蛋白質(zhì)樣品的全息制備演示文稿

蛋白質(zhì)樣品的全息制備演示文稿本文檔共153頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分優(yōu)選蛋白質(zhì)樣品的全息制備本文檔共153頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分2.蛋白質(zhì)樣品的要求：(1)收集到所有蛋白質(zhì)，其中包括不同豐度、不同物化特性的蛋白。(2)蛋白質(zhì)有活性，結(jié)構(gòu)沒有大的變化。(3)與其他大分子有機(jī)物有效分離，達(dá)到一定純度。(4)與后續(xù)的分離或鑒定方法相匹配，本文檔共153頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分3.生物材料的選擇

制備蛋白質(zhì)材料的來源無非是動物、植物和微生物。如果用于科學(xué)研究則材料的選擇可根據(jù)研究者的研究對象及目的要求選材。

動物組織要先除去結(jié)締組織、脂肪等非活性部分。

植物要先去殼、除脂。

微生物材料要及時(shí)將菌體與發(fā)酵液分開,采用聚凝、絮凝、離心、過濾等方法。本文檔共153頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分結(jié)締組織脂肪組織網(wǎng)狀組織

網(wǎng)狀纖維疏松結(jié)締組織致密結(jié)締組織(真皮、肌腱、鞏膜)等本文檔共153頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分植物去殼、脫脂本文檔共153頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分微生物菌體與發(fā)酵液分開

本文檔共153頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分4.樣品的采集（1）樣品要有代表性和可比性樣品的采集和處理是生化研究中的重要環(huán)節(jié)。在實(shí)際工作中，往往容易把注意力集中在具體的儀器測定上，而對采集和處理樣品不夠注意，結(jié)果導(dǎo)致了較大的實(shí)驗(yàn)誤差，甚至造成整個(gè)測定結(jié)果的失敗。采樣時(shí)間、部位，具有可比性，如按生育時(shí)期、某組織或器官采樣地點(diǎn)，一般在距田埂或地邊一定距離，或在特定的取樣區(qū)內(nèi)取樣。取樣點(diǎn)的四周不應(yīng)該有缺株的現(xiàn)象。本文檔共153頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分（2）樣品的數(shù)量應(yīng)當(dāng)不少于供分析用樣品的兩倍（3）凈化、保鮮，

取新鮮樣品時(shí)，常沾有泥土等雜質(zhì)，應(yīng)用柔軟濕布擦凈，不應(yīng)用水沖洗。樣品采離生物體后應(yīng)立即放于低溫下，即應(yīng)帶液氮罐或冰盒到田間取樣。樣品如暫不提取，應(yīng)在-80℃冰凍保存本文檔共153頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分第二節(jié)蛋白質(zhì)樣品裂解液成分分析一、概述雙向凝膠電泳技術(shù)具有高分辨率、高重復(fù)性、微量分析和制備等性能，是蛋白質(zhì)組研究中最主要的研究技術(shù)。雙向凝膠電泳蛋白質(zhì)樣品制備非常強(qiáng)調(diào)“全息”性制備。本文檔共153頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分理想的樣品制備方法應(yīng)滿足下列要求：（1）在合適鹽濃度下可重復(fù)地溶解所有的蛋白質(zhì)，并使樣品中的蛋白質(zhì)以分離的多肽鏈形式存在。（2）避免溶解度低的蛋白質(zhì)在等電聚焦時(shí)沉淀析出；即選擇適當(dāng)pH緩沖液；（3）防止蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾（4）排除核酸、多糖、脂類和其他干擾物質(zhì)（5）獲得的目標(biāo)蛋白質(zhì)在可探測水平，有時(shí)需要去除高豐度蛋白質(zhì)和不相關(guān)蛋白質(zhì)。本文檔共153頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分生物學(xué)問題的提出實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和對照組樣品的制備蛋白樣品的IEF和PAGE電泳分離圖像掃描和初步分析感興趣蛋白點(diǎn)的切取胰酶對脫色后蛋白質(zhì)的消化質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測序分析質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)其它實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白信息的初步獲得本文檔共153頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分二、蛋白質(zhì)樣品制備量裂解液的成分

為獲得最佳的雙向電泳分離結(jié)果，樣品一般使用促溶劑、去污劑、IPG緩沖液和兩性電解質(zhì)等將其變性并充分溶解,其功能是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為肽。

但這些物質(zhì)應(yīng)滿足一些化學(xué)和電學(xué)的要求，如適合IPG膠條的IEF技術(shù)、保持蛋白質(zhì)最大的溶解性和盡可能低的離子強(qiáng)度（等電聚焦加以高壓時(shí)，低離子強(qiáng)度使得電流很低，保證了聚焦的快速高效）。本文檔共153頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分1.離液劑

常用的離液劑（變性劑）主要為尿素，其主要作用是改變或破壞氫鍵等次級鍵的結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)去折疊，而變性或失活。通過引入硫脲，與尿素一起能有效的促進(jìn)蛋白質(zhì)于IPG中的溶解性，并可以提高不同亞細(xì)胞組分中蛋白質(zhì)的溶解，包括膜鑲嵌蛋白一類疏水性極強(qiáng)的蛋白質(zhì)。樣品裂解液包括下列成分本文檔共153頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分尿素和硫脲有效地破壞了疏水鍵，防止了聚集作用和二級結(jié)構(gòu)的形成，聚集作用和二級結(jié)構(gòu)的形成會改變蛋白質(zhì)的遷移性，而硫脲在水中溶解度差，需要高濃度的尿素助溶，通常是將硫脲加入5-7mol/L的尿素溶液中，使其濃度達(dá)到2mol/L。為防止尿素引起蛋白質(zhì)氨基甲?；?，可以向緩沖液中加入精胺。本文檔共153頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分2.還原劑作用在于還原二硫鍵或防止蛋白質(zhì)氧化。

蛋白質(zhì)經(jīng)去折疊后，暴露了疏水部分，為使蛋白質(zhì)完全去折疊，還有必要對二硫鍵用還原劑進(jìn)行還原。β-巰基乙醇及DTT為常用的還原劑。本文檔共153頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分但β-巰基乙醇及DTT帶電荷，在等電聚焦的過程中，能遷移到pH梯度以外，從而使部分蛋白質(zhì)的溶解性下降而不能很好的聚焦。本文檔共153頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分

Herbert(1998)用三丁基膦（TBP）替代了DTT一類的還原劑。TBP提高了蛋白質(zhì)的溶解度，并且提高了蛋白從第一向向第二向的轉(zhuǎn)移率，同時(shí)因?yàn)樗缓?，故不會被烷基化，將平衡步驟簡化為一步。本文檔共153頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分3.去污劑

主要作用①破壞蛋白質(zhì)分子間的疏水相互作用，②提高蛋白質(zhì)的溶解性，有助于溶解膜蛋白質(zhì)，并有助于膜蛋白質(zhì)與脂類的分離，③防止蛋白質(zhì)在等電聚焦時(shí)析出。去污劑將蛋白質(zhì)去折疊之后，有大量的疏水基團(tuán)暴露，為使蛋白質(zhì)有較高的溶解性，就需要在緩沖液中加入去污劑。本文檔共153頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分

去污劑有離子型、非離子型和兼性離子型。常用的有陰離子型去污劑SDS，非離子型去污劑NP-40及TritonX-100，兩性離子去污劑CHAPS

。

原則上去污劑應(yīng)該是非離子型或兼性離子型的，這樣才不會影響蛋白質(zhì)遷移到它們各自的等電點(diǎn)位置。

本文檔共153頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分離子型的SDS雖不利于等電聚焦，但SDS的緩沖液可抑制蛋白質(zhì)被內(nèi)原性蛋白酶降解，并能提高蛋白質(zhì)的溶解性，特別是膜蛋白的溶解性，故常用于樣品處理的初級階段。本文檔共153頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分4.兩性電解質(zhì)載體作用：

