分子生物學(xué)復(fù)習(xí)重點(diǎn)

名詞解釋RNAi：由一類小分子RNA介導(dǎo)基因沉默的機(jī)制稱為RNA干擾（RNAi）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)：細(xì)胞通訊啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)一系列化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致一組成分的活性、水平或亞細(xì)胞定位改變，最終引起細(xì)胞反應(yīng)，包括改變代謝物濃度和代謝速度，最終導(dǎo)致細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂、分化、衰老、死亡速度改變，這一過(guò)程稱為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)?；蚪M：細(xì)胞或生物體中，一套完整單體的遺傳物質(zhì)的總和即為基因組啟動(dòng)子：是指基因序列中能被RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合、，從而形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的DNA序列，大多數(shù)位于基因（或操縱子）轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，具有方向性，屬于調(diào)控元件?；蛟\斷：基因診斷屬于分子診斷，是指直接檢測(cè)基因組中致病基因或疾病相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)異?；虮磉_(dá)水平的改變，或病原體基因的存在，從而對(duì)人體健康做出評(píng)價(jià)，或?qū)θ梭w疾病做出診斷。逆轉(zhuǎn)錄：逆轉(zhuǎn)錄又稱反轉(zhuǎn)錄，是以RNA為模板，以dNTP為原料，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成DNA的過(guò)程。這是一個(gè)從RNA向DNA傳遞遺傳信息的過(guò)程，與從DNA向RNA傳遞遺傳信息的轉(zhuǎn)錄過(guò)程相反，所以稱為反轉(zhuǎn)錄。cDNA文庫(kù)：是指某生物某一發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的mRNA全部經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的CDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。密碼子：信使RNA鏈上（或DNA）決定一個(gè)氨基酸的相鄰的三個(gè)堿基，亦稱三聯(lián)體密碼。蛋白質(zhì)組學(xué)：應(yīng)用組學(xué)技術(shù)研究一定條件下的蛋白質(zhì)組，包括組成、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、功能、分布、相互作用和條件變異等，建立和應(yīng)用蛋白信息數(shù)據(jù)庫(kù)?；蛑委煟菏侵冈诨蛩缴现委熂膊?，包括基因添加、基因置換、基因修飾、基因干預(yù)、自殺基因治療、免疫基因治療等。簡(jiǎn)答題基因治療方法和步驟基因治療是指在基因水平上治療疾病，包括基因添加、基因置換、基因修飾、基因干預(yù)、自殺基因治療、免疫基因治療等?；蛑委煹姆椒ㄖ饕?1)將正?；?qū)氩∽兗?xì)胞，表達(dá)產(chǎn)物參與細(xì)胞代謝。(2)將反義核酸導(dǎo)入病變細(xì)胞，抑制致病基因的過(guò)度表達(dá)。(3)將特定基因?qū)敕遣∽兗?xì)胞，表達(dá)特定產(chǎn)物，發(fā)揮治療作用?；蛑委煹囊话悴襟E包括(1)選擇和制備正?；颍?2)選擇基因治療的靶細(xì)胞；(3)將治療性基因?qū)爰?xì)胞；(4）轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選和正?；蜩b定如何分別從DNA，mRNA和蛋白質(zhì)水平上Knockdown基因的表達(dá)。提示：DNA水平可以從啟動(dòng)子著手，突變啟動(dòng)子或修飾啟動(dòng)子使其沉默，或者阻斷與其結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子活性；RNA水平是采用RNA干擾實(shí)驗(yàn)最好；蛋白質(zhì)水平是用抑制劑或抗體或負(fù)顯性（Dominantnegative,也就是過(guò)表達(dá)某結(jié)構(gòu)正常但沒(méi)有活性蛋白，從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制內(nèi)源正常蛋白）DNA水平上：（1）基因突變：DNA甲基化；基因重排，例如置于一個(gè)沉默子之中（2）影響轉(zhuǎn)錄：原核生物上，突變啟動(dòng)子或修飾啟動(dòng)子使其沉默；阻斷σ因子與啟動(dòng)子結(jié)合或抑制其活性。