免疫組織化學(xué)

IIFIHCICC

免疫組織化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化第一部分基本知識(shí)免疫組織化學(xué)的歷史、現(xiàn)狀和發(fā)展

疾病的診斷手段準(zhǔn)確性，首推病理診斷準(zhǔn)確性高，即病理組織學(xué)診斷。更準(zhǔn)確、更可信、更有權(quán)威性。1974年免疫組化用于病理診斷免疫組織化學(xué)已成為病理診斷中的一種常用手段隨著免疫學(xué)和單抗技術(shù)的發(fā)展，免疫組化技術(shù)興起診斷免疫組化開始于70年代，發(fā)展高峰在80年代，90年代已在國(guó)外病理科列入病理技術(shù)室的常規(guī)工作。國(guó)內(nèi)病理科約晚10年的進(jìn)程，90年代開始在診斷病理工作中普及免疫組織化學(xué)在臨床上的應(yīng)用(1)提高病理診斷準(zhǔn)確性(2)對(duì)疾病的預(yù)后和治療的意義激素(3)癌基因蛋白的應(yīng)用(4)對(duì)腫瘤增生程度的評(píng)價(jià)(5)微小病灶的發(fā)現(xiàn)微小癌，微小病灶（如羊水栓塞）(6)在腫瘤分期上的意義(7)指導(dǎo)腫瘤的治療(8)免疫性疾病的輔助診斷(9)病原微生物的檢測(cè)免疫組化與抗體鑒定抗體上游鑒定方法:存在否?量多少?免疫印跡、免疫沉淀、免疫電泳、免疫酶連抗體下游鑒定方法:價(jià)值體現(xiàn)IIF:間接免疫熒光技術(shù),系IF的一種,步驟很簡(jiǎn)單,特點(diǎn)為敏感性好,對(duì)于低濃度抗體檢出率高于以下兩種方法.IHC:免疫組織化學(xué)技術(shù),方法不少,但具體操作基本相同,掌握一種就夠用了。ICC:免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù),同上，組織換成細(xì)胞，但是處理方法不一樣了。下頁(yè)圖示免疫組化的各種方法IHC技術(shù)是目前常規(guī)病理診斷和臨床治療中必不可少的手段，按照美國(guó)FDA標(biāo)準(zhǔn)，IHC抗體試劑系統(tǒng)分三類：A類抗體進(jìn)行病理鑒別診斷，B類抗體指導(dǎo)臨床治療，如ER/PR和AR，C類抗體顯示臨床用藥的靶細(xì)胞，要求試劑的安全性和穩(wěn)定性很高，此類抗體篩選要求有嚴(yán)格的內(nèi)部和外部對(duì)照。免疫組化實(shí)驗(yàn)涉及的幾個(gè)方面

1病理醫(yī)師：把握和選擇，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定，2實(shí)驗(yàn)員：準(zhǔn)備片子和試劑，了解基本原理也很重要，會(huì)做也要會(huì)分析3組織處理4試劑是否可靠，實(shí)驗(yàn)方法是否正確5實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)立：許多實(shí)驗(yàn)室忽略了這個(gè)要素。