基因芯片的制作方法

關(guān)于基因芯片的制作方法第1頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三3.1概述

1.基因芯片是以Southern印跡雜交技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的。

反向雜交技術(shù)第2頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三2.基因芯片的制作方法：

原位合成法：Affymetrix公司

直接點樣法（合成后點樣）：Stanford大學(xué)，1995年第3頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三項目原位合成法直接點樣法探針預(yù)備不需要需要探針類型寡核苷酸寡核苷酸，cDNA，基因組DNA，蛋白等探針長度約25nt不限制聯(lián)合合成需要不需要芯片表面點樣不需要需要密度高低制作成本高低應(yīng)用基因表達(dá)，突變檢測基因表達(dá)，突變檢測，CGH第4頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三1.常見的載體類型

膜

玻片

三維基質(zhì)包被玻片3.2芯片載體的制作第5頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三（1）膜

優(yōu)點：與核酸親和力強(qiáng)。

缺點：單位面積上點樣密度低；

背景較高；

靈敏度低。第6頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三（2）玻片

優(yōu)點：耐受高溫和高離子強(qiáng)度；

具有不浸潤性，提高點樣密度；背景低。

缺點：二維的平面結(jié)構(gòu)，與DNA雜交時會有空間位阻。第7頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三（3）三維基質(zhì)包被玻片

具有三維孔性結(jié)構(gòu)，更適合做蛋白質(zhì)芯片的支持物，可以保持蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，不影響它的活性。第8頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三2.玻片的修飾類型氨基修飾玻片同型雙功能偶聯(lián)劑修飾的玻片硫醇基修飾的玻片環(huán)氧硅烷化修飾的玻片等第9頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三圖3-3APS修飾玻璃表面反應(yīng)示意（1）氨基修飾的玻片羥基氨基第10頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三對苯乙異硫氰酸（2）同型雙功能偶聯(lián)劑包被修飾的玻片異硫氰基第11頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三醛基戊二醛第12頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三連接分子手臂分子特異性探針第13頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三圖3-7SMPB連接硫醇基核苷酸和氨基玻片（3）連接硫醇基修飾的玻片硫醇基第14頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三圖3-8環(huán)氧硅烷化玻片修飾示意（4）環(huán)氧硅烷化修飾的玻片環(huán)氧硅烷基第15頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三1.cDNA探針2.寡核苷酸探針3.基因組DNA探針（很少用）4.RNA探針3.3探針的制備第16頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三cDNA探針：

主要來自cDNA文庫，從細(xì)胞或組織中提取RNA后逆轉(zhuǎn)。第17頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三寡核苷酸探針：

根據(jù)數(shù)據(jù)庫中的基因序列人工合成的。

通常在5’末端進(jìn)行氨基修飾，并加入一段不直接參與雜交的重復(fù)序列，稱為手臂分子，通常用polydT(10)。手臂分子特異性探針第18頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三探針分子與基片表面的作用方式

化學(xué)偶聯(lián)：探針分子與基片表面活性基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成新的共價鍵。

物理吸附：探針分子與基片表面通過次級鍵相連接。第19頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三3.4點樣儀及點樣過程接觸式點樣非接觸式點樣第20頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三1.接觸式點樣

點樣針。

基本過程：

點樣針接觸探針溶液，通過浸潤現(xiàn)象或毛細(xì)現(xiàn)象，使液體轉(zhuǎn)移到針尖或針的狹縫中。針尖再接觸基片，樣品在基片上留下斑點，完成一次點樣。第21頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三點樣針的種類：

實心針（solidpin）裂隙針（splitpin）毛細(xì)管針（capillarytube）針與環(huán)（pinandring）第22頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三best第23頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三第24頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三2.非接觸式點樣（自學(xué)）（1）微螺線閥

（2）壓電元件第25頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三接觸式非接觸式壓電元件微螺線閥1

1圖3-10當(dāng)前59家芯片設(shè)備生產(chǎn)商使用的點樣針分布情況（圖中的數(shù)字代表使用各點樣針的廠家數(shù)目）第26頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三3.5

原位合成法第27頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三操作平臺第28頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三Affymetrix芯片的特點：光導(dǎo)原位合成的寡核苷酸芯片高密度的點陣技術(shù)獨特的PM-MM探針設(shè)計

第29頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三1.光導(dǎo)原位合成原理第30頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三2.高密度的點陣技術(shù)1平方厘米的面積至少可排列上百萬個探針合成區(qū)（“點”)第31頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三3.Affymetrix獨特的PM-MM探針設(shè)計第32頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三圖3-11PM-MM探針設(shè)計方案第33頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三第34頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三高靈敏度圖3-12僅用PM探針與聯(lián)合應(yīng)用PM-MM探針檢測靶序列的靈敏度比較第35頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三芯片結(jié)果準(zhǔn)確可靠圖3-13PM-MM的多個探針的結(jié)果與單個探針的結(jié)果比較第36頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三第37頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三第38頁，講稿共41頁，2023年5月2日，星期三第39頁，講稿共41頁，2023年5