分子雜交技術(shù)

分子雜交技術(shù)分子雜交01簡介核酸探針標(biāo)記單鏈DNA探針技術(shù)簡介雙鏈DNA探針標(biāo)記法末端標(biāo)記DNA探針目錄030502040607寡核苷酸探針常見的雜交RNA探針目錄0908基本信息互補的核苷酸序列通過Watson-Crick堿基配對形成穩(wěn)定的雜合雙鏈DNA分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的，可以根據(jù)所使用的探針已知序列進(jìn)行特異性的靶序列檢測。雜交的雙方是所使用探針和要檢測的核酸。該檢測對象可以是克隆化的基因組DNA,也可以是細(xì)胞總DNA或總RNA。根據(jù)使用的方法被檢測的核酸可以是提純的，也可以在細(xì)胞內(nèi)雜交,即細(xì)胞原位雜交。探針必須經(jīng)過標(biāo)記，以便示蹤和檢測。使用最普遍的探針標(biāo)記物是同位素,但由于同位素的安全性，近年來發(fā)展了許多非同位素標(biāo)記探針的方法,多使用甾類化合物地高辛配基（digoxigenin，DIG）標(biāo)記。簡介簡介互補的核苷酸序列通過Watson-Crick堿基配對形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子DNA分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的，可以根據(jù)所使用的探針已知序列進(jìn)行特異性的靶序列檢測。

技術(shù)簡介技術(shù)簡介雜交的雙方是所使用探針和要檢測的核酸。該檢測對象可以是克隆化的基因組DNA,也可以是細(xì)胞總DNA或總RNA。根據(jù)使用的方法被檢測的核酸可以是提純的，也可以在細(xì)胞內(nèi)雜交,即細(xì)胞原位雜交。探針必須經(jīng)過標(biāo)記，以便示蹤和檢測。使用最普遍的探針標(biāo)記物是同位素,但由于同位素的安全性，近年來發(fā)展了許多非同位素標(biāo)記探針的方法,多使用甾類化合物地高辛配基（digoxigenin，DIG）標(biāo)記。核酸分子雜交具有很高的靈敏度和高度的特異性,因而該技術(shù)在分子生物學(xué)領(lǐng)域中已廣泛地使用于克隆基因的篩選、酶切圖譜的制作、基因組中特定基因序列的定性、定量檢測和疾病的診斷等方面。因而它不僅在分子生物學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛地應(yīng)用,而且在臨床診斷上的應(yīng)用也日趨增多。

核酸探針標(biāo)記核酸探針標(biāo)記核酸探針根據(jù)核酸的性質(zhì)，可分為DNA和RNA探針;根據(jù)是否使用放射性標(biāo)記物的與否,可分為放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針;根據(jù)是否存在互補鏈,可分為單鏈和雙鏈探針;根據(jù)放射性標(biāo)記物摻入情況,可分為均勻標(biāo)記和末端標(biāo)記探針。下面將介紹各種類型的探針及標(biāo)記方法。

雙鏈DNA探針標(biāo)記法雙鏈DNA探針標(biāo)記法分子生物研究中，最常用的探針即為雙鏈DNA探針，它廣泛應(yīng)用于基因的鑒定、臨床診斷等方面。雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:切口平移法和隨機引物合成法。1.切口平移法(nicktranslation)當(dāng)雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時,E.coliDNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3'羥基末端。同時該酶具有從5'→3'的核酸外切酶活性,能從切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時又在切口的3'端補上核苷酸,從而使切口沿著DNA鏈移動,用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素?fù)饺氲胶铣尚骆溨小Ｗ詈线m的切口平移片段一般為50-500個核苷酸。切口平移反應(yīng)受幾種因素的影響:(a)產(chǎn)物的比活性取決于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。(b)DNA酶Ⅰ的用量和E.coliDNA聚合酶的質(zhì)量會影響產(chǎn)物片段的大小。(c)DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性,故應(yīng)使用仔細(xì)純化后的DNA。材料：待標(biāo)記的DNA。設(shè)備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。試劑：(1)10×切口平移緩沖液:0.5mol/LTris·Cl(pH7.2);0.1mol/LMgSO4;10mmol/LDTT;100μg/mlBSA。