第二部分實(shí)驗(yàn)技術(shù)免疫威組化革染色油基本拼技術(shù)正式天實(shí)驗(yàn)苗前做HE染色茅確認(rèn)芒片子芹質(zhì)量足，厚蹤蝶度3-何4u輛m，目舌的細(xì)全胞形癥態(tài)完跌好，隙沒(méi)有鞏過(guò)多劫的壞療死、役出血詢、變?cè)L性組睡織等她，以聲免實(shí)筋驗(yàn)完拉畢后系發(fā)現(xiàn)盼片子惕質(zhì)量賊不好韻，浪鴨費(fèi)試成劑和莫物力1常規(guī)戲處理注：烤錫片，丈脫蠟鑒，入鄉(xiāng)豐水2抗原比修復(fù)恨：3封閉告處理包：封扎閉組?？梼?nèi)府源性俯酶，趴封閉珍組織德非特土異性炊抗原稱結(jié)合初位點(diǎn)刮，其撫他封兔閉4抗體望反應(yīng)蝦：一椅抗而，二丹抗，謎三抗5顯色甚反應(yīng)扛：DA生B，AE睡C，BC戶IP純/N鹿BT6后續(xù)刮處理敘：復(fù)換染/分化/返蘭匹，脫待水，良透明糕，封族片相關(guān)亂知識(shí)襖：HE染色相關(guān)初知識(shí)袋：HE染色蘇木吐素—伊紅床染色鴿是形旱態(tài)學(xué)杰常用齡的染逐色方末法憶，取品自He矩ma送to津xy補(bǔ)ln和Eo鋼si探n單詞劫，簡(jiǎn)舌稱HE染色且，蘇都木素女將細(xì)囑胞核日染成口藍(lán)色毀，伊慘紅將久細(xì)胞惡漿染怪成紅腸色，捕顯示咸組織乖和細(xì)休胞形蹄態(tài)結(jié)獎(jiǎng)構(gòu)，給同時(shí)潑將各功種組業(yè)織細(xì)嘴胞成星分與溉病變沖區(qū)分肯開來(lái)箱。HE染色黑是臨供床病博理診疤斷的階方法殊。HE與IH途C配合悶可以嗓確診節(jié)疾病相關(guān)計(jì)知識(shí)輸：HE示意佳圖相關(guān)件知識(shí)培：HE與IH膽C染色（一薦）逼良好怖的標(biāo)震本制倉(cāng)備，駛免疫毯組化倦成功清的首塌要條戒件免疫逢組化啦對(duì)組膽織和棵細(xì)胞索標(biāo)本紙的要缸求-保持校所檢躁標(biāo)本撿原有尋的結(jié)幸構(gòu)、億形態(tài)睛；-在原城位最蔽大程說(shuō)度地趟保持存待測(cè)遮抗原(或抗餓體)的免緞疫活性性，既不詠淬滅亂、流湯失或午彌散含，也京不被堆隱蔽轎。免疫嘗組化買中常腸用的罪組織窄和細(xì)菜胞標(biāo)維本病*組攀織標(biāo)熊本*細(xì)傳胞標(biāo)掩本紀(jì)石昂蠟切爸片晶組織論印片冰凍酷切片細(xì)胞惰涂片身細(xì)胞則爬片*石屈蠟切鄉(xiāng)豐片是戶制作頓組織奮標(biāo)本翠最常觀用、候最基屋本的爬方法-最大葵優(yōu)點(diǎn)碗是組毫織形淚態(tài)保強(qiáng)存好脊，且雅能作洲連續(xù)級(jí)切片統(tǒng)，有客利于秒各種芹染色殿對(duì)照張觀察命；這圓點(diǎn)對(duì)毅于我燈們來(lái)呈說(shuō)非或常重界要！-石蠟麥塊還妨能長(zhǎng)蹈期存撫檔，偽供回墻顧研哪究。燦*開石蠟拔切片奴制作抽過(guò)程時(shí)對(duì)組護(hù)織內(nèi)紛抗原襲顯現(xiàn)吳有一穴定的滋影響內(nèi)，但抗可通單過(guò)某凈些措卡施予扔以改個(gè)善，陷因而陣它是你大多答數(shù)免水疫組舞化中駛首選圾的組景織標(biāo)窮本制稱作方貌法。切片沈的準(zhǔn)來(lái)備：AP燃ES，多盟聚賴倚胺酸剛切邁的石喚蠟片粘至少紗在58惡-6脊0臂℃考2h以上分（防爬止脫癥片）淚，可槐以放鉤置一絡(luò)段時(shí)見(jiàn)間，潮實(shí)驗(yàn)字前再壤烤30惹mi疑n即可具。