①能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解，②吸附高濃度尿素在溶液中形成的氰酸鹽離子，③離心時(shí)還有助于核酸的沉淀。④它還可阻止樣品蛋白質(zhì)和IPG膠條中固化的兩性電解質(zhì)的相互作用。本文檔共153頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分兩性電解質(zhì)，同時(shí)帶有可解離為負(fù)電荷和正電荷基團(tuán)的電解質(zhì)。如氨基酸兩性電解質(zhì)載體（Ampholime）；為一種相對分子質(zhì)量小于1000的，人工合成的多氨基多羧酸系列兩性化合物的復(fù)雜混合物。實(shí)際含量為40%的溶液。性狀：近無色至淺黃色透明液體。有粘性。本文檔共153頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分作用原理

它在大于其等電點(diǎn)的pH環(huán)境中解離成帶負(fù)電荷的陰離子，向電場的正極泳動，在小于其等電點(diǎn)的pH環(huán)境中解離成帶正由荷的陽離子，向電場的負(fù)極泳動。這種泳動只有在等于其等電點(diǎn)的pH環(huán)境中，即蛋白質(zhì)所帶的凈電荷為零時(shí)才能停止。本文檔共153頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分

MargaretM.Shawetal(2003)在緩沖液中加入兩性電解質(zhì)載體，可以阻止疏水性蛋白質(zhì)與IPG膠條的基質(zhì)發(fā)生作用（通常發(fā)生在堿性端），這樣可以減少因?yàn)槌练e而引起的條紋現(xiàn)象，同時(shí)還可以與核酸結(jié)合，高速離心可以除去這種復(fù)合物，減少核酸引起的污染。本文檔共153頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分即便在變性劑和表面活性劑存在的情況下，某些蛋白質(zhì)也需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否則這些蛋白質(zhì)在其處于PI點(diǎn)時(shí)會發(fā)生沉淀。兩性電解質(zhì)載體可增加蛋白質(zhì)溶解性。本文檔共153頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分兩性電解質(zhì)的濃度增加可增加分辨率本文檔共153頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分兩性電解質(zhì)必備的條件：①可溶性要好，為了保證等電聚焦過程中PH梯度的形成和蛋白樣品的遷移，載體兩性電解質(zhì)必須具有很好的溶解性能。②紫外吸收低，不發(fā)熒光。由于制備分離時(shí)，檢測蛋白質(zhì)的方法通常是測量280cm的吸光度，因此要求載體兩性電解質(zhì)在280cm的吸光度盡可能低。③在等電點(diǎn)處必需有足夠的緩沖能力，以便能控制pH梯度，而不致被樣品蛋白質(zhì)或其他兩性物質(zhì)的緩沖能力改變pH梯度的進(jìn)程。④在等電點(diǎn)必需的足夠高電導(dǎo)，以便使一定的電流通過，而且要求具備不同pH值的載體有相同的電導(dǎo)系數(shù)，使整個(gè)體系中的電導(dǎo)均勻，如果有局部電導(dǎo)過小，就會產(chǎn)生極大的電位降，從而其他部分電壓就會太小，以致不能保持梯度，也不能使應(yīng)聚焦的成分進(jìn)行電遷移，達(dá)到聚焦。本文檔共153頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分⑤分子量要小，便于與被分離的高分子物質(zhì)用透析或凝膠過濾法分開。⑥化學(xué)組成應(yīng)不同于被分離物質(zhì)，不干擾測定。⑦無毒、無生物學(xué)效應(yīng)。載體兩性電解質(zhì)對哺乳動物的組織培養(yǎng)，酶活性測定，免疫檢測或注射到小白鼠或大鼠中都沒有影響。⑧應(yīng)不與分離物質(zhì)反應(yīng)或使之變性?？偲饋碚f，當(dāng)一個(gè)兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)介于兩個(gè)很近的pk值之間時(shí)，它在等電點(diǎn)的解離度大，緩沖能力強(qiáng)，而且電導(dǎo)系數(shù)高，這就是好的載體兩性電解質(zhì)。本文檔共153頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分三、不同組織蛋白質(zhì)樣品裂解液（一）植物組織蛋白質(zhì)樣品裂解液1.玉米葉片裂解液

尿素(9.0mal/L)

硫脲(2.0mal/L)

DTT(100.0mmal/L)

去污劑(CHAPS)4%

pH3-10兩性電解質(zhì)溶液(0.5%)。本文檔共153頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分2.水稻葉片和根系尿素(7.0mal/L)硫脲(2mal/L)CHAPS(5%)兩性電解質(zhì)溶液(5%,Amphalines,pH3.5-10)巰基乙醇(2%)。本文檔共153頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分3.大豆胚軸尿素(4.8g/0.2mL)NP-40(0.2mL)兩性電解質(zhì)溶液(0.2mL,Amphaline,pH3.5-8)巰基乙醇(0.5mL)少許PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。本文檔共153頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分4.葡萄果實(shí)尿素(7.0mal/L)硫脲(2.0mal/L)DDT(65mmal/L)TritanX-I00(0.5%)CHAPS(4%)兩性電解質(zhì)溶液(5%,Ampholine,pH3-10)本文檔共153頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分5.桑樹葉尿素(7mal/L)硫脲(2mal/L)CHAPS(40mg/mL)DTT(2mg/mL)

IPG緩沖液(pH3.5--10,1%)PVP(聚乙烯吡咯烷酮,50mg/L)。本文檔共153頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分6.花粉尿素(8.0mal/L)硫脲(2.0mal/L)DTT(30mmol/L)Tris(20mmal/L)

CHAPS(4%)兩性電解質(zhì)溶液(5%,Bio-Lyte,pH3—l0)本文檔共153頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分(二)微生物樣品蛋白質(zhì)裂解1.植物病原細(xì)菌(1)Burkholderiaglumae(細(xì)菌性谷枯病菌）:尿素(8.0mal/L)硫脲(2.0mol/L)DDT(100mmal/L)CHAPS(2%,V/V)IPG緩沖液(2%,V/V,pH4-7)0.002%(w/V)溴酚藍(lán)。本文檔共153頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分2)Pantoeastewartii

（細(xì)菌性枯萎病菌）:尿素(5mal/L)硫脲(2mal/L)CHAPS(2%)SB3--10(2%)Tris(40mmal/L)兩性電解質(zhì)溶液(0.2%,Bio-Lyte3-10)本文檔共153頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分2.植物病原真菌(1)彎抱菌(Curularialunata):尿素(8mmol/L)、硫脲(2mal/L)DTT(100mmal/L)CHAPS(0.4%)兩性電解質(zhì)溶液CarrierAmpholyte(40%)溴酚藍(lán)(0.001%)Tween-20(0.25%)異丙醇(10%)甘油(5%)本文檔共153頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分(2)灰霉菌(Botrytiscinerea):尿素(8mmol/L)DTT(20mmol/L)CHAPS(2%)兩性電解質(zhì)溶液(0.5%,Bio-Lyte)本文檔共153頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分3.生物防治微生物(1)鏈霉菌(Streptomycesavermitilis):尿素(8mol/L或7mol/L)硫脲(2mol/L)CHAPS(2%)DTT(50mmol/L)兩性電解質(zhì)溶液Ampholytes(1%)。本文檔共153頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分(2)木霉菌:尿素(9.0mol/L)CHAPS(2%)DDT(1%)苯甲基磺酸氟(PMSF,10mmol/L)。本文檔共153頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分(三)動物樣品蛋白質(zhì)裂解1.綿羊細(xì)胞Tris-HCl(10mmol/L,pH7.4)NP-40(0.5%)NaCl(0.15mol/L)NaN3(0.1%)DNase和蛋白酶抑制劑(20μg/mL)。本文檔共153頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分2.牛肝組織尿素(8mol/L)CHAPS(4%w/V)DTT(65mmol/L)Tris-HCl(50mmol/L)、少量溴酚藍(lán)。本文檔共153頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分5.昆蟲細(xì)胞(1)家蠶絲腺或胚胎細(xì)胞尿素(8mol/L)硫脲(2mol/L)CHAPS(40g/L)Trisbase(20mmol/L)DTE(30mmol/L)兩性電解質(zhì)溶液(Pharmalyte,pH3-10,2%)。本文檔共153頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分(2)蜂蜜:尿素(8mol/L)CHAPS(2%)溴酚藍(lán)(0.001%)DTT(45mmol/L)兩性電解質(zhì)溶液(0.2%,Bio-Lyte,pH3-10)本文檔共153頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分第二節(jié)細(xì)胞裂解與蛋白質(zhì)提取一、細(xì)胞破碎的方法

