸化水解，抑制下游靶基因如Gli-1，CyclinB、D、E，c-myc，VEGF，Angiopoietin和PDGF等轉(zhuǎn)錄，因此，Gli-1基因不表達(dá)或弱表達(dá)，Hedgehog信號(hào)通路處于失活狀態(tài)［14-15］。當(dāng)在該通路中處于重要地位的Shh、Gli-1基因異常表達(dá)時(shí)，Hedgehog信號(hào)通路將被激活，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。該通路的異常激活已被證實(shí)與胰腺癌、皮膚基底細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、前列腺癌等有關(guān)［16］。本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR在基因水平上揭示，BGC-823細(xì)胞中存在Shh、Gli-1基因異常表達(dá)，Hedgehog信號(hào)通路處于激活狀態(tài)。經(jīng)環(huán)巴胺處理24h后，細(xì)胞中Gli-1基因表達(dá)水平明顯降低，而Shh基因表達(dá)水平未見明顯改變，與環(huán)巴胺的作用靶點(diǎn)在Smo蛋白有關(guān)，Gli-1基因位于其下游，而Shh基因位于其上游。由此可見，環(huán)巴胺作用于胃癌細(xì)胞后，抑制了下游核轉(zhuǎn)錄因子Gli-1的表達(dá)，進(jìn)而抑制c-myc等癌基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮較強(qiáng)的抗腫瘤作用。

本研究證實(shí)，在胃癌細(xì)胞BGC-823中存在Hedgehog信號(hào)通路的異常激活，該信號(hào)通路有望成為胃癌治療的新靶點(diǎn)，是否還產(chǎn)生其他生物學(xué)效應(yīng)，目前尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究。由于Hedgehog信號(hào)通路在正常成體處于失活狀態(tài)，環(huán)巴胺作為該通路的阻斷劑，在抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)，對(duì)機(jī)體的正常細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生副作用，是一種潛在的安全有效的抗腫瘤藥物，而環(huán)巴胺要廣泛應(yīng)用于臨床還需要進(jìn)行多方面的研究。

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