免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用

第十八章免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用

第一節(jié)抗原或抗體的體外檢測(cè)抗原-抗體反響：antigen-antibodyreaction。是指抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生的特異性結(jié)合的反響。血清學(xué)反響：serologicalreaction。指體外的抗原-抗體反響。一、抗原-抗體反響特點(diǎn)特異性：親和力、親合力、交叉反響可逆性可見性階段性二、抗原-抗體反響影響因素電解質(zhì)酸堿度溫度三、抗原-抗體反響類型和檢測(cè)方法中和反響凝集反響沉淀反響補(bǔ)體參加的反響免疫標(biāo)記技術(shù)酶免疫測(cè)定法免疫熒光法放射免疫測(cè)定法〔一〕凝集反響〔agglutination〕1.直接凝集反響：顆粒性抗原+相應(yīng)抗體→凝集玻片法：細(xì)菌及ABO血型鑒定試管法：肥達(dá)氏反響抗原吸附于載體+相應(yīng)抗體→凝集常用載體：乳膠顆粒、羊紅細(xì)胞2.間接凝集反響3.間接凝集抑制試驗(yàn)將可溶性抗原與相應(yīng)抗體預(yù)先作用，再參加相應(yīng)的致敏顆粒。

妊娠診斷試驗(yàn)：檢測(cè)尿中的HCG4.抗人球蛋白試驗(yàn)〔Coombs試驗(yàn)〕用途：檢測(cè)單價(jià)抗體直接Coombs試驗(yàn)：檢測(cè)結(jié)合在Rh+紅細(xì)胞上的單價(jià)抗體；間接Coombs試驗(yàn)：檢測(cè)游離的Rh單價(jià)抗體?！捕吵恋矸错?precipitation)

可溶性抗原+相應(yīng)抗體→沉淀單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：測(cè)Ig、補(bǔ)體含量。雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：火箭電泳：Ag置“－〞極對(duì)流免疫電泳：Ag置“－〞極，Ab置“＋〞極免疫電泳：免疫比濁法：環(huán)狀沉淀絮狀沉淀1.單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)2.雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)3.對(duì)流免疫電泳原理：將雙擴(kuò)與電泳技術(shù)結(jié)合在一起，測(cè)定可溶性抗原。陰極陽極〔-〕〔+〕電泳電滲AgAb4.火箭電泳將單向免疫擴(kuò)散與電泳技術(shù)結(jié)合，可快速測(cè)定標(biāo)本中可溶性抗原的含量。5.免疫電泳先電泳別離標(biāo)本中抗原成分，再沿電泳方向挖抗體槽，加抗體，進(jìn)行雙擴(kuò)。用于血清蛋白及抗體成分的分析及抗原/抗體提取物純化鑒定。6.免疫比濁法該技術(shù)是利用抗原－抗體復(fù)合物在液相中形成濁度來測(cè)量抗原含量的方法。方法：透射光比濁法散射光比濁法免疫乳膠比濁法速率抑制免疫比濁法〔三〕補(bǔ)體參加的反響此類反響是利用抗體與紅細(xì)胞外表相應(yīng)抗原結(jié)合后，使反響體系中補(bǔ)體激活導(dǎo)致紅細(xì)胞破壞，出現(xiàn)溶血現(xiàn)象建立的。補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)：待測(cè)抗原＋待測(cè)抗體〔待測(cè)的反響系統(tǒng)〕補(bǔ)體抗體＋紅細(xì)胞〔指示系統(tǒng)〕溶血空斑試驗(yàn)HLA血清學(xué)分型法：即補(bǔ)體依賴的微量細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)〔四〕免疫標(biāo)記技術(shù)抗原抗體反響與標(biāo)記技術(shù)結(jié)合，定位、定量、定性測(cè)定。標(biāo)記物：熒光素、酶、放射性核素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、膠體金等。類型：免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)、同位素標(biāo)記技術(shù)等。1.酶免疫測(cè)定法是用酶標(biāo)記Ab進(jìn)行的抗原抗體反響。常用的酶：辣根過氧化酶、堿性磷酸酶常用底物：鄰苯二胺〔OPD〕常用方法：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)免疫組化法〔1〕酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)〔ELISA〕夾心法〔測(cè)抗原〕間接法〔測(cè)抗體〕ELISA(雙抗體夾心法-測(cè)Ag)〔2〕酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)