不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細(xì)胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同。如動物臟器的細(xì)胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有較堅(jiān)固的纖維素、半纖維素組成的細(xì)胞壁，要采取專門的細(xì)胞破碎方法。本文檔共153頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分1.溫和的裂解方法主要用于易破碎的細(xì)胞。如組織培養(yǎng)細(xì)胞、血細(xì)胞、微生物等。也可用于亞細(xì)胞分離產(chǎn)物，如線粒體、高爾基體和膜等。本文檔共153頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分

1)反復(fù)凍融法：將待破碎的細(xì)胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室溫(或40℃)迅速融化，如此反復(fù)凍融多次，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎。該方法比較適用于細(xì)胞壁較脆弱易破的微生物菌體。但是該法存在破碎率低的問題，有時(shí)還會造成部分蛋白質(zhì)失活。本文檔共153頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分將待破碎的細(xì)胞先置于高滲溶液中，然后轉(zhuǎn)入低滲緩沖液中或水中，由于滲透壓發(fā)生改變，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，將細(xì)胞破裂，釋放出細(xì)胞內(nèi)含物。該方法適用于分析制備蛋白質(zhì)。0.5ml細(xì)胞液懸浮于20%蔗糖，30mmol/LTris-HCl(pH8,1mmol/LEDTA,0.1%tritonX100)溶液中室溫下1h10000g離心3min沉淀（細(xì)胞）懸浮于2ml冷水中冰浴中和攪拌10min4℃下5000g離心3min溶解蛋白上清液2)滲透壓沖擊法(溶脹法)：本文檔共153頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分3)去污劑法利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細(xì)胞，可將細(xì)胞膜溶解，從而使細(xì)胞破裂，此法也可以與研磨法聯(lián)合使用。本文檔共153頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分

4)酶消化法：

利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，一般于37℃，pH3～10，處理15分鐘～幾小時(shí)，可以專一性地將細(xì)胞壁分解。該法專一性強(qiáng)，操作條件溫和，效率高。但成本較高。且需先做預(yù)備試驗(yàn)，以確定合適的酶解溫度、pH及酶用量。本文檔共153頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分2.強(qiáng)烈的破碎方法1)超聲波處理法：此法是借助超聲波造成細(xì)胞懸浮液中氣泡的增大和爆裂，通過機(jī)械剪切力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器?？衫?5-25KHz的超聲波進(jìn)行細(xì)胞破碎。破碎效率受聲頻、聲能、處理時(shí)間長短、細(xì)胞類型及濃度等因素的影響。高粘度溶液或泡沫較多時(shí)破碎效率降低。另外，該過程易產(chǎn)熱，可能會使蛋白質(zhì)變性或水解。超聲波法應(yīng)以短脈沖，間隔冷卻的方式。本文檔共153頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分具體操作，用于分析時(shí)，0.3ml細(xì)胞泥懸浮于3ml緩沖液中于冰浴中超聲3次，每次1min，中間冷卻1min。用于制備時(shí)，5ml細(xì)胞泥懸浮于50ml緩沖液中于冰浴中超聲2次，每次4min，中間冷卻4min。該法適用于微生物細(xì)菌和酵母細(xì)胞破碎，優(yōu)點(diǎn)是破碎效果好,樣品用量少。缺點(diǎn)是不適用于大規(guī)模的細(xì)胞破碎。本文檔共153頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分250D型超聲波細(xì)胞破碎儀，數(shù)字式

●一般特點(diǎn)：

1)該細(xì)胞破碎儀功能強(qiáng)大，能用于許多液體處理應(yīng)用：

2)生物細(xì)胞破碎、均質(zhì)；

3)乳化；

4)加快反應(yīng)；

5)分散；

6)精細(xì)混合；

7)去氣；

小型超聲波細(xì)胞破碎儀，數(shù)字式

本文檔共153頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分

2)高速珠磨法：該法較多用于酵母細(xì)胞的破碎，破碎效果好，影響破碎效果的因素有細(xì)胞濃度、珠磨機(jī)的攪拌速度、珠大小及操作溫度。實(shí)驗(yàn)室中樣品量少可在聚乙烯試管中進(jìn)行，一般在試管中加入少量鋼珠（0.2mm），預(yù)冷后或用冷卻夾套，再窩旋。本文檔共153頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分在低溫下,將剪碎的動植物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿。低溫的要求視目的而定,一般在4℃下,有的要求更低,在液氮中研磨。適用于動植物組織。勻漿機(jī)是利用研磨機(jī)理，對動植物組織進(jìn)行柔軟的勻化處理，得到實(shí)驗(yàn)需要的細(xì)胞漿、線粒體。適用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)等領(lǐng)域，具有低速大力矩，無噪音等特點(diǎn)。3)研磨本文檔共153頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分4)高壓勻漿法（壓榨法）：這是一種溫和的、徹底破碎細(xì)胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa的高壓下使細(xì)胞懸浮液通過一個(gè)小孔突然釋放至常壓，細(xì)胞將徹底破碎。適用于厚壁細(xì)胞、酵母、細(xì)菌和較濃樣品的破碎。對于細(xì)胞膜結(jié)合的蛋白質(zhì)，一般需要多次破碎。通常待破碎細(xì)胞濕重與緩沖液體積之比為1:2--1:5時(shí)即可。操作應(yīng)盡可能在低溫下進(jìn)行，以免因?yàn)楫a(chǎn)生太多的熱量而導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活。高壓細(xì)胞破碎機(jī)，利用高壓原理對細(xì)胞進(jìn)行擠壓破碎，具有快速，方便，無噪聲的特點(diǎn)。本文檔共153頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分細(xì)胞破碎過程中一般都要釋放出蛋白質(zhì)酶,破壞目標(biāo)蛋白,因此要獲得良好的蛋白質(zhì)分離效果,需要利用各種類型的抑制劑抑制蛋白質(zhì)酶活性、保護(hù)目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)的完整性。本文檔共153頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分

常規(guī)的緩沖液足以使蛋白酶鈍化，但是有一些酶如組織蛋白酶C，幾種羧肽酶及內(nèi)源蛋白酶，胰蛋白酶等好幾種酶都還有一定活性，故需加入一些蛋白酶抑制劑。常加PMSF或者是蛋白酶抑制劑“雞尾酒”。本文檔共153頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分蛋白酶是一種獨(dú)特的酶,主要有:①絲氨酸蛋白酶,如膜蛋白酶、廉蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶等;②半脫氨酸蛋白酶(就基蛋白酶),如木瓜蛋白酶、組織蛋白酶B;③天冬氨酸蛋白酶,如胃蛋白酶、組織蛋白酶D、血管緊張膚原酶、凝乳酶等,只存在于真核生物中,包括真核微生物,而原核生物中元該類蛋白酶;④金屬蛋白酶,如嗜熱菌蛋白酶、起膚酶A及細(xì)菌和動物細(xì)胞內(nèi)的膠原酶等。本文檔共153頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分

