探討復(fù)方丹參注射液對(duì)氧化所致?lián)p傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用

探討復(fù)方丹參注射液對(duì)氧化所致?lián)p傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用

【關(guān)鍵詞】復(fù)方丹參注射液；,,血管內(nèi)皮；,,掃描電鏡摘要：目的探討復(fù)方丹參注射液對(duì)氧化所致?lián)p傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。方法采用臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveincells)，用倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察各組內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)胞上清液中丙二醛的含量。結(jié)果掃描電鏡觀察顯示過氧化氫組EC皺縮變小，細(xì)胞表面干裂，表面微絨毛減少甚至消失，細(xì)胞間隙增寬，而經(jīng)丹參預(yù)處理過的過氧化氫組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)則明顯改善。MDA含量測(cè)定表明過氧化氫組的MDA含量明顯增高。相反，正常組和丹參組中MDA含量減少。結(jié)論復(fù)方丹參注射液通過其抗氧化作用，對(duì)氧化所引起的受損血管EC有保護(hù)作用。關(guān)鍵詞：復(fù)方丹參注射液；血管內(nèi)皮；掃描電鏡

心血管疾病是人類死亡的首要原因。在各種心腦血管疾病中，很多都是由動(dòng)脈粥樣硬化而引起。而許多研究表明血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是AS發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)［1］。因此保護(hù)血管內(nèi)皮對(duì)防治AS具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)通過掃描電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，用分光光度法檢測(cè)MDA含量,以探討丹參對(duì)受損傷的血管EC的保護(hù)作用，以及其抗AS的作用機(jī)理。1材料與方法藥物與試劑復(fù)方丹參注射液為上海中西藥液股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)021001；M199培養(yǎng)基為美國GIBCO公司產(chǎn)品；胎牛血清為美國HYCOLONE公司產(chǎn)品；MDA試劑盒為北京邦定公司提供；掃描電鏡為日本產(chǎn)品。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)按Jaffe等［2,3］人的方法略加修改進(jìn)行。在無菌條件下，取健康產(chǎn)婦的臍帶，灌注%Ⅰ型膠原酶10～15ml，置37℃水浴中孵育15～20min。1000r/min離心10min，沉淀中加入含有20％FBS的完全M199培養(yǎng)液5ml，充分混合制成細(xì)胞懸液，以×104/cm2密度植入培養(yǎng)瓶中，置37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液，待細(xì)胞長成融合狀態(tài)后進(jìn)行鑒定及進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)組：①正常組：加入含20％FBS的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)；②H2O2組：首先加入含20％FBS的完全培養(yǎng)液，待細(xì)胞基本融合時(shí)再加入終濃度為75μmol/L的H2O2刺激4h；③丹參組：加入含20％FBS的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后，再加入終濃度分別為，，，mg/ml和mg/ml的復(fù)方丹參注射液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后再加入終濃度為75μmol/L的H2O2刺激4h。用倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞生長情況選用生長良好的HUVEC，制成細(xì)胞懸液接種于預(yù)置蓋玻片的24孔板中，每孔加入×105個(gè)HUVEC，放置于37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，含20％FBS的M199培養(yǎng)液中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長呈亞融合狀態(tài)后各組按上述方法處理。取出玻片，放入3％戊二醛固定1h，PBS洗3次，1％鋨酸固定，PBS洗3次，梯度酒精脫水，用CO2臨界點(diǎn)儀進(jìn)行干燥，用離子濺射儀噴金，日立S3500N掃描電鏡觀察。丙二醛含量測(cè)定選用生長良好的HUVEC，制成細(xì)胞懸液，以濃度×105/ml接種于24孔培養(yǎng)板。每組8個(gè)孔，設(shè)置7個(gè)組。細(xì)胞處理同上，終止培養(yǎng)并分別收集所有孔的上清液1ml，置于20℃冰箱待測(cè)，然后按照北京邦定生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒說明，用分光光度計(jì)檢測(cè)MDA含量。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)值均以±s表示,組間比較用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2結(jié)果內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察在倒置相差顯微鏡下觀察，正常組EC生長旺盛，呈上皮樣貼壁生長，細(xì)胞呈多角形或長梭形，呈鵝卵石樣鋪滿底層。在75μmol/L的H2O2作用4h后，細(xì)胞間隙增大，胞體變小，細(xì)胞收縮變圓，失去細(xì)胞間連接，胞漿透明，少數(shù)細(xì)胞懸浮脫落；隨著作用時(shí)間進(jìn)一步延長，胞膜邊緣不清楚，部分胞膜不完整，細(xì)胞出現(xiàn)空泡和顆粒變性，細(xì)胞脫落增多，到將近4h的時(shí)候出現(xiàn)拉網(wǎng)現(xiàn)象。而經(jīng)丹參預(yù)處理過的H2O2組EC形態(tài)與正常組相似，并且濃度越高越接近正常細(xì)胞組。掃描電鏡可以觀察到正常組(圖1)EC呈圓形或梭形、多角形，表面微絨毛豐富，排列規(guī)則，有光澤，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞間隙較小，細(xì)胞連接可見。H2O2組(圖2)的EC皺縮變小，細(xì)胞表面干裂，胞膜表面有孔隙，有的呈現(xiàn)不規(guī)則鋸齒狀，表面微絨毛減少甚至消失，細(xì)胞間隙增大，微絨毛僵直斷裂，分布不規(guī)則，減少甚至消失，可見微絨毛水腫。而丹參組(圖3)的EC形態(tài)結(jié)構(gòu)則明顯改善，其形態(tài)、大小及微絨毛數(shù)量、分布與正常組相似。

