第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法(4學(xué)時)

細(xì)胞生物學(xué)研究方法進(jìn)行初步觀察形成可驗證的假說設(shè)計試驗收集資料解釋結(jié)果作出合理結(jié)論查閱已有知識生物學(xué)研究模式生物是基于不同物種享有共同分子機(jī)制本文檔共46頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分CaenorhabditiselegansDrosophilamelanogasterArabidopsisthaliana本文檔共46頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)本文檔共46頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

1光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy）

2

電子顯微鏡技術(shù)

(Electromicroscopy)3掃描遂道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope)本文檔共46頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy)

普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)

熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscopy）

激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)（LaserScanningConfocalMicroscopy）

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）（自習(xí)）本文檔共46頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)

分辨率是指區(qū)分開兩個質(zhì)點(diǎn)間的最小距離本文檔共46頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分普通光學(xué)顯微鏡本文檔共46頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分各種顯微鏡的分辨率梯度本文檔共46頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分熒光顯微鏡技術(shù)

（FluorescenceMicroscopy）原理本文檔共46頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分熒光顯微鏡技術(shù)

（FluorescenceMicroscopy）應(yīng)用

直接熒光標(biāo)記技術(shù)

間接熒光標(biāo)記技術(shù)(免疫熒光標(biāo)記技術(shù))

用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位：如綠色熒光蛋白(GFP)的應(yīng)用

本文檔共46頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分應(yīng)用：綠色熒光蛋白本文檔共46頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)

（LaserScanningConfocalMicroscopy）原理：應(yīng)用： 排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng) 圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7倍)，通過“光切片”觀察樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。本文檔共46頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分激光共焦掃描顯微系統(tǒng)(Confocal

System)本文檔共46頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分PineTreepollen-collectedonaBio-RadMRC1024atPurdueUniversityCytometryLaboratories

利用光切片技術(shù)顯示的花粉內(nèi)部結(jié)構(gòu)本文檔共46頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分1為轉(zhuǎn)GFP基因的煙草單細(xì)胞；2為轉(zhuǎn)SCaM1-GFP融合基因的煙草單細(xì)胞；3為轉(zhuǎn)SCaM4-GFP融合基因的煙草單細(xì)胞。

質(zhì)壁分離后轉(zhuǎn)基因煙草單細(xì)胞的激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞壁細(xì)胞膜細(xì)胞核細(xì)胞壁細(xì)胞壁細(xì)胞膜細(xì)胞核細(xì)胞膜細(xì)胞核細(xì)胞核細(xì)胞膜細(xì)胞壁細(xì)胞核細(xì)胞膜本文檔共46頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分二、電子顯微鏡技術(shù)

電子顯微鏡的基本知識電鏡與光鏡的比較

電子顯微鏡的基本構(gòu)造

本文檔共46頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分電鏡與光鏡的比較

顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差本文檔共46頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分電子顯微鏡的基本構(gòu)造電子束照明系統(tǒng)、成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)本文檔共46頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分二、電子顯微鏡技術(shù)

電子顯微鏡的基本知識電鏡與光鏡的比較

電子顯微鏡的基本構(gòu)造

主要電鏡制樣技術(shù)

負(fù)染色技術(shù)冰凍蝕刻技術(shù)超薄切片技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

本文檔共46頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分主要電鏡制樣技術(shù)超薄切片技術(shù)用于電鏡觀察的樣本制備示意圖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

負(fù)染色技術(shù)（Negativestaining）

染色背景，襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)，如病毒、核糖體等結(jié)構(gòu)。

冷凍蝕刻技術(shù)（Freezeetching）

冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型：主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。

電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)（StructuralBiology）

主要研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系的主要實驗手段。

本文檔共46頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分固定

包埋切片染色超薄切片技術(shù)本文檔共46頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分超薄切片技術(shù)圖片示例本文檔共46頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分冷凍蝕刻本文檔共46頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分二、電子顯微鏡技術(shù)

電子顯微鏡的基本知識電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡光路圖比較電子顯微鏡的基本構(gòu)造

主要電鏡制樣技術(shù)

負(fù)染色技術(shù)冰凍蝕刻技術(shù)超薄切片技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

掃描電鏡（Scanningelectronmicroscope，SEM）

本文檔共46頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分掃描電鏡原理與應(yīng)用：

電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測器收集二次電子成象。

CO2臨界點(diǎn)干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題本文檔共46頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分本文檔共46頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分三、掃描遂道顯微鏡ScanningTunnelingMicroscope,STM80年代發(fā)展起來的檢測樣品微觀結(jié)構(gòu)的儀器。反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。特點(diǎn)：分辨率高：

側(cè)分辨率：分辨率為0.1～0.2nm，縱分辨率可達(dá)0.001nm不受介質(zhì)限制非破壞性

用途：納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)，觀察生物大分子、膜、病毒等的結(jié)構(gòu)。本文檔共46頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分

2.特異蛋白抗原的定位與定性

3.細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

4.放射自顯影技術(shù)

1.離心分離技術(shù)第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法本文檔共46頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分一、離心分離技術(shù)

用途：分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物

差速離心：分離密度不同的細(xì)胞組分

密度梯度離心：精細(xì)組分或生物大分子的分離本文檔共46頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分差速離心本文檔共46頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分密度梯度離心常用的介質(zhì)：蔗糖、氯化銫、甘油等。本文檔共46頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分二、特異蛋白抗原的定位與定性

免疫熒光技術(shù)

快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限免疫電鏡技術(shù)免疫膠體金技術(shù)應(yīng)用：能對蛋白進(jìn)行精細(xì)定位。如通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等。蛋白電泳(SDS)與免疫印跡反應(yīng)(Western-Blot)本文檔共46頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分免疫熒光技術(shù)圖片示例本文檔共46頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分免疫膠體金技術(shù)原理與圖片示例本文檔共46頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分三、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

光鏡水平的原位雜交技術(shù)

（同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的探針）

電鏡水平的原位雜交技術(shù)

（生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標(biāo)記結(jié)合）

本文檔共46頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分四、放射自顯影技術(shù)原理及應(yīng)用：利用同位素的放射自顯影，對細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定量研究；實現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行動態(tài)和追蹤研究。

本文檔共46頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分本文檔共46頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程

1細(xì)胞的培養(yǎng)2細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)本文檔共46頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分一、細(xì)胞的培養(yǎng)

動物細(xì)胞培養(yǎng) 類型：原代培養(yǎng)細(xì)胞（primaryculturecell） 傳代培養(yǎng)細(xì)胞（sub-culturecell）

細(xì)胞株（cellstrain）正常二倍體，具有接觸抑制。

細(xì)胞系（cellline）染色體改變，接觸抑制喪失，無限傳代植物細(xì)胞培養(yǎng)非細(xì)胞體系（cell-freesystem）

研究DNA復(fù)制、蛋白質(zhì)合成等生命活動本文檔共46頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分本文檔共46頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分Hela細(xì)胞（左）、CHO細(xì)胞（右）的培養(yǎng)本文檔共46頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期三\10點(diǎn)23分二、細(xì)胞工程細(xì)胞融合（cellfusion）與細(xì)胞雜交（cellhybridization）技術(shù)單克隆抗體技術(shù)細(xì)胞拆合與顯微鏡操作技術(shù)轉(zhuǎn)基因動物與轉(zhuǎn)基因植物

本文檔共46頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期三\1