抑制蛋白酶的方法①加入強(qiáng)變性劑(8mal/L尿素,10%的TCA或2%的SDS);②盡可能在低溫下進(jìn)行樣品制備;③通過創(chuàng)造堿性環(huán)境(pH超過9.0)使蛋白酶失活,如在樣品裂解液中加入Tris堿、兩性電解質(zhì)溶液和碳酸鈉,但有些蛋白酶在強(qiáng)堿性條件下仍然有活性;④加入蛋白酶抑制劑。本文檔共153頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分蛋白酶抑制劑主要有以下幾種PMSF(苯甲基磺酰氟)(2)金屬蛋白酶抑制劑(3)AEBSF[4-(2-氨乙基)苯磺酰氟](4)肽蛋白酶抑制劑(5)Benzamidine(6)甲苯磺酰賴氨酰氯甲酮(TLCK)(7)二異丙基磷酰氟(DFP)本文檔共153頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分(1)PMSF(苯甲基磺酰氟)是一種不可逆的抑制劑,常用濃度為1mmal/L,可抑制絲氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶,但是該抑制劑在水溶液中易失活,因此只能現(xiàn)用現(xiàn)加。由于溶液中β-巰基乙醇會干擾PMSF的抑制效果,因此含巰基的試劑應(yīng)在后幾步加入。本文檔共153頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分1）抑制絲氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，凝血酶）和巰基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）；2）10mg/ml溶于異丙醇（或無水乙醇）中；3）在室溫可保存一年；4）工作濃度：17-174ug/ml（0.1-1mM）；5）在水液體溶液中不穩(wěn)定，必須在每一分離和純化步驟中加入新鮮的PMSF。（見水分解，使用前加入）PMSF劇毒,

PMSF嚴(yán)重?fù)p害呼吸道粘膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進(jìn)或通過皮膚吸收后有致命危險(xiǎn)。本文檔共153頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分(2)金屬蛋白酶抑制劑主要種類有乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇雙四乙酸(EGTA),屬于可逆抑制劑,通過整合自由的金屬離子來抑制金屬蛋白酶活性,常用濃度為1mmal/L。本文檔共153頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分(3)AEBSF[4-(2-氨乙基)苯磺酰氟]屬于不可逆抑制劑,其作用機(jī)理與PMSF相似,但溶解性更好,且毒性較低。其不足之處是使蛋白質(zhì)等電點(diǎn)發(fā)生改變。常用濃度為4mmol/L。本文檔共153頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分(4)肽蛋白酶抑制劑:主要種類有亮肽蛋白酶(leupepetin)、抑胃肽A(pepstainA)和抑蛋白酶肽(aprotinin),均為可逆的蛋白酶抑制劑。其中：亮肽蛋白酶在含有DTT的溶液中以低濃度的形式保持活性,抑制一些絲氨酸和半脫氨酸蛋白酶的活性;抑胃肽A抑制天冬氨酸酸性蛋白酶活性;抑蛋白酶肽主要抑制絲氨酸蛋白酶活性。本文檔共153頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分(5)Benzamidine:常用濃度為1-2mmol/L,抑制絲氨酸蛋白酶。本文檔共153頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分(6)甲苯磺酰賴氨酰氯甲酮(TLCK)甲苯磺酰賴氨酰氯甲酮(TPCK):屬于不可逆抑制劑,主要抑制絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。常用濃度為0.1-0.15mmol/L。本文檔共153頁；當(dāng)前第69頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分(7)二異丙基磷酰氟(DFP)一種神經(jīng)毒氣,與酶活中心的絲氨酸的-OH非專一性結(jié)合。本文檔共153頁；當(dāng)前第70頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分從組織和細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)組研究中最關(guān)鍵的一步,因?yàn)檫@一步將影響蛋白質(zhì)的產(chǎn)率、生物活性和特定目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)的完整性。所以,選擇細(xì)胞破碎方法和蛋白質(zhì)提取方法的基本要求就是盡量減少對目標(biāo)蛋白的破壞。二、蛋白質(zhì)提取與沉淀方法本文檔共153頁；當(dāng)前第71頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分在制備蛋白質(zhì)提取物的過程中,極端的pH、溫度、機(jī)械壓力、高壓以及蛋白質(zhì)的水解作用都可能干擾蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)。即使蛋白質(zhì)的降解不會影響它的生物學(xué)活性,也可能影響目標(biāo)蛋白與細(xì)胞內(nèi)其他組分的相互關(guān)系,從而導(dǎo)致同一樣品兩批次提取得到不同的結(jié)果。因此,細(xì)胞裂解的方法對提取的蛋白質(zhì)的質(zhì)量有很大影響。本文檔共153頁；當(dāng)前第72頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分用于提取可溶性蛋白的組織選擇有幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)①目標(biāo)蛋白在不同組織中的分布是不同的,因而需要進(jìn)行小規(guī)模的預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測不同組織中目標(biāo)蛋白的相對含量;②原材料的最終選擇往往需要在幾個(gè)方面進(jìn)行權(quán)衡,即目標(biāo)蛋白的豐度、是否易于獲得、價(jià)格因素、目標(biāo)蛋白是否易被蛋白酶降解等;③盡量使用新鮮組織,某些條件下可使用冰冷組織,但需要迅速將組織切成小塊冰凍,一般不易放置過久;④某些情況下,最好在破碎細(xì)胞前先溫和地破碎組織以得到大量完整細(xì)胞。影響目標(biāo)蛋白從細(xì)胞中釋放的因素很多,如鹽溶度、去污劑的類型、二價(jià)陽離子和pH。本文檔共153頁；當(dāng)前第73頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分大多數(shù)情況下都是采用一步法進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品的制備,但由于不同蛋白質(zhì)的溶解度及豐度常常存在較大的差異,因此目前也有采用細(xì)胞分級或蛋白質(zhì)組分分級順序提取,目的是為了盡量把細(xì)胞中的全部蛋白質(zhì)提取出來。本文檔共153頁；當(dāng)前第74頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分(一)一步沉淀方法蛋白質(zhì)沉淀的目的主要是為隨后的雙向電泳分離提供高濃度和高純度的蛋白質(zhì)。通過沉淀過程蛋白質(zhì)樣品可去除大部分的鹽離子、核酸、脂類等雜質(zhì),從而確保雙向電泳圖譜的質(zhì)量。但需要注意的是,如果蛋白質(zhì)沉淀方法選擇不當(dāng),很可能使沉淀下來的蛋白質(zhì)很難或無法再溶解或懸浮。本文檔共153頁；當(dāng)前第75頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分常用的蛋白質(zhì)沉淀的方法有1.硫酸銨沉淀在高鹽溶液中,蛋白質(zhì)因聚合而從溶液中沉淀下來。通過洗滌沉淀的蛋白質(zhì)可去除雜質(zhì)?？筛鶕?jù)需求向蛋白質(zhì)溶液中緩慢加入硫酸銨至不同的飽和度,注意達(dá)到某一飽和度需要加入的硫酸銨量與環(huán)境溫度有關(guān)。加入硫酸銨時(shí)最好在磁力攪拌器上操作,邊加邊攪拌,這樣可防止蛋白質(zhì)變性。需要注意,蛋白質(zhì)上殘留的硫酸銨會干擾等電聚焦,因此必須通過透析的方法去除。本文檔共153頁；當(dāng)前第76頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分2.三氯乙酸(TCA)沉淀利用TCA沉淀蛋白質(zhì)的量明顯超過硫酸銨沉淀法。一般是將TCA加到提取液中,終濃度達(dá)10%-20%,冰浴上沉淀30min,通過離心便可獲得蛋白質(zhì)。組織樣品也可以直接用10%-20%的TCA進(jìn)行勻漿。TCA沉淀蛋白質(zhì)的不足之處是蛋白質(zhì)很難再溶或懸浮,并且,如果沉淀時(shí)間過長會造成化學(xué)修飾。一般在TCA沉淀后,要用丙酮清洗沉淀,以除去TCA。本文檔共153頁；當(dāng)前第77頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分3.丙嗣沉淀丙酮是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的提取或沉淀蛋白質(zhì)的有機(jī)溶劑。一般需要向蛋白質(zhì)溶液加入3-4倍體積的冰丙酮,然后在-20°C靜置2h以上,離心沉淀蛋白質(zhì),最后通過空氣干燥或凍干法除去丙酮。本文檔共153頁；當(dāng)前第78頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分4.丙酮與TCA聯(lián)用由于TCA所沉淀蛋白質(zhì)的難溶性,因此人們將丙酮和TCA結(jié)合使用,這樣可在發(fā)揮TCA沉淀蛋白質(zhì)強(qiáng)度高的優(yōu)點(diǎn)同時(shí),通過加入丙酮提高沉淀蛋白質(zhì)的再溶性。本文檔共153頁；當(dāng)前第79頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分通常是利用丙酮配制濃度10%的TCA提取液。至少在-20°C沉淀45min,通過離心沉淀蛋白質(zhì),然后用含有0.01%β-巰基乙醇溶液或20mmol/LDDT的冰丙酮清洗沉淀。通過空氣干燥或凍干去除殘留的丙酮。本文檔共153頁；當(dāng)前第80頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分5.乙酸銨沉淀用乙酸銨的甲醇溶液沉淀蛋白質(zhì),同時(shí)用酚抽提。沉淀的蛋白質(zhì)需要用甲醇-乙酸銨液洗滌若干次,然后再用丙酮清洗,并蒸發(fā)除去丙酮。本文檔共153頁；當(dāng)前第81頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分(二)分步提取法常規(guī)方法分離的蛋白質(zhì)多數(shù)是以親水性蛋白為主,而且僅占所鑒定總蛋白量的一小部分,對于疏水性蛋白丟失比較嚴(yán)重。盡管對細(xì)胞器和質(zhì)膜預(yù)分級可減少樣品的復(fù)雜性,然而,這要求豐富的經(jīng)驗(yàn)和超速離心機(jī)等價(jià)格昂貴的儀器。所以有人提出了利用蛋白質(zhì)溶解性的差異進(jìn)行分離,即分步法或順序法提取蛋白質(zhì)本文檔共153頁；當(dāng)前第82頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分蛋白質(zhì)的分步提取法的具體操作步驟分步提取法采用的裂解液的溶解性是逐漸增加的,第一步:溶解偏親水性蛋白第二步:溶解親水性、中性和疏水性的蛋白質(zhì)。第三步:主要溶解偏疏水性的蛋白質(zhì)。第四步:溶解常規(guī)提取不能溶解的膜蛋白、不溶性蛋白本文檔共153頁；當(dāng)前第83頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分第一步:水溶液的提取加入裂解液I(40mmol/LTris)、DNase和RNase溶解偏親水性蛋白。本文檔共153頁；當(dāng)前第84頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分第二步:含尿素/CHAPS/DTT溶液的提取。