真核生物上，阻斷轉(zhuǎn)錄因子的活性，使RNA聚合酶無(wú)法轉(zhuǎn)錄基因，使基因表達(dá)受到抑制等等。（3）RNA生物合成抑制劑:堿基類似物，核苷類似物，模板干擾劑，RNA聚合酶抑制劑。RNA水平上：改變mRNA的穩(wěn)定性，從而影響翻譯效率；使5’非翻譯區(qū)長(zhǎng)度小于12nt，；翻譯起始因子磷酸化利用RNA干擾技術(shù)，介導(dǎo)基因沉默：①miRNA與含有同源序列的mRNA結(jié)合，阻遏其翻譯或促進(jìn)其降解，產(chǎn)生基因沉默效應(yīng)。②小干擾RNA能與目的基因mRNA結(jié)合，促進(jìn)其降解，產(chǎn)生基因沉默效應(yīng)。蛋白質(zhì)水平上：（1）阻斷或抑制蛋白質(zhì)加工后的修飾；促進(jìn)翻譯阻遏蛋白（2）蛋白質(zhì)生物合成抑制劑：直接抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素。（3）促進(jìn)蛋白質(zhì)泛素化，加快降解。（3）介導(dǎo)蛋白質(zhì)的負(fù)顯性：過(guò)表達(dá)某些結(jié)構(gòu)正常但沒(méi)有活性的蛋白，從而競(jìng)爭(zhēng)性的一直內(nèi)源正常蛋白。簡(jiǎn)述PCR引物設(shè)計(jì)原則。引物定位基因組DNA引物序列應(yīng)定位于保守序列區(qū)域，且在其它區(qū)域沒(méi)有同源序列（序列同源性一般不超過(guò)70%）；cDNA引物序列應(yīng)盡量位于編碼區(qū)內(nèi)，斷裂基因cDNA上游引物和下游引物應(yīng)盡量定位于不同外顯子內(nèi)。引物長(zhǎng)度控制在10~40nt，多數(shù)20~30nt。引物的末端3’端與模板嚴(yán)格互補(bǔ)，特別是末端的兩個(gè)核苷酸，最好是S（即G或C）,但不能有連續(xù)的3個(gè)S。對(duì)大引物而言，5’端序列不必嚴(yán)格互補(bǔ)，甚至可以修飾。引物組成G和C含量應(yīng)控制在40%~75%。引物序列引物之間不能存在互補(bǔ)序列，特別是3’端不能互補(bǔ)。引物內(nèi)部不能存在可導(dǎo)致形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的反向重復(fù)序列。引物所含單核苷酸重復(fù)序列長(zhǎng)度不能超過(guò)5nt。引物熔點(diǎn)引物熔點(diǎn)Tm=2(A+T)+4(G+C)。引物熔點(diǎn)應(yīng)該一致（相差不超過(guò)5℃）。根據(jù)被測(cè)定的對(duì)象，簡(jiǎn)述分子雜交印跡的種類及其特點(diǎn)、應(yīng)用上優(yōu)缺點(diǎn)。分為DNA印跡法和RNA印跡法。DNA印跡法還包括斑點(diǎn)印跡法、夾縫印跡法、菌落雜交法和噬菌斑雜交法。由此衍生的有蛋白質(zhì)印跡法。、DNA印跡法，要先電泳后變性、轉(zhuǎn)移。RNA印跡法為先變性后電泳、轉(zhuǎn)移。2）、RNase（核糖核酸酶）無(wú)處不在，可以將RNA降解為核苷酸，因而從制備RNA到分析都要絕對(duì)消除外源RNase的污染，并盡量抑制內(nèi)源性RNase。DNA印跡法則無(wú)此要求。3）、RNA印跡法不能采用堿變性，因?yàn)椴捎脡A變性會(huì)導(dǎo)致RNA水解，所以只能采用甲醛、乙二醛、二甲基亞砜等變性。（RNA印跡法可以用于定性或定量分析組織細(xì)胞內(nèi)的總RNA或某一種特異RNA，特別是分析mRNA的長(zhǎng)度和含量。）4）、斑點(diǎn)雜交法和夾縫雜交法的特點(diǎn)是用樣量少、操作簡(jiǎn)便，提取的核酸不需要進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)移，但在同一張固定膜上可以點(diǎn)多個(gè)樣本。5）、蛋白質(zhì)印跡法也是由電泳分離、轉(zhuǎn)移固定和檢測(cè)分析等組成。只能用電轉(zhuǎn)移法進(jìn)行轉(zhuǎn)移。用抗原-抗體反應(yīng)檢測(cè)目的蛋白.簡(jiǎn)答題克隆（篩選、測(cè)序、擴(kuò)增、驗(yàn)證）疾病相關(guān)基因的方法。定位克隆的策略消減雜交的策略?。êY選測(cè)序擴(kuò)增驗(yàn)證）疾病相關(guān)基因的方法。篩選疾病相關(guān)基因（基因芯片，扣減雜交，蛋白質(zhì)組學(xué)）①利用基因芯片篩選相關(guān)基因。基因芯片也稱DNA芯片，基于核酸分子雜交，專以檢基因聚合酶特點(diǎn)：重組DNA技術(shù)常用的10種工具酶1)限制性內(nèi)切酶：識(shí)別特異序列，切割DNA(2)DNA連接酶：(3)dna聚合酶Ⅰ：a.合成雙鏈cDNA中第二條鏈;b.缺口平移制做探針;c.DNA序列分析;d.填補(bǔ)3′末端。(4)Taq酶：催化pcr反應(yīng)，聚合DNA(5)反轉(zhuǎn)錄酶：a.合成cDNA;b.替代DNA聚合酶Ⅰ進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析(6)多聚核苷酸激酶：