葉綠體色素含量的測定

關(guān)于葉綠體色素含量的測定第1頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三實驗?zāi)康?/p>

葉片的葉綠素含量直接影響著光合速率，并與氮素營養(yǎng)有密切的關(guān)系，在栽培、生理、農(nóng)化、育種等研究上是重要的診斷指標，常需測定和控制葉綠素含量。

掌握使用分光光度計定量測定葉綠素含量第2頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三葉綠素含量測定方法葉綠素的含量測定方法有多種，其中主要有：1.原子吸收光譜法：通過測定鎂元素的含量，進而間接計算葉綠素的含量2.分光光度法：利用分光光度計測定葉綠素提取液在最大吸收波長下的吸光值，即可用朗伯-比爾定律計算出提取液中各色素的含量第3頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三實驗原理

1

根據(jù)朗伯-比爾定律當一束單色光通過溶液時，溶液的吸光度與溶液的濃度和液層厚度的乘積成正比。

即：A=K*L*CK：比吸收系數(shù)L：液層厚度C：溶質(zhì)濃度(克/L)

第4頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三比吸收系數(shù)()的物理意義Lambert-Beer定律中的比例系數(shù)“K”的物理意義是：吸光物質(zhì)在單位濃度、單位液層厚度時的吸光度第5頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三比吸收系數(shù)()的性質(zhì)①

κ與溶液的濃度和液層厚度無關(guān)，與吸光物質(zhì)的特性及光的波長等有關(guān)，也受溫度和溶劑的影響。②對于同一波長下，當其他條件一定時(溫度、溶劑等)，κ的大小取決于物質(zhì)的性質(zhì)。③

對于同一物質(zhì)，當其他條件一定時(溫度、溶劑等)，κ的大小取決于波長。

∴κ能表示物質(zhì)對某一波長的光的吸收能力。κ越大，表明物質(zhì)對某波長的光吸收能力越強。第6頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三實驗原理

2吸光度的加和性

如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長下吸光度的總和

即：A=A1+A2+……+An第7頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三葉綠體色素提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素;只需測定該溶液在三個特定波長下的吸光度;根據(jù)這三個色素在該波長下的吸光系數(shù)即可求出其濃度第8頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三紅光區(qū)藍紫光區(qū)645nm663nm葉綠素a:663nm處最大吸收峰；葉綠素b:645nm處最大吸收峰；且兩吸收曲線相交于652nm處第9頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三類胡蘿卜素→吸收蘭紫光，不吸收紅光等長

波長的光葉綠素→吸收紅光、蘭紫光在測定葉綠素a、葉綠素b時，為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。第10頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三葉綠素a和葉綠素b的80%丙酮溶液，當濃度在1g/L時，比吸收系數(shù)k值:波長（nm）K值葉綠素a葉綠素b66382.049.2764516.7545.60645nm663nm第11頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三據(jù)此可列出下列方程式：A663、A645分別為葉綠素溶液在波長663、645nm處的光密度;Ca、Cb分別為葉綠素a、b的濃度(單位:克/升)A663=A葉綠素a+A葉綠素bA663=KaLCa+KbLCbA663=82.04Ca+9.27Cb……………(1)A645=16.75Ca+45.6Cb……………(2)第12頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三將上式整理，可以得到下式：Ca(g/L)=

0.0127A663-0.00269A645（3）Cb(g/L)=

0.0229A645-0.00468A663（4）將葉綠素的濃度改為mg/L，則上式變?yōu)椋篊a(mg/L)=

12.7A663-2.69A645（5）Cb(mg/L)=

22.9A645-4.68A663（6）－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－CT=Ca+Cb=8.02A663+20.21A645（7）CT為葉綠素的總濃度第13頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三紅光區(qū)藍紫光區(qū)645nm663nm470nm第14頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三類胡蘿卜素含量的測定在葉綠素存在的條件下，用分光光度法可同時測定溶液中的類胡蘿卜素含量在80％丙酮提取液中三種色素含量的計算公式(單位：mg/L)：C類胡蘿卜素=(1000A470–3.27Ca–104Cb)/229第15頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三

由于葉綠體色素在不同溶劑中的吸收光譜有差異，因此，使用其他溶劑提取色素時，計算公式有所不同第16頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三實驗材料與器材

實驗材料：青菜

實驗器材：50ml容量瓶、小漏斗，5ml移液管一只，研缽一套，剪刀一把，濾紙，天平，722型分光光度計

實驗試劑：80%丙酮第17頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三實驗步驟

11.鮮葉洗凈，吸水紙吸干，稱取0.5克（避開主葉脈）剪碎置于研缽中加少量石英砂和80%丙酮（約2-3ml）研成勻漿；2.倒入約20ml80%丙酮，靜置10分鐘；3.將上清液沿玻棒移入過濾的漏斗中（濾紙用80%的丙酮濕潤），濾入50ml容量瓶中；4.殘渣留在研缽里，再用80%丙酮反復(fù)提取2-3次，直至殘渣變白無綠色；5.然后用丙酮液沖洗濾紙變白為止；6.再用丙酮液定容到刻度，即為葉綠素提取液。第18頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三實驗步驟

2

將上述提取液注入1cm光徑的比色皿中（以80%丙酮液為對照）

用分光光度計分別在645nm、663nm、470nm處讀取光密度。第19頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三Ca=

12.7A663-2.69A645

Cb=

22.9A645-4.68A663

(單位：mg/L)C類胡蘿卜素=(1000A470–3.27Ca–104Cb)/229第20頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三實驗步驟

3將讀取的光密度A645和A663，計算提取液葉綠素a、b和類胡蘿卜素的濃度或葉綠素的總濃度，然后按下式計算葉綠素類胡蘿卜素在葉片中的含量：葉綠素含量或類胡蘿卜素(鮮重%)=或：葉綠素含量或類胡蘿卜素(毫克/克鮮重)=第21頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三實驗步驟葉片洗凈、吸干、去大葉脈↓稱0.5g葉,用80%丙酮研磨↓勻漿過濾（用80%丙酮洗研缽及殘渣，合并濾液）↓濾液用80%丙酮定容到50ml↓測A645、A663、A470

計算濃度和含量第22頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三實驗結(jié)果第23頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三注意事項1.為了避免葉綠素的光分解，操作時應(yīng)在弱光下進行，研磨時間盡量短些2.注意葉綠素一定要提取干凈，避免造成測定誤差3.葉綠素提取液不能混濁4.分光光度計轉(zhuǎn)換波長時要重新調(diào)零5.實驗過程中使用同一臺分光光度計測量第24頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三思考題1、分光光度法與一般的比色法有何異同？2、葉綠素a和b在藍光區(qū)也均有最大吸收峰，能否用這最大吸收峰波長進行葉綠素的定量測定分析？為什么？

第25頁，講稿共31頁，2023年5月2日，星期三分光光度計使用方法1.開啟電源，指示燈亮，儀器預(yù)熱20分鐘。2.波長調(diào)至測試用波長。3.開蓋T調(diào)0。（調(diào)節(jié)“0”旋鈕，使數(shù)字顯示為“00.0”）4.放入空白對照液，將光路對準空白對照位置5.關(guān)蓋T調(diào)100。（調(diào)節(jié)透過率“100%”旋鈕，使數(shù)字顯示為“100.0”）6.調(diào)A為0。（調(diào)節(jié)吸光度調(diào)零旋鈕，使得數(shù)字顯示為“.000”）