加入裂解液II(8mol/L尿素,4%CHAPS,100mmol/LDTT,40mmol/LTris,0.5%PharmalytepH3--10,20μg/mLDNaseI和5μg/mLRNaseA),劇烈振蕩、混勻,離心收集上清液。溶解親水性、中性和疏水性的蛋白質(zhì)。本文檔共153頁；當(dāng)前第85頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分第三步:加入裂解液Ⅲ(5mol/L尿素,2%硫脲,2%CHAPS,2%SB3-10,2mmol/LTBP,40mmol/LTris,0.5%PharmalytepH310,20μg/mLDNaseI和5μg/mLRNaseA),劇烈振蕩、混勻,離心收集上清液。保存于-70°C。SB3-10、還原劑DTT、解聚劑硫脲主要溶解偏疏水性的蛋白質(zhì)。本文檔共153頁；當(dāng)前第86頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分第四步:在必要情況下,將第二步未溶解的細(xì)胞沉淀再用1%SDS、50mmol/LDTT、25%甘油及0.4mol/LTris-HCl(pH8.8)溶解抽提,這樣可使與細(xì)胞膜或細(xì)胞器中結(jié)合很牢的常規(guī)提取不能溶解的膜蛋白、不溶性蛋白能溶解出來。本文檔共153頁；當(dāng)前第87頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分基本步驟可依據(jù)樣品類型而變化,在多數(shù)情況下,大部分蛋白質(zhì)在第一步和第二步操作中就可以提取出來,而且第一步和第二步操作很可能出現(xiàn)類似的圖譜。在提取過程中的重疊現(xiàn)象依賴于破碎細(xì)胞和組織所選用的物理過程的效率高低。

例如,在超聲波破碎時(shí),大腸桿菌可以在數(shù)秒內(nèi)完全裂解,而結(jié)核桿菌則需要25min以上,所以在樣品制備前需要摸清材料的基本特點(diǎn)。本文檔共153頁；當(dāng)前第88頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分蛋白質(zhì)的分步提取法已被證實(shí)是一種快速有效的分級和濃縮不溶性蛋白質(zhì)的方法。本文檔共153頁；當(dāng)前第89頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分(三)不同組織材料蛋白質(zhì)常用提取方法1.植物組織的蛋白質(zhì)提取一般是利用含有一定濃度的DTT(通常為0.2%)的緩沖液在具液態(tài)氮的研缽內(nèi)研磨植物材料,然后離心,留上清液,并加入TCA/丙酮液沉淀蛋白質(zhì),最后用裂解液分解收集的蛋白質(zhì)沉淀物。本文檔共153頁；當(dāng)前第90頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分優(yōu)點(diǎn):①克服了蛋白質(zhì)在TCA/丙酮提取過程中可能發(fā)生的氧化作用,保持蛋白質(zhì)在提取過程的還原狀態(tài)。②可提高單位質(zhì)量植物組織中蛋白質(zhì)的提取量。③去除了植物次級代謝產(chǎn)物,如一些色素帶來的影響。④純化組織內(nèi)蛋白酶活性。本文檔共153頁；當(dāng)前第91頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分缺點(diǎn)①會丟失一些蛋白質(zhì),②所沉淀的不一定全部是蛋白質(zhì),可能還包括一些植物組織的粗纖維,所以在裂解液分解后還要通過離心去除不溶的纖維組織。本文檔共153頁；當(dāng)前第92頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分稱取新鮮葉或根2g左右

液氮研磨成細(xì)粉，分裝入1.5mL離心管中

加入1mL左右蛋白提取液Ⅰ（含三氯乙酸和β-巰基乙醇的丙酮溶液）沉淀粗蛋白（-20℃1h）

在4℃下13000rpm離心20min

再加入相同體積蛋白提取液Ⅱ（含β-巰基乙醇的丙酮溶液）懸浮粗蛋白（-20℃1h）

在4℃下13000rpm離心20min

取沉淀，棄上清，重復(fù)用蛋白提取液Ⅱ懸浮清洗3次（-20℃1h）（主要去除鹽離子和有機(jī)雜質(zhì)如色素和多酚）

真空抽干（大約30-60min）得粗蛋白干粉（可貯于-20℃?zhèn)溆茫┍疚臋n共153頁；當(dāng)前第93頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分