單鏈DNA探針單鏈DNA探針用雙鏈探針雜交檢測另一個遠(yuǎn)緣DNA時,探針序列與被檢測序列間有很多錯配。而兩條探針互補鏈之間的配對卻十分穩(wěn)定,即形成自身的無效雜交,結(jié)果使檢測效率下降。采用單鏈探針則可解決這一問題。單鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:(1)以M13載體衍生序列為模板,用Klenow片段合成單鏈探針;(2)以RNA為模板,用反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA探針。1.從M13載體衍生序列合成單鏈DNA探針合成單鏈DNA探針可將模板序列克隆到噬粒或M13噬菌體載體中,以此為模板,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸為引物,在[a-32P]-dNTP的存在下,由Klenow片段作用合成放射標(biāo)記探針，反應(yīng)完畢后得到部分雙鏈分子。在克隆序列內(nèi)或下游用限制性內(nèi)切酶切割這些長短不一的產(chǎn)物,然后通過變性凝膠電泳(如變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)將探針與模板分離開。雙鏈RF型M13DNA也可用于單鏈DNA的制備,選用適當(dāng)?shù)囊锛纯芍苽湔溁蜇?fù)鏈單鏈探針。材料：已制備好的單鏈DNA模板（方法參見第十章中有關(guān)內(nèi)容）。設(shè)備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。試劑：(1)10×Klenow緩沖液：0.5mol/LNaCl,0.1mol/LTris·Cl(pH7.5);0.1mol/LMgCl2。末端標(biāo)記DNA探針末端標(biāo)記DNA探針現(xiàn)以Klenow片段標(biāo)記3'末端為例說明末端標(biāo)記的方法。1、材料：待標(biāo)記的雙鏈含凹缺3'末端的DNA。2、設(shè)備：高速臺式離心機，水浴鍋等。3、試劑：(1)3種不含標(biāo)記的dNTP各為200mmol/L。(2)合適的限制酶。(3)[α-32P]dNTP:3000Ci/mmol,10mCi/ul。(4)Klenow片段(5U/ml)。(5)10×末端標(biāo)記緩沖液:0.5mol/LTris·Cl(pH7.2),0.1mol/LMgSO4,1mmol/LDTT,500mg/mlBSA。4、操作步驟：(1)25μl反應(yīng)體系中用合適的限制酶酶切1μg的DNA。寡核苷酸探針寡核苷酸探針利用寡核苷酸探針可檢測到靶基因上單個核苷酸的點突變。常用的寡核苷酸探針主要有兩種:單一已知序列的寡核苷酸探針和許多簡并性寡核苷酸探針組成的寡核苷酸探針庫。單一已知序列寡核苷酸探針能與它們的目的序列準(zhǔn)確配對,可以準(zhǔn)確地設(shè)計雜交條件,以保證探針只與目的序列雜交而不與序列相近的非完全配對序列雜交,對于一些未知序列的目的片段則無效。1、材料：待標(biāo)記的寡核苷酸(10pmol/μl)。2、設(shè)備：高速離式離心機，恒溫水浴鍋等。3、試劑：(1)10×T4多核苷酸激酶緩沖液:0.5mol/LTris·Cl(pH7.6),0.1mol/LMgCl2,50mmol/LDTT,1mmol/LSpermidine·HCl,1mmol/LEDTA(pH8.0)。(2)[γ-32P]ATP(比活性7000Ci/mmol;10mCi/ml)。(3)T4多核苷酸激酶（10單位/ml）。RNA探針RNA探針許多載體如pBluescript,pGEM等均帶有來自噬菌體SP6或E.coli噬菌體T7或T3的啟動子,它們能特異性地被各自噬菌體編碼的依賴于DNA的RNA聚合酶所識別,合成特異性的RNA。在反應(yīng)體系中若加入經(jīng)標(biāo)記的NTP，則可合成RNA探針。RNA探針一般都是單鏈,它具有單鏈DNA探針的優(yōu)點,又具有許多DNA單鏈探針?biāo)鶝]有的優(yōu)點，主要是：RNA:DNA雜交體比DNA:DNA雜交體有更高的穩(wěn)定性,所以在雜交反應(yīng)中RNA探針比相同比活性的DNA探針?biāo)a(chǎn)生信號要強。RNA:RNA雜交體用RNA酶A酶切比S1酶切DNA:RNA雜交體容易控制,所以用RNA探針進(jìn)行RNA結(jié)構(gòu)分析比用DNA探針效果好。噬菌體依賴DNA的RNA聚合酶所需的rNTP濃度比Klenow片段所需的dNTP濃度低,因而能在較低濃度放射性底物的存在下,合成高比活性的全長探針。用來合成RNA的模板能轉(zhuǎn)錄許多次,所以RNA的產(chǎn)量比單鏈DNA高。并且用來合成RNA的模板能轉(zhuǎn)錄多次，可獲得比單鏈DNA更高產(chǎn)量的RNA。反應(yīng)完畢后，用無RNA酶的DNA酶Ⅰ處理,即可除去模板DNA,而單鏈DNA探針則需通過凝膠電泳純化才能與模板DNA分離。另外噬菌體依賴于DNA的RNA聚合酶不識別克隆DNA序列中的細(xì)菌、質(zhì)粒或真核生物的啟動子，對模板的要求也不高,故在異常位點起始RNA合成的比率很低。