血紅蛋白的分離與提取

血紅蛋白的提取和分離青銅峽市高級(jí)中學(xué)李福年課前熱身1．凝膠色譜法是根據(jù)（）分離蛋白質(zhì)的有效方法。

A分子的大小B相對(duì)分子質(zhì)量的大小

C帶電荷的多少D溶解度2．緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的影響來(lái)維持（）基本不變。

A溫度BpHC滲透壓D氧氣濃度BB課前熱身3．電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下向著與其所帶電荷（）的電極移動(dòng)。

A相同B相反C相對(duì)D相向4.哺乳動(dòng)物和人的成熟的紅細(xì)胞中的（）與氧氣的運(yùn)輸有關(guān)。

A血紅蛋白B肌紅蛋白C肌動(dòng)蛋白D肌球蛋白BA5．血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中（）的含量最多。

A白細(xì)胞B血小板C紅細(xì)胞D淋巴細(xì)胞6．為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血?jiǎng)ǎ?/p>

A.NaClB.甲苯C.蒸餾水D.檸檬酸鈉CD7．將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心后，可以明顯看到試管中的溶液分為4層，其中第3層是（）

A無(wú)色透明的甲苯層B脂溶性物質(zhì)的沉淀層

C血紅蛋白的水溶液

D其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物C血紅蛋白的提取和分離蛋白質(zhì)分子的差異性凝膠色譜法原理分離過(guò)程凝膠電泳法緩沖溶液組成作用蛋白質(zhì)的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定

血紅蛋白的提取與分離一、基礎(chǔ)知識(shí)---蛋白質(zhì)分離和提取的原理㈠凝膠色譜法（分配色譜法）1、凝膠：一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的通道，由多糖類構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖）2、依據(jù)3、原理

相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。相對(duì)分子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，在凝膠的外部移動(dòng)，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法依據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異：分子的形狀和大小，所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力——用來(lái)分離不同種類的蛋白質(zhì)。分子量大小直徑大小大于凝膠顆?？障吨睆?，被阻擋在顆粒的外面小于凝膠顆?？障吨睆?，可以進(jìn)入顆粒內(nèi)部運(yùn)動(dòng)方式垂直向下移動(dòng)垂直向下移動(dòng)，無(wú)規(guī)則擴(kuò)散進(jìn)入顆粒內(nèi)部運(yùn)動(dòng)速度較快較慢運(yùn)動(dòng)路徑較短較長(zhǎng)洗脫次序先從凝膠柱洗脫出來(lái)后從凝膠柱洗脫出來(lái)3、凝膠色譜法的原理4、具體過(guò)程混合物上柱洗脫大分子流動(dòng)快小分子流動(dòng)慢收集大分子收集小分子洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。4、具體過(guò)程1、概念：在一定的范圍內(nèi)，能對(duì)抗外來(lái)少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。㈡緩沖溶液：2、作用：能夠抵制（外界的酸或堿）對(duì)溶液（pH值）的影響，維持PH基本不變。3、緩沖溶液的配制通常由（1－2）種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的（使用比例）就可以制得（在不同PH范圍內(nèi)）使用的緩沖液。5、在本課題中使用的緩沖液：磷酸緩沖液，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科學(xué)研究其(活性)在本課題中使用的緩沖液的緩沖液還有什么作用？4、組成由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成。如H2CO3/NaHCO3，HC/NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。瓊脂糖凝膠電泳示意圖1.概念：帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。（三）電泳：2.電泳原理：電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。3.常見電泳類型：①瓊脂糖凝膠電泳②聚丙稀酰胺凝膠電泳③SDS——聚丙稀酰胺凝膠電泳(十二烷基磺酸鈉)遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小、形狀。P66⑵.電泳原理：電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。⑶.常見電泳類型：①瓊脂糖凝膠電泳②聚丙稀酰胺凝膠電泳③SDS——聚丙稀酰胺凝膠電泳

(十二烷基磺酸鈉)遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小、形狀。電泳遷移率完全取決于分子的大小。P66