粗蛋白干粉

用裂解液UTC溶解沉淀（25μl裂解液/mg沉淀），并在室溫下放置1h（裂解期間不斷渦旋5-6次/小時(shí)）

在20℃下13000rpm離心15min

取上清液，棄沉淀不溶物

蛋白含量測定

SDS

2-D電泳剩余部分貯存于-80℃?zhèn)溆帽疚臋n共153頁；當(dāng)前第94頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分2.哺乳動物組織的蛋白質(zhì)提取從動物組織中制備蛋白質(zhì)提取物是比較簡單的,因?yàn)閯游锛?xì)胞沒有細(xì)胞壁,而且細(xì)胞膜非常脆弱,很容易被滲透壓和機(jī)械力所破碎。通常是先進(jìn)行組織洗滌,再利用勻漿器破碎,在緩沖液中離心,留上清液,加入沉淀試劑,離心，可得蛋白質(zhì)。本文檔共153頁；當(dāng)前第95頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分一般用于雙向電泳的樣品蛋白質(zhì)不需要考慮保留其生物活性,細(xì)胞可以在強(qiáng)變性條件下裂解。本文檔共153頁；當(dāng)前第96頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分如果用于免疫沉淀研究,則一定要選用溫和的條件,確保蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性,如使用兩性離子去污劑而不是離子型去污劑,低濃度而不是高濃度,單一去污劑而不是混合去污劑。本文檔共153頁；當(dāng)前第97頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分

如果在裂解過程中發(fā)現(xiàn)蛋白酶對目標(biāo)蛋白有降解作用,則可考慮在低溫下向提取的蛋白質(zhì)或向裂解液中加入蛋白酶抑制劑。本文檔共153頁；當(dāng)前第98頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分

稱取適量動物組織

液氮研磨成粉末狀組織

將適量粉末轉(zhuǎn)移至勻漿器，加入適量裂解液，進(jìn)行勻漿

加50ug/mlRNase及200ug/mlDNase，在4℃放置15分鐘。

15,000轉(zhuǎn)，4℃離心60分鐘（或40,000轉(zhuǎn)，4℃離心30分鐘）。收集上清分裝樣品，凍存于－70℃本文檔共153頁；當(dāng)前第99頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分勻漿緩沖液的成分主要有Tris-HCl(50mmol/L)10%甘油或蔗糖(0.25mol/L)EDTA(0-5mmol/L)NaCl(150mmol/L)DTT(0.5mmol/L)苯甲基磺酌氟(PMSF)(1.0mmol/L)。本文檔共153頁；當(dāng)前第100頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分首先利用韋林?jǐn)嚽衅髌扑閯游锝M織器官,然后采用手動的或動力驅(qū)動的勻漿器在4°C的勻漿液中勻漿、過濾、清除脂類和黏蛋白。本文檔共153頁；當(dāng)前第101頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分3.細(xì)菌蛋白質(zhì)的提取首先,在4℃下3000g離心15min收集細(xì)菌,然后用裂解緩沖液洗細(xì)胞,除去殘留的培養(yǎng)基,離心收集洗過的細(xì)胞,留沉淀。每克細(xì)胞沉淀用約3mL裂解緩沖液重懸浮,4℃條件下攪動懸浮液30min,或用韋林?jǐn)嚽衅鞯退倩旌蠎腋∫?min。加溶菌酶至濃度1g/L,并在4℃條件下孵育35min,溫和振蕩。按順序加入NP-40(5g/L)、MgCl2(5mmol/L)、DNaseI(40μg/mL),攪動懸浮液30min,除去黏性的核酸。懸浮液在4℃條件下,23000g離心30min,沉淀用含有DTT的Laemmli緩沖液重懸浮,最后利用SDS分析可溶性蛋白組分和沉淀。。本文檔共153頁；當(dāng)前第102頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分細(xì)胞裂解過程中,DNA的釋放經(jīng)常導(dǎo)致提取物高度黏稠。除了用DNaseI處理外,也可以加入帶正電荷的化合物,如魚精蛋白硫酸鹽或聚乙烯亞胺本文檔共153頁；當(dāng)前第103頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分細(xì)胞樣品的一般處理步驟1)吸出培養(yǎng)液，用胰酶消化。2)加入PBS，1500ｇ離心10分鐘，棄上清。重復(fù)3次。3)加入5倍體積裂解液，混勻（或在2×106細(xì)胞中，加入1ｍl裂解液）（或?qū)?×106細(xì)胞懸于60～100ｕｌ裂解液中）。4)液氮中反復(fù)凍融3次。5)加50ug/mlRNase及200ug/mlDNase，在4℃放置15分鐘。6)15,000轉(zhuǎn)，4℃離心60分鐘（或40,000轉(zhuǎn)，4℃離心30分鐘）。7)收集上清。8)分裝樣品，凍存于－70℃。本文檔共153頁；當(dāng)前第104頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分4.真菌蛋白質(zhì)的提取將純培養(yǎng)獲得的真菌菌絲體用無菌水沖洗3次,過濾,瀝干水分,置于-80℃超低溫冰箱中冷凍。在液氮條件下研磨菌絲體,同時(shí)加入5倍樣品量(mg/mL)的預(yù)冷(-20℃)蛋白樣提取液(含有10%-30%TCA和0.07%-0.3%DTT的丙酮溶液),勻漿、渦旋5min左右,然后將提取物在-20℃條件下靜置3h以上。在4℃下,15000-30000g離心20-30min,留沉淀。用含有0.07%-0.3%DTT的丙酮溶液淋洗3次。將獲得的蛋白質(zhì)在真空冷凍干燥機(jī)上冷凍成蛋白質(zhì)干粉,-70℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。本文檔共153頁；當(dāng)前第105頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分5.花粉蛋白質(zhì)組的提取將冷藏的花粉在預(yù)冷的研缽中研磨至粉末狀,再用50mgEppendorf管分裝,20℃保存?zhèn)溆??；ǚ鄯勰┰诶鋬鰲l件下用磷酸緩沖液(pH7.6,含32.5mmol/LK2HP04,2.6mmol/LKH2Po4,400mmol/LNaCl)研磨50min,超聲波處理5min.4℃下,12000g離心10min,15000g再離心10mino避開脂肪層,吸取上清液放入另一Eppendorf管中,沉淀中加入上述磷酸緩沖液,冰上研磨3min,超聲波處理1min,4℃下15000g離心10min。避開脂肪層,吸取上清液,合并上清液,作為磷酸易溶性蛋白溶液備用。本文檔共153頁；當(dāng)前第106頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分沉淀中加入蛋白裂解緩沖液(8mol/L尿素,2mol/L硫服,4%CHAPS,20mmol/LTris堿,30mmol/LDTT,o.5%Bio-Lyte,pH3-10),冰上研磨25min,超聲波處理3mino4℃下15000g離心10mino避開脂肪層,吸取上清液作為磷酸難溶性蛋白溶液。兩類蛋白液合并,加入100%TCA使其終濃度達(dá)到10%,冰上靜置10min。除去沉淀蛋白質(zhì)中的鹽分。將此混合液4℃,15000g離心10min,棄去上清液,沉淀中加入上述蛋白裂解緩沖液,冰上研磨10min,超聲波處理3min,使混合液充分溶解,用2mol/LNaOH調(diào)溶液pH至近中性,制成蛋白質(zhì)樣品溶液,直接使用或是-70℃冷藏備用。本文檔共153頁；當(dāng)前第107頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分三、特殊蛋白質(zhì)的分離(一)低豐度蛋白低豐度蛋白往往具有重要的功能。1.