圖1正常組EC(略)圖2H2O2組EC(略)圖3丹參組EC(Bar=30μm)(略)各組細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA的檢測(cè)結(jié)果用H2O2刺激細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)液中的MDA含量明顯升高，而用復(fù)方丹參預(yù)處理的細(xì)胞培養(yǎng)液中的MDA含量與正常組相似。H2O2組與正常組和丹參組比較具有顯著性差異。結(jié)果見表1。表1各組內(nèi)皮細(xì)胞中丙二醛含量的比較(略)與H2O2組作比較，*P，n=83討論動(dòng)脈粥樣硬化是引起各種心血管疾病的主要原因。引起動(dòng)脈粥樣硬化的因素很多，其中“炎癥-反應(yīng)”學(xué)說［4］是最受人們關(guān)注的。研究表明［5］體內(nèi)許多因素可損傷VEC，以活性氧最重要?；钚匝醭苁筕EC膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等氧化破壞外，并可氧化修飾低密度脂蛋白，進(jìn)而更加促進(jìn)AS的發(fā)展。文獻(xiàn)中提出［6］H2O2是活性氧，可促進(jìn)自由基生成。生物體內(nèi)過氧化氫如不及時(shí)被過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶消除，它可通過細(xì)胞膜，在膜外與Fe2＋或Cu2＋生成羥自由基OHo，從而引發(fā)脂類過氧化而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)的掃描電鏡觀察結(jié)果顯示H2O2組內(nèi)皮細(xì)胞明顯受損，細(xì)胞明顯腫脹及微絨毛消失等超微結(jié)構(gòu)上的變化。而丹參組的內(nèi)皮細(xì)胞在超微結(jié)構(gòu)上無明顯變化，與正常組相似。表明丹參對(duì)受損傷VEC具有保護(hù)作用。生化學(xué)檢測(cè)MDA含量常常反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞損傷的程度。脂質(zhì)過氧化作用不僅把活性氧轉(zhuǎn)化成活性化學(xué)劑，而通過鏈?zhǔn)交蜴準(zhǔn)街ф湻磻?yīng)，放大活性氧的作用。因此初始的一個(gè)活性氧能導(dǎo)致很多脂類分解產(chǎn)物的形成，這些分解產(chǎn)物中的一些能引起細(xì)胞代謝及功能障礙，甚至死亡。中醫(yī)理論認(rèn)為，丹參具有活血化淤、調(diào)經(jīng)止痛、養(yǎng)血安神、涼血消腫等功能，而且有關(guān)丹參的抗氧化作用已經(jīng)得到人們的重視。徐東坡等［7］人研究結(jié)果表明，丹參對(duì)氧自由基清除酶SOD的保護(hù)作用優(yōu)于亞硝酸鈉。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與許晶蘭等［8］人做的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相符。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H2O2使VECs的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增加，而預(yù)先加入丹參可減輕VECs的氧化損傷,細(xì)胞損傷不明顯。丹參可能通過清除氧自由基的作用穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而減輕H2O2的氧化損傷作用?？傊?，本研究結(jié)果表明復(fù)方丹參注射液具有保護(hù)由過氧化氫所致?lián)p傷的血管EC的作用，從而起到抗AS的目的，其機(jī)理可能與丹參抗脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)。參考文獻(xiàn)：［1］pathogenesisofatherosclerosis-anupclate［J］.NEngJMed,Feb201986,314:488.［2］BasavarajuSR,Jonesrisksfromchemicals:partobservationsandmechanismsofatherosclerosis［J］.ArchEnvironContamToxicol,1998,35：152.［3］何作云.提高冠心病的防治水平，重視血管內(nèi)皮功能損傷的研究［J］.中國血液流變學(xué)雜志，2002，12：161.［4］RossR,Atherosclerosis-aninflammatorydisease［J］.NEnglJmed.1999,340(2):115.［5］任德成.綜述血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化性損傷機(jī)理［J］.心血管病學(xué)進(jìn)展，2002，23：235.［6］林蓉，劉俊田，李旭，等.槲皮素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