聚丙稀酰胺凝膠電泳（1）聚丙稀酰胺凝膠：是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N，亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。（2）原理：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。為了消除凈電荷對(duì)遷移率的影響，可以在凝膠中加入SDS。（3）SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳作用機(jī)理:SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會(huì)解聚成單條肽鏈，因此測(cè)定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。[及時(shí)鞏固]已知某樣品中存在甲、乙、丙、丁、戊五種物質(zhì)，其分子大小、電荷的性質(zhì)和數(shù)量情況如圖所示。下列敘述正確的是()A．將樣品以2000r/min的速度離心10min，若分子戊存在于沉淀中，則分子甲也一定存在于沉淀中B．若五種物質(zhì)為蛋白質(zhì)，則用凝膠色譜柱分離時(shí)，甲的移動(dòng)速度最快C．將樣品裝入透析袋中透析12h，若分子乙保留在袋內(nèi)，則分子甲也保留在袋內(nèi)D．若五種物質(zhì)為蛋白質(zhì)，用SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品中的蛋白質(zhì)分子，則分子甲和分子丙形成的電泳帶相距最遠(yuǎn)解析：A.由于甲的分子量小于戊，將樣品以2000r/min的速度離心10min，若分子戊存在于沉淀中，則分子甲不一定存在于沉淀中，A錯(cuò)誤；B.由于甲蛋白質(zhì)分子量最小，最容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程最長(zhǎng)，移動(dòng)的速度最慢，B錯(cuò)誤；C.分子量大小是甲＜乙，透析時(shí)分子乙保留在袋內(nèi)，則分子甲不一定保留在袋內(nèi)，C錯(cuò)誤；D.SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的遷移速率完全取決于分子本身的大小，由于甲和戊的分子量差距最小，因此二者之間的電泳帶相距最近，D正確。D血液血漿水分其他物質(zhì)：血漿蛋白、無(wú)機(jī)鹽、磷脂、葡萄糖等血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個(gè)α－肽鏈兩個(gè)β一肽鏈四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)（四）.血液的成分討論：你認(rèn)為鳥類血液和哺乳動(dòng)物血液中，最好哪種血液來(lái)提取血紅蛋白？為什么？注意：每個(gè)亞基中都含有一個(gè)能與O2和CO2結(jié)合的亞鐵血紅素基團(tuán)。蛋白質(zhì)的提取和分離四步曲（1）樣品處理：包括洗滌紅細(xì)胞；血紅蛋白稀釋；離心等操作收集到的血紅蛋白溶液。（2）粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。（3）純化：通過(guò)凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。（4）純度鑒定：通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。（一）樣品處理1、紅細(xì)胞的洗滌：血液＋檸檬酸鈉→低速短時(shí)離心→吸出上層血漿→紅細(xì)胞＋5倍體積生理鹽水→緩慢攪拌10min→低速短時(shí)離心→吸出上清液→反復(fù)洗滌直至上清液無(wú)黃色2、血紅蛋白的釋放：3、分離血紅蛋白溶液紅細(xì)胞破碎混合液→中速長(zhǎng)時(shí)離心（2000c/min×10min）→濾紙過(guò)濾除去脂質(zhì)→分液漏斗分離出血紅蛋白，得到紅色透明液體。在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放血紅蛋白4、透析裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PH為7.0）透析。二、實(shí)驗(yàn)操作：樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定3.分離血紅蛋白高速離心10min分離過(guò)程紅細(xì)胞混合液濾紙過(guò)濾脂類物質(zhì)離心管燒杯4.透析血紅蛋白20mmol/L磷酸緩沖液1mL分離血紅蛋白溶液紅細(xì)胞的洗滌1.目的：去除雜蛋白2.方法：低速短時(shí)間離心

3.洗滌時(shí)加入試劑：5倍體積的生理鹽水血紅蛋白的釋放

1.蒸餾水作用：使紅細(xì)胞吸水破裂。2.甲苯作用：溶解細(xì)胞膜，加速細(xì)胞破裂。6/27/2023透析1.目的：除去樣品中分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)。2.原理：透析袋能使小分子自由進(jìn)出，大分子保留在袋內(nèi)。[及時(shí)鞏固]請(qǐng)根據(jù)血紅蛋白的提取和分離流程圖回答問(wèn)題：（1）將實(shí)驗(yàn)流程按先后順序補(bǔ)充完整：_______、_______。（2）凝膠色譜法的基本原理是根據(jù)_______分離蛋白質(zhì)。（3）洗滌紅細(xì)胞的目的是去除______,洗滌干凈的標(biāo)志是_____。為防止血液凝固,在采血容器中要預(yù)先加入____________?！敬鸢浮?1).血紅蛋白的釋放凝膠色譜柱的裝填(2).相對(duì)分子質(zhì)量的大小(3).雜蛋白（或血漿蛋白）離心后的上清液中沒(méi)有黃色檸檬酸鈉（二）、凝膠色譜操作－－純化1.凝膠色譜柱的制作：2.凝膠色譜柱的裝填：3.樣品的加入和洗脫2、凝膠色譜柱的裝填步驟操作要求①操作要求色譜柱垂直固定在支架上②計(jì)算稱量凝膠根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量③配制懸浮液凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹凝膠顆粒＋洗脫液→沸水浴④裝填懸浮液一次性緩慢倒入；輕輕敲打⑤緩沖液洗滌平衡立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h3、樣品加入與洗脫---調(diào)節(jié)緩沖液面→加入蛋白質(zhì)樣品→調(diào)節(jié)緩沖液面→洗脫→收集分裝蛋白質(zhì)（1）調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。（2）滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。（3）樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。（4）洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。（5）收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過(guò)程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功）（6）注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。