增加樣量和提高總蛋白的溶解度能增加分離時(shí)的低豐度蛋白的量,但同時(shí)增加了高豐度蛋白的負(fù)荷,且造成蛋白質(zhì)的疊加效應(yīng)從而影響分離。

2.現(xiàn)常用預(yù)分級加窄pH膠的微制備技術(shù)進(jìn)行低豐度蛋白的分離,即將總蛋白組分成蛋白質(zhì)組亞群,再用pH梯度小于2個(gè)pH單位的IPG膠進(jìn)行窄pH范圍的分離,或設(shè)法事先去除高豐度蛋白本文檔共153頁；當(dāng)前第108頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分(二)強(qiáng)堿性蛋白先將蛋白質(zhì)預(yù)處理以富集,再用特殊pH梯度的IPG膠條(如pH3~12、pH4~12或pH10~12)進(jìn)行等電聚焦。其中窄范圍堿性IPG膠(如pH10~12)需要克服反向、陰極向陽極、電滲流的影響。本文檔共153頁；當(dāng)前第109頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分(三)極端分子質(zhì)量蛋白質(zhì)

小于8kDa和大于200kDa的蛋白質(zhì)在常規(guī)IPG-2D上不易看到,這可能是在Tris/glycine緩沖液中,樣品和游離的烷基磺酸納離子持續(xù)積累濃縮,與小分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)發(fā)生對流混合,產(chǎn)生茸毛狀的或模糊的帶,從而降低小蛋白的分辨率;在膠底端,高濃度的十二磺酸使蛋白質(zhì)固定和染色困難。對于極端分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的分離,需要考慮采用其他蛋白質(zhì)分離技術(shù)。本文檔共153頁；當(dāng)前第110頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分四、雜質(zhì)種類及清除方法樣品中非蛋白的不純物質(zhì)可能干擾蛋白質(zhì)的分離及雙向電泳圖譜的質(zhì)量,因此,在樣品制備中需要清除這些雜質(zhì)。一般來說,影響雙向電泳的雜質(zhì)包括小離子分子(鹽離子、內(nèi)源小分子、離子去污劑)、核酸、多糖、脂類、酚類及一些不溶物質(zhì)。

本文檔共153頁；當(dāng)前第111頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分1.小離子分子雙向電泳中存在的小離子分子可能來源于：1）研究材料本身,如組織中的代謝物和血清中的無機(jī)鹽,2）在制備樣品時(shí)被作為添加劑使用的成分,如緩沖液、無機(jī)鹽、離子去污劑等。本文檔共153頁；當(dāng)前第112頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分這些物質(zhì)可干擾等電聚焦，其方式有①鹽離子可導(dǎo)致溶液的電導(dǎo)率增大,延長等電聚焦時(shí)間,直到離子移至膠條末端時(shí)聚焦才完成。②鹽積聚在膠條內(nèi)的陽極或陰極端，產(chǎn)生高傳導(dǎo)性區(qū)域，使蛋白質(zhì)不能在此處聚焦（如出現(xiàn)水平條紋），離子去污劑SDS與多肽形成復(fù)合物，干擾正常聚焦。本文檔共153頁；當(dāng)前第113頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分去鹽可的方法1.采用透析、旋轉(zhuǎn)透析、凝膠過濾和沉淀/重懸浮等方法,2.在初始步驟就采用低離子強(qiáng)度的洗滌溶液來解決,如Tris-山梨醇緩沖液。對于SDS的去除,可采用兼性離子去污劑或非離子去污劑的重泡脹溶液稀釋含SDS的樣品或加入丙酮并在高溫下沉淀蛋白質(zhì)。本文檔共153頁；當(dāng)前第114頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分2.核酸樣品中DNA和RNA的存在(特別是高濃度的核酸)可導(dǎo)致IEF膠上的酸性區(qū)難以聚焦;如果對雙向凝膠進(jìn)行銀染,核酸會產(chǎn)生高背景。而且,DNA的存在使樣品黏性太高,阻滯凝膠孔徑。如果分離的蛋白質(zhì)通過銀染檢測,凝膠中的核酸也將染色,從而導(dǎo)致高背景。本文檔共153頁；當(dāng)前第115頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分清除核酸的方法:①使用DNase和RNaseA,但DNase和RNaseA也可能出現(xiàn)在雙向電泳的圖像中。目前已可用Benzanase解決這一不足,Benzanase是細(xì)菌的一種特異性內(nèi)源DNA和RNA核酸酶,在8mal/L尿素存在時(shí),可保持足夠活性,且使用濃度可以很低,不會在雙向凝膠中出現(xiàn)。②使用超速離心法除去大分子核。然而該方法也會除去高分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)。③用高離子強(qiáng)度或高pH提取溶液減少核酸的干擾在應(yīng)用低離子強(qiáng)度的提取溶液時(shí),帶負(fù)電荷的核酸很可能與帶正電荷的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物,使用高離子強(qiáng)度提取或高pH的提取液提取,就可最大限度減少這些相互作用。本文檔共153頁；當(dāng)前第116頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分3.多糖多糖可以阻礙凝膠孔徑,導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀,延長聚焦時(shí)間,有時(shí)也會出現(xiàn)水平條紋;某些多糖含有負(fù)電荷,能與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物。通常用硫酸銨或苯酚/乙酸的方法進(jìn)行沉淀,隨后離心;超速離心也可以除去高分子多糖。本文檔共153頁；當(dāng)前第117頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分4.脂類脂類和蛋白質(zhì)形成復(fù)合物,減少蛋白質(zhì)的溶解度。它們也可以和去污劑形成復(fù)合物,使得去污劑的效率降低。通過有機(jī)溶劑沉淀可從樣品中除去多數(shù)脂類。采用強(qiáng)變性劑和去污劑可最大限度減少蛋白質(zhì)與脂類的相互作用,但可能需要較多的去污劑。本文檔共153頁；當(dāng)前第118頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分5.酚類化合物許多植物組織中存在酚類化合物,可通過酶催化氧化反應(yīng)將蛋白質(zhì)修飾:①采用還原劑可阻止氧化反應(yīng)的發(fā)生,在樣品制備時(shí)加入DTT、DTE、亞硫酸鹽或維生素C都可阻止氧化;②通過沉淀方法迅速從酚組分中分離蛋白質(zhì);③用抑制劑,如硫脲來滅活多酚氧化酶;④用聚乙烯吡咯烷酮吸收、清除酚組分。本文檔共153頁；當(dāng)前第119頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分6.不溶物質(zhì)在樣品中的不溶物質(zhì)能阻礙凝膠孔徑,并導(dǎo)致聚焦不良。采用杯上樣法可阻礙不溶物質(zhì)進(jìn)入IPG膠條中。本文檔共153頁；當(dāng)前第120頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分實(shí)例1疏水蛋白質(zhì)Molloy用氯仿、甲醇（有機(jī)溶劑）、硫脲，去污劑（表面活性劑）、三丁基膦化氫（還原劑）等溶劑提取出許多疏水蛋白質(zhì)。質(zhì)譜檢測表明13種蛋白質(zhì)中有9種在從前的雙向電泳中從未出現(xiàn)過本文檔共153頁；當(dāng)前第121頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分實(shí)例2低豐度蛋白樣品分級：降低樣品復(fù)雜度，富集低拷貝蛋白；亞細(xì)胞分級，選擇性沉淀，分級提?。ǖ鞍踪|(zhì)在一系列溶解能力逐漸增強(qiáng)的裂解液中溶解性能不同而實(shí)現(xiàn)）CibracanDye色譜技術(shù)濃縮用ProtoClear技術(shù)處理，人血漿中至少95%白蛋白和97%IgG被清除。本文檔共153頁；當(dāng)前第122頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分實(shí)例3極堿性蛋白濃縮：TCA/丙酮沉淀法，可以失活蛋白酶，減少蛋白降解，去除干擾物，富集極堿性蛋白，如從全細(xì)胞裂解液中富集核糖體蛋白樣品處理提高電泳效果：堿性范圍內(nèi)凝膠基質(zhì)不穩(wěn)定，會產(chǎn)生逆向電滲透，除了可以用N,N’雙甲基丙稀酰胺增加基質(zhì)穩(wěn)定性外，對等電點(diǎn)超過10的堿性蛋白質(zhì)，通過1－10％的山梨醇梯度和16％的異丙醇減少不穩(wěn)定性，提高電泳效果本文檔共153頁；當(dāng)前第123頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分第四節(jié)亞細(xì)胞器的分離與蛋白質(zhì)提取蛋白質(zhì)的大多數(shù)功能都是通過亞細(xì)胞器水平上實(shí)現(xiàn)的,通過亞細(xì)胞的功能就可以初步判斷蛋白質(zhì)的功能。由于細(xì)胞的區(qū)隔化作用,使每一個(gè)亞細(xì)胞器具有自己的一套蛋白質(zhì)系統(tǒng),這種蛋白質(zhì)系統(tǒng)功能分布的特異性決定了細(xì)胞的功能。本文檔共153頁；當(dāng)前第124頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分要了解蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能,就需要知道其亞細(xì)胞定位和在受到外界剌激時(shí)從細(xì)胞的一個(gè)區(qū)室遷移到另一個(gè)區(qū)室的相關(guān)信息。共同協(xié)作執(zhí)行同樣生理功能,如參與代謝(代謝通路)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路)、程序性死亡(凋亡)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的維持(細(xì)胞骨架)等的蛋白質(zhì),應(yīng)位于同一細(xì)胞區(qū)室。本文檔共153頁；當(dāng)前第125頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分由于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的數(shù)量是巨大的,而且細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)補(bǔ)體是處于動態(tài)的,如果不先對細(xì)胞組分進(jìn)行分離,就無法開展整個(gè)細(xì)胞蛋白質(zhì)組的研究。因此有必要進(jìn)行亞細(xì)胞分離技術(shù)的研究,以減少全細(xì)胞分析的復(fù)雜性。一旦獲得亞細(xì)胞器后,便可進(jìn)一步對其蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和鑒定,研究其在細(xì)胞內(nèi)不同生理狀態(tài)下的表達(dá)情況。本文檔共153頁；當(dāng)前第126頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分一、亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的概念亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)是針對細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域結(jié)構(gòu)功能單位的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行研究。

