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文檔簡介

蛋白組學二維電泳演示文稿本文檔共23頁;當前第1頁;編輯于星期三\17點45分優(yōu)選蛋白組學二維電泳本文檔共23頁;當前第2頁;編輯于星期三\17點45分蛋白質(zhì)染色方法膠內(nèi):考馬斯亮藍R-250(CBBR-250)、CBBG-250、銀染、負染、熒光染料染色以及放射性同位素標記等轉(zhuǎn)移到膜(PVDF、硝酸纖維素膜)上:酰胺黑(AmidoBlack)、麗春紅S(PonceauS)本文檔共23頁;當前第3頁;編輯于星期三\17點45分(一)考染(考馬氏亮藍染色)1、考馬氏亮藍與蛋白質(zhì)反應機理

考馬氏亮藍(Coomassiebrilliantblue)是一類三苯基甲烷衍生物。分為R-250(紅蘭色)、R-350(紅蘭色)、G-250(藍綠色),它們與蛋白質(zhì)結(jié)合生成深藍色復合物,在464-595nm有吸收峰(595nm最大),且在比較寬的范圍內(nèi)(15-20μg

)掃描峰的面積與蛋白質(zhì)量成線性關系,因此可在595nm對蛋白質(zhì)進行定量檢測,而且在一定pH條件下,這種染料-蛋白質(zhì)復合物被完全解聚。

2、考染機理

膠體內(nèi)染料和溶液中自由擴散染料間形成平衡后,溶液中少量自由染料穿透凝膠基質(zhì),有選擇性地對蛋白質(zhì)進行染色,而膠體態(tài)的染料排阻在膠外,阻止了背景的生成。膠內(nèi)蛋白質(zhì)染色的關鍵是讓蛋白質(zhì)染色,而膠體不染色。本文檔共23頁;當前第4頁;編輯于星期三\17點45分CoommassieBrilliantBlueG-250本文檔共23頁;當前第5頁;編輯于星期三\17點45分3、考染程序考染程序至少600多種,主要變換是將以下程序中的醋酸換成三氯乙酸、磷酸或高氯酸,但三氯乙酸易使谷氨酸羧基側(cè)鏈不可逆酯化,造成肽譜數(shù)據(jù)復雜化。

(1)固定:凝膠浸泡于50%乙醇+10%冰醋酸水溶液中,至少1h,可過夜。

(2)染色:凝膠浸泡于染色液中至少2h。染色液組成:45%甲醇+10%冰醋酸+0.25%考馬氏亮藍G-250,混均過濾。

(3)脫色:多次更換脫色液,直至背景脫凈,稍稍提高溫度可加快脫色。脫色液組成:25%乙醇+8%冰醋酸。

(4)保存:凝膠脫色后水洗掃描備份,用保鮮膜包裹,一個月內(nèi)進行質(zhì)譜鑒定;長時間保存需將蛋白點切下,進一步脫色后貯于-80℃。本文檔共23頁;當前第6頁;編輯于星期三\17點45分4、考染特點

(1)可以獲得無背景或低背景的圖譜;

(2)染色過程需24-48h,所需時間較長;

(3)靈敏度不高,為100-10ng,只能檢測10-100ng的蛋白質(zhì),低豐度的蛋白質(zhì)難以顯色。本文檔共23頁;當前第7頁;編輯于星期三\17點45分(二)銀染1、原理:堿性銀氨(Ag(NH3)2+)染色法和酸性硝酸銀(AgNO3)染色法。

酸性硝酸銀染色法的原理是一個照相的過程,凝膠在酸性環(huán)境下與硝酸銀溫育,銀離子附與蛋白質(zhì)表面,然后在堿性環(huán)境下里用福爾馬林還原成金屬銀。

堿性銀氨染色法的原理是用氨水來形成銀氨復合物,銀氨復合物與膠內(nèi)SDS-蛋白質(zhì)復合物結(jié)合,然后在酸性條件下用福爾馬林將銀氨還原成金屬銀。本文檔共23頁;當前第8頁;編輯于星期三\17點45分2、特點(1)酸性銀染染色背景淺、容易控制,對酸性蛋白質(zhì)的染色靈敏度稍高,堿性銀染靈敏度稍高,但背景深、不容易控制。

(2)相對于考染,靈敏度高,可達200pg。

(3)但由于存在戊二醛的特異性反應,對下一步的酶切肽譜提取存在困難;增敏過程蛋白質(zhì)被部分提取至膠外。本文檔共23頁;當前第9頁;編輯于星期三\17點45分3、程序1.分析型銀染(不能用于質(zhì)譜鑒定)

(1)水洗膠5min;

(2)40%乙醇,10%乙酸固定1hr;