〔ELISPOT〕用于效應(yīng)細(xì)胞分泌單一細(xì)胞因子的測(cè)定?！?〕BAS-ELISA生物素-親和素系統(tǒng)〔BAS〕是一生物放大系統(tǒng)，利用親和素-生物素-酶的連接關(guān)系，追蹤生物素標(biāo)記的抗原或抗體，通過酶催化底物顯色，檢測(cè)相應(yīng)的抗體或抗原，靈敏度高。〔4〕免疫組化技術(shù)ImmunohistochemistyTechnique是用標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞外表相應(yīng)抗原結(jié)合發(fā)生反響，對(duì)抗原進(jìn)行定位、定性或定量檢測(cè)的技術(shù)。2.免疫熒光法(異硫氰酸熒光素、藻紅蛋白)直接法：用熒光標(biāo)記的抗體檢測(cè)未知抗原。間接法：用熒光標(biāo)記的抗抗體，檢測(cè)未知的抗原/抗體。補(bǔ)體法：3.放射免疫測(cè)定〔RIA〕將放射性核素分析的高度靈敏性與抗原抗體反響的特異性結(jié)合起來的技術(shù)，測(cè)定激素和藥物。常用I125和I131快速，敏感〔pg)，但污染環(huán)境，有一定的危害性。4.免疫膠體金技術(shù)〔ICS〕Immunologicalcolloidalgoldsignature是用膠體金顆粒標(biāo)記抗體或抗原，用以檢測(cè)未知抗原或抗體的技術(shù)，可用于多種液相免疫測(cè)定和固相免疫分析。免疫層析法：immunochromatography免疫層析法操作和原理①首先將特異性抗體固定于硝酸纖維素膜上某一區(qū)帶；②測(cè)試時(shí)將上述硝酸纖維素膜一端浸入待檢樣品中〔尿液或血清〕，通過毛細(xì)管作用樣品將沿膜向前移動(dòng)；③當(dāng)樣品進(jìn)入特異性抗體固定區(qū)帶時(shí)，假設(shè)樣品中含有相應(yīng)抗原即可與該區(qū)帶抗體特異性結(jié)合，進(jìn)而通過免疫膠體金所呈現(xiàn)的紫紅色條帶判定試驗(yàn)結(jié)果。早孕診斷〔硝酸纖維素膜診斷試紙制備〕①首先將膠體金致敏抗體—膠體金標(biāo)記的鼠抗人絨毛膜促性腺激素〔HCG〕特異性抗體，松弛附著在玻璃纖維上，再將上述玻璃纖維固定在硝酸纖維素膜G處；②將鼠抗人HCG特異性抗體固定在硝酸纖維素膜T處；③將兔抗鼠IgG抗體〔二抗〕固定在硝酸纖維素膜C處；④硝酸纖維素膜最下方A處〔附吸水紙〕是滴加待檢或接觸尿液部位，在硝酸纖維素膜最上方B處有吸水紙，有助于形成毛細(xì)管層析作用。早孕診斷〔原理〕將待檢尿液滴加在檢測(cè)試紙A區(qū)，或?qū)z測(cè)試紙A區(qū)插入待檢尿液中，通過層析作用待檢尿液向B區(qū)移動(dòng)，流經(jīng)G區(qū)時(shí)將膠體金標(biāo)記HCG抗體從玻璃纖維上復(fù)溶，假設(shè)待檢尿液中含有HCG，即形成膠體金標(biāo)記抗體-HCG復(fù)合物；上述復(fù)合物遷移至T區(qū)時(shí)，可被固相HCG抗體識(shí)別結(jié)合，形成固相HCG抗體-HCG-膠體金標(biāo)記抗體復(fù)合物，膠體金聚集呈現(xiàn)陽性紫紅色檢測(cè)線；剩余膠體金標(biāo)記抗體遷移到C區(qū)與兔抗鼠IgG抗體〔二抗〕結(jié)合，膠體金聚集呈現(xiàn)紫紅色質(zhì)控線。膠體金免疫層析雙抗夾心法試驗(yàn)原理示意圖早孕診斷〔結(jié)果分析〕①測(cè)試紙條出現(xiàn)兩條紫紅色反響線：為早孕陽性；②測(cè)試紙條檢測(cè)線顏色弱于質(zhì)控線：為早孕弱陽性；③測(cè)試紙條僅在質(zhì)控線呈現(xiàn)紫紅色條帶：為早孕陰性；④測(cè)試紙條質(zhì)控線處無紫色條帶出現(xiàn)：為試驗(yàn)無效。5.化學(xué)發(fā)光免疫分析〔CLIA〕Chemiluminescenceimmunoassay標(biāo)記物：魯米諾等。是將化學(xué)發(fā)光分析和免疫反響相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。6.免疫印跡法〔Westernblotting)先將抗原經(jīng)SDS電泳分開，再將分開的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到醋酸纖維膜上，然后放入含有抗體的溶液中，洗去未結(jié)合抗體，再加標(biāo)記的二抗，通過顯色或發(fā)光顯示結(jié)果。第二節(jié)

免疫細(xì)胞及其功能檢測(cè)葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法:

BeforecentrifugeAftercentrifugeFig.1Fig.2一、外周血單個(gè)核細(xì)胞的別離二、淋巴細(xì)胞及其亞群的別離1.玻璃粘附法2.尼龍毛別離法3.E花結(jié)別離法T細(xì)胞羊紅細(xì)胞4.免疫吸附別離法〔洗淘法〕〔immunemagneticbead,IMB〕將抗細(xì)胞外表標(biāo)記的抗體交聯(lián)在磁性微珠上，與細(xì)胞懸液作用后置于磁場(chǎng)中，借磁力的作用將磁珠結(jié)合的細(xì)胞分開。5.免疫磁珠別離法6.流式細(xì)胞術(shù)〔flowcytometry〕別離法細(xì)胞用熒光素標(biāo)記的抗體染色，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)。檢測(cè)T細(xì)胞總數(shù):抗CD3檢測(cè)CD4+/CD8+T細(xì)胞:抗CD4/CD8檢測(cè)B細(xì)胞:抗SmIg三、淋巴細(xì)胞功能測(cè)定〔一〕T細(xì)胞功能測(cè)定：1.T細(xì)胞增殖試驗(yàn)：淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)觀察在有絲分裂原〔PHA、ConA〕或特異性抗原刺激下T細(xì)胞的增殖反響，測(cè)定細(xì)胞免疫功能。用3H-TdR法、MTT法測(cè)T細(xì)胞增殖。2.遲發(fā)型超敏反響皮膚試驗(yàn)：例如OT試驗(yàn)〔二〕B細(xì)胞功能測(cè)定1.血清免疫球蛋白含量測(cè)定2.抗體形成細(xì)胞測(cè)定試驗(yàn)3.酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)〔ELISPOT〕抗體形成細(xì)胞測(cè)定試驗(yàn)溶血空斑形成細(xì)胞試驗(yàn)〔三〕細(xì)胞毒試驗(yàn)