本文檔共153頁；當(dāng)前第127頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分細(xì)胞內(nèi)可分成不同細(xì)胞器或細(xì)胞區(qū)域,如細(xì)胞膜、線粒體等。另外,細(xì)胞內(nèi)一些功能單位多是分子結(jié)構(gòu)體或多蛋白復(fù)合體,如核基質(zhì)、剪接體、紡錘體、核孔結(jié)構(gòu)及核糖體等。

這些細(xì)胞器、多蛋白組成的功能單位的區(qū)域化分布和聚集方式?jīng)Q定該細(xì)胞的功能是亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要對象。本文檔共153頁；當(dāng)前第128頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分研究亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的意義在于:①可以富集低豐度的蛋白質(zhì),完善全細(xì)胞蛋白質(zhì)組;②提供蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位信息;③加深對亞細(xì)胞組分的結(jié)構(gòu)功能理解;④加深對細(xì)胞生理分子機(jī)制的理解;⑤研究亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)譜。本文檔共153頁；當(dāng)前第129頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分亞細(xì)胞分離過程概括起來有兩個(gè)主要步驟:1.組織勻漿，在適當(dāng)條件下破碎細(xì)胞2.細(xì)胞器分離，以不同方法將不同細(xì)胞器進(jìn)行分級分離。二、亞細(xì)胞器分離的技術(shù)基礎(chǔ)本文檔共153頁；當(dāng)前第130頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分勻漿的目標(biāo)是:①用可重復(fù)的方法獲得最大限度的細(xì)胞裂解;②所使用的破壞力對目標(biāo)細(xì)胞器傷害最小;③保留目標(biāo)細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和功能的完整性本文檔共153頁；當(dāng)前第131頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分超速離心法是分離和提取生物大分子及亞細(xì)胞單位結(jié)構(gòu)的重要手段之一,這主要是利用細(xì)胞內(nèi)各種顆粒大小、形狀和密度不同,在不同離心力場下進(jìn)行差速離心或不同密度梯度離心,從而獲得不同亞細(xì)胞組分。本文檔共153頁；當(dāng)前第132頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分盡管分離亞細(xì)胞組分的目標(biāo)應(yīng)是最大限度地減少對所分離細(xì)胞組分的破壞,然而實(shí)際上目前的分離技術(shù)根本無法達(dá)到即在自然狀態(tài)下分離,同時(shí)又不破壞細(xì)胞器的要求。目前也沒有任何一種分離組織的方法可以適用于所有的組織,適用于某一組織的亞細(xì)胞的分離方法并不一定就適合于分離另一組織的細(xì)胞器。本文檔共153頁；當(dāng)前第133頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分(一)亞細(xì)胞器及其蛋白質(zhì)分離常用技術(shù)1.細(xì)胞的破碎方法破碎培養(yǎng)細(xì)胞或者破碎組織細(xì)胞可以采用滲透壓沖擊、超聲波震蕩、機(jī)械研磨等各種方法。整個(gè)過程可以通過顯微鏡實(shí)現(xiàn)監(jiān)控以確保細(xì)胞器結(jié)構(gòu)上的完整。本文檔共153頁；當(dāng)前第134頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分2.差速離心與密度梯度離心法勻漿產(chǎn)生的細(xì)胞裂解物通常通過一系列差速離心步驟和一個(gè)密度梯度來分離細(xì)胞器和粒子。一般來說,先進(jìn)行差速離心得到沉淀,然后再在密度梯度中進(jìn)行超速離心,這種逐漸加大離心力的順序離心及密度梯度離心的選擇將分別根據(jù)細(xì)胞成分的大小和密度來分離。本文檔共153頁；當(dāng)前第135頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分3.免疫共沉淀法信號復(fù)合體一般不能通過密度梯度離心純化,而免疫共沉淀是一個(gè)比較理想的方法,將目標(biāo)信號分子蛋白從細(xì)胞或亞細(xì)胞組分中沉淀后,供質(zhì)譜技術(shù)鑒定和基因功能分析。本文檔共153頁；當(dāng)前第136頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分4.親和層析法選擇一定的配體或配基,可將細(xì)胞或亞細(xì)胞內(nèi)不同親和特異性的蛋白質(zhì)組分逐一分離出來并繼以蛋白質(zhì)組學(xué)研究。本文檔共153頁；當(dāng)前第137頁；編輯于星期三\17點(diǎn)52分(二)亞細(xì)胞器的分離及蛋白質(zhì)提取1.線粒體線粒體在亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究中占有重要的地位,它是細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的細(xì)胞器,由一個(gè)雙層膜系統(tǒng)組成,外膜與內(nèi)膜隔開并包圍著內(nèi)膜,在內(nèi)膜的內(nèi)側(cè)為基質(zhì)。線粒體具有能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運(yùn)輸、調(diào)節(jié)離子平衡、信息傳遞和合成腺昔三磷酸等功能。在動物發(fā)生疾病或植物發(fā)生病害后,線粒體的呼吸相關(guān)酶系均要發(fā)生變化,而且線粒體已發(fā)現(xiàn)是某些植物病原菌毒素的作用位點(diǎn)。因此,分離線粒體蛋白對于動植