(3)5%乙醇,5%乙酸固定過夜;

(4)水洗20min兩遍;

(5)5%戊二醛

1hr;

(6)水洗30min四遍;

(7)250mL新鮮配制的銀氨液(1mLNaOH與5mL飽和氨水混合再加10mL20%AgNO3)/膠45min;

(8)水洗3min三遍;

(9)1.5mL1%檸檬酸、125μL37%甲醛/膠顯色;

(10)5%乙酸停顯10min;

(11)水洗10min三遍。本文檔共23頁;當前第10頁;編輯于星期三\17點45分2.快速銀染(和質(zhì)譜鑒定相匹配)本文檔共23頁;當前第11頁;編輯于星期三\17點45分(三)負染1、特點

(1)負染能提高SDS膠上蛋白質(zhì)的回收率,常用有銅染、鋅-咪唑染等。負染色結(jié)果在凝膠表面產(chǎn)生半透明背景,而凝膠顯示黑色背景或相應底色,蛋白質(zhì)以透明形式被檢測出來,而且蛋白質(zhì)被很好地保存下來。

(2)顯色過程僅需5-15min

(3)蛋白質(zhì)易從膠上取出,一般用EDTA絡合金屬離子就可轉(zhuǎn)移出蛋白質(zhì)。

(4)靈敏度15ng

2、原理(鋅-咪唑染料)

咪唑存在時,自由或弱結(jié)合的鋅離子以鋅-咪唑形式沉淀下來,而大部分鋅離子因與蛋白質(zhì)結(jié)合牢固而留在膠上,從而導致半透明背景上的空白區(qū)域,這就是負染過程。本文檔共23頁;當前第12頁;編輯于星期三\17點45分人肝癌細胞系MHCC97的部分雙向凝膠電泳鋅染圖譜本文檔共23頁;當前第13頁;編輯于星期三\17點45分鋅染程序(1)水洗1min;(2)0.2mol/L咪唑、0.1%SDS溶液10min;(3)0.2mol/L氯化鋅1min;(4)水洗5sec三遍;本文檔共23頁;當前第14頁;編輯于星期三\17點45分(四)熒光染色(Cy3和Cy5)1、原理:利用熒光染料對蛋白質(zhì)進行標記,在光激發(fā)下產(chǎn)生熒光,通過掃描得到圖象。比如用甲基Cy3與甲基Cy5兩種染料分別對兩個不同蛋白樣品進行熒光標記,并在一塊2-DE膠上進行運行,由于兩種染料激發(fā)波長不同,掃描時可得到兩張有差異的圖象,因此可用于差異蛋白質(zhì)組學研究。

2、特點

(1)靈敏度250pg與銀染相近,但線性范圍高于銀染。

(2)蛋白質(zhì)被熒光共價修飾,改變了移動性能,降低了溶解性,導致質(zhì)譜鑒定出現(xiàn)偏差。

(3)不同樣品由于所含蛋白質(zhì)可被熒光修飾的功能基團數(shù)不一樣,靈敏度變化不一樣。本文檔共23頁;當前第15頁;編輯于星期三\17點45分二維電泳熒光檢測RedCy3GreenCy5本文檔共23頁;當前第16頁;編輯于星期三\17點45分(五)SYPRORuby熒光染色基于釕的金屬螯合染料檢測靈敏度0.5-1ng染色速度快,15min可完成線性動態(tài)范圍廣需要紫外或激光檢測系統(tǒng)和質(zhì)譜檢測兼容本文檔共23頁;當前第17頁;編輯于星期三\17點45分總結(jié)染色方法靈敏度線性范圍與質(zhì)譜兼容性費用硬件要求考染10ng3++++銀染200pg7+++負染15ng3++++熒光標記250pg104

+++++++++++本文檔共23頁;當前第18頁;編輯于星期三\17點45分二維電泳的圖象分析本文檔共23頁;當前第19頁;編輯于星期三\17點45分圖象分析對雙向電泳圖譜上的這些蛋白質(zhì)點進行檢測、定量、比較、分析和歸類主要包括:圖象采集圖象分析:蛋白質(zhì)點檢測、背景消除、蛋白點匹配、歸一化處理、數(shù)據(jù)輸出數(shù)據(jù)庫的建立本文檔共23頁;當前第20頁;編輯于星期三\17點45分圖象采集(imagecollection)透射掃描方式光密度掃描:考染、銀染、負染激光誘導熒光掃描:熒光染色本文檔共23頁;當前第21頁;編輯于星期三\17點45分蛋白點檢測(spotdetection)蛋白點定位、點形狀、點豐度參數(shù)設定:最模糊的點、最小的點、最大的點和膠的背景本文檔共23頁;當前第2

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