④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時(shí)。注意：1、洗脫液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。3.樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。3.樣品的加入和洗脫[及時(shí)鞏固]請(qǐng)根據(jù)血紅蛋白的提取和分離流程圖回答問(wèn)題：（1）下面是凝膠色譜法分離血紅蛋白時(shí)樣品加入過(guò)程的示意圖,正確的加樣順序是_____。（2）在裝填色譜柱時(shí)不得有氣泡存在,因?yàn)開____________。在凝膠色譜操作過(guò)程中,不能發(fā)生_________的情況,一旦發(fā)生這種情況,需重新裝填凝膠色譜柱。如果紅色區(qū)帶______,說(shuō)明色譜柱制作成功。

(1).④①②③(2).氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果洗脫液流干、露出凝膠顆粒均勻一致地移動(dòng)（三）、用SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的方法

使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時(shí)進(jìn)行電泳，根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置，用電泳遷移率和分子量的對(duì)數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以測(cè)定未知蛋白質(zhì)的分子量。市場(chǎng)上有高分子量、次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售。1、下列關(guān)于有關(guān)科學(xué)方法的敘述，錯(cuò)誤的是A．分離各種細(xì)胞器用差速離心法B．葉綠體中色素提取用紙層析法C．血紅蛋白的提取和分離時(shí)用凝膠色譜法、電泳法D．驗(yàn)證DNA半保留復(fù)制用同位素標(biāo)記法和密度梯度離心法B綜合訓(xùn)練2、蛋白質(zhì)的提取和分離分為哪幾步，依次是()A．樣品處理、凝膠色譜操作、SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳B．樣品處理、凝膠色譜操作、純化C．樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定D．樣品處理、純化、粗分離、純度鑒定C3、回答有關(guān)蛋白質(zhì)分離和純化的問(wèn)題：(1)要獲得血清蛋白的粗制品，必須將含有檸檬酸鈉的血液進(jìn)行________處理，然后將________裝入透析袋中除去________。(2)要獲得血紅蛋白，應(yīng)如何破碎紅細(xì)胞？________________。(3)下圖為血清蛋白通過(guò)醋酸纖維薄膜的電泳圖譜，你認(rèn)為含量最多的蛋白質(zhì)是________，含負(fù)電荷最多的球蛋白是________，相對(duì)分子質(zhì)量最大的球蛋白是________。(4)電泳是目前應(yīng)用最為普遍的________蛋白質(zhì)的方法。答案：(1)離心上清液小分子物質(zhì)(2)加蒸餾水使其脹破(3)清蛋白α1-球蛋白γ-球蛋白(4)(分離)純化4.紅細(xì)胞含有大量血紅蛋白，紅細(xì)胞的機(jī)能主要是由血紅蛋白完成。我們可以選用豬、牛、羊等動(dòng)物的血液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，來(lái)提取和分離血紅蛋白，請(qǐng)回答下列有關(guān)問(wèn)題：（1）實(shí)驗(yàn)前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預(yù)先加入檸檬酸鈉，取血回來(lái)，馬上進(jìn)行離心，收集血紅蛋白溶液。①其中加入檸檬酸鈉的目的是___________。②此過(guò)程是樣品處理，它應(yīng)包括紅細(xì)胞洗滌、______、分離血紅蛋白溶液。（2）收集的血紅蛋白溶液在透析袋中透析，這是樣品的粗分離。①透析的目的是__________。②透析的原理是____________________。③透析袋由半透膜制成，常用的半透膜有_______(至少填2個(gè))。（3）然后通過(guò)凝膠色譜法將樣品進(jìn)一步純化，最后經(jīng)SDS—聚丙烯酰胺凝膠電脈進(jìn)行純度鑒定。其中通過(guò)凝膠色譜法將樣品純化的目的是_________；支持物電泳是目前應(yīng)用較為普遍的純化蛋白質(zhì)的一種方法，支持物有________________(至少填2個(gè))。5、【答案】(1).①防止血液凝固②血紅蛋白的釋放(2).①去除相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)②透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子則保留在袋內(nèi)③.腸衣、膀胱膜、玻