因此,當(dāng)將線性質(zhì)粒和相應(yīng)的依賴DNA的RNA聚合酶及四種rNTP一起保溫時,所有RNA的合成,都由這些噬菌體啟動子起始。常見的雜交Southern雜交Northern雜交菌落原位雜交斑點雜交常見的雜交Southern雜交Southern雜交可用來檢測經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的DNA片段中是否存在與探針同源的序列,它包括下列步驟:(1)酶切DNA,凝膠電泳分離各酶切片段,然后使DNA原位變性。(2)將DNA片段轉(zhuǎn)移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。(3)預(yù)雜交濾膜,掩蓋濾膜上非特異性位點。(4)讓探針與同源DNA片段雜交,然后漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。(5)通過顯影檢查目的DNA所在的位置。Southern雜交能否檢出雜交信號取決于很多因素,包括目的DNA在總DNA中所占的比例、探針的大小和比活性、轉(zhuǎn)移到濾膜上的DNA量以及探針與目的DNA間的配對情況等。在最佳條件下,放射自顯影曝光數(shù)天后,Southern雜交能很靈敏地檢測出低于0.1pg與32P標(biāo)記的高比活性探針的(>109cpm/μg)互補DNA。如果將10μg基因組DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上，并與長度為幾百個核苷酸的探針雜交,曝光過夜,則可檢測出哺乳動物基因組中1kb大小的單拷貝序列。將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到固體支持物上的方法主要有3種:(1)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移。本方法由Southern發(fā)明,故又稱為Southern轉(zhuǎn)移(或印跡)。毛細(xì)管轉(zhuǎn)移方法的優(yōu)點是簡單,不需要用其他儀器。缺點是轉(zhuǎn)移時間較長,轉(zhuǎn)移后雜交信號較弱。(2)電泳轉(zhuǎn)移。將DNA變性后,可電泳轉(zhuǎn)移至帶電荷的尼龍膜上。Northern雜交Northern雜交與Southern雜交很相似。主要區(qū)別是被檢測對象為RNA,其電泳在變性條件下進(jìn)行,以去除RNA中的二級結(jié)構(gòu),保證RNA完全按分子大小分離。變性電泳主要有3種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。電泳后的瓊脂糖凝膠用與Southern轉(zhuǎn)移相同的方法將RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,然后與探針雜交。1、材料：待檢測的RNA及制備好的探針。2、設(shè)備：電泳儀，電泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自顯影盒，X-光片，雜交袋，硝酸纖維素膜或尼龍膜。3、試劑：(1)20×SSPE:175.3gNaCl,88.2g檸檬酸鈉，溶于800ml水中，用10mol/LNaOH調(diào)pH至7.4，定溶到1L。(2)其他試劑：與Southern雜交試劑類似，只是所有的試劑均應(yīng)用DEPC處理。4、操作步驟：(1)RNA經(jīng)變性電泳完畢后,可立即將乙醛酰RNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上。轉(zhuǎn)移方法與轉(zhuǎn)移DNA的方法相似。(2)轉(zhuǎn)移完畢后,以6×SSC溶液于室溫浸泡此膜5分鐘,以除去瓊脂糖碎片。(3)將該雜交膜夾于兩張濾紙中間,用真空烤箱于80℃干燥0.5-2小時。菌落原位雜交對分散在若干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落（100-200）進(jìn)行克隆篩選時，可采用本方法。將這些菌落歸并到一個瓊脂主平板以及已置于第二個瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經(jīng)培養(yǎng)一段時間后，對菌落進(jìn)行原位裂解。主平板應(yīng)貯存于4℃直至得到篩選結(jié)果。1、材料：待檢測的細(xì)菌平皿，已標(biāo)記好的探針，硝酸纖維素濾膜等。2、設(shè)備：恒溫烤箱，恒溫水浴，臺式高速離心機等。3、試劑：(1)LB固體培養(yǎng)基。(2)0.5mol/LNaOH。(3)1mol/LTris·Cl。(4)1.5mol/LNaCl。(5)0.5mol/LTris·Cl。(6)預(yù)洗液：5×SSC,0.5%SDS,1mmol/LEDTA(pH8.0)。斑點雜交斑點雜交是指將DNA或RNA樣品直接點在硝酸纖維素濾膜上,然后與核酸探針分子雜交，以顯示樣品中是否存在特異的DNA或RNA。同一種樣品經(jīng)不同