不岸可高碧溫烤袖片（80稠℃），雅會(huì)導(dǎo)等致組具織抗蘆原氧蛙化而椅難以寧檢測(cè)登。切片棒保存仆：不乏可長(zhǎng)警時(shí)間艦室溫總或冰常箱里截保存鉤切片背，抗舉原會(huì)乞丟失捷，原酬則上逆切片恰最多擁可放3個(gè)月劍。背景剪：胃有些麥研究會(huì)人員西或技霜術(shù)員恨喜歡趁一次含性連幫續(xù)切脂上大首量片俘子，疏然后椅放置嘩保存殃，留檔做實(shí)俘驗(yàn)常規(guī)姨的石超蠟切冰片標(biāo)眠本均挺用甲捎醛（亭福爾脂馬林欺）固滾定，惱結(jié)果神使得旨：-抗原盛性物后質(zhì)形么成醛兆鍵、姿羧甲圍鍵而徹被封罪閉了詢部分?？乖蹧Q定煉簇；-蛋白蛋之間鉗發(fā)生帥交聯(lián)丹而使逼抗原屑決定瀉簇隱寸蔽。*要海求：致在染說(shuō)色時(shí)可，需剩要先偷進(jìn)行腦抗原測(cè)修復(fù)騾或暴海露，別即將弦固定綿時(shí)分市子之周間所眨形成錘的交恩聯(lián)破釣壞，父而恢啄復(fù)抗郵原的申原有哀空間投形態(tài)矩。因?yàn)槌惺灣镀M虹織含暮有石梁蠟，及并且逃組織熟處于玩脫水犧的狀鞋態(tài)，構(gòu)所以兔在實(shí)例驗(yàn)前捆期要鹽進(jìn)行后相應(yīng)蠶處理烏，即奪二甲偉苯脫畜蠟和母梯度麻酒精拖水化綢（從輝無(wú)水負(fù)乙醇彩逐漸驕下行普到75神%酒精汽的過(guò)探程，京入差水）下一藥步：炒抗搶原修寨復(fù)（二濫）懷恰當(dāng)腫的抗捉原修晴復(fù)，咐會(huì)很起大程劇度上陵改變虎最終語(yǔ)的實(shí)怪驗(yàn)結(jié)哥果抗原莫修復(fù)叼方法利化悅學(xué)方爪法：料胃蛋腸白酶窗，胰照蛋白霉酶鬧加熱苦方法-水浴處加熱趕法-微波聰照射蛋法-高壓毅加熱鞋法貫酸水崗解法以抗辦原修攏復(fù)效畏果而張言，母高壓月法﹥微波折法﹥化學(xué)溉方法﹥酸水初解法﹥水煮針?lè)?xì)胞埋片和晌冰凍縮慧切片記不需餡要抗臂原修部復(fù)，庫(kù)但需贏要封援閉步場(chǎng)驟微波贏法踏*將卷玻片效放入氣裝有冤抗原死修復(fù)蛾液的火容器魂中，農(nóng)置微奶波爐男加熱權(quán)至95膜℃以上師，持女續(xù)l0～15分鐘煩，冷繪卻后傍，按拔免疫鐮組化喝染色養(yǎng)步驟免進(jìn)行起。高壓王法爺*將姻玻片諸浸入他抗原屈修復(fù)乳液內(nèi)裕，置借高壓稠鍋中胸高壓1～2m般in，可道取得蜓極好疤的效科果。爐*炊由于誓高壓將下受丑熱均叉勻，氧特別寇使用杰于大朋批量倍標(biāo)本熊的染棟色。注意騰事項(xiàng)托加惕熱后斑必須脂經(jīng)過(guò)萬(wàn)室溫業(yè)自然氏冷卻20～30分鐘蛾，使仇未折是疊的橋蛋白醫(yī)分子隸鏈恢辨復(fù)天藍(lán)然構(gòu)脫型；怕*強(qiáng)修復(fù)鄙液最頸常用犧的是pH析6.擦0的0.版01少mo壘l/臨L的枸暢櫞酸惠鹽緩煤沖液壩；倒下眨一步從；降封閉航處理（三熔）植封閉選處理稍，降噴低非倉(cāng)特異慎性染離色的湊必要咸程序這個(gè)鹽步驟妹在抗雞原修笑復(fù)之叫后，浸主要展有三晴個(gè)封賓閉如果趟最后均的顯歲色系肌統(tǒng)采孩用HR或P（辣媽根過(guò)籠氧化鑄物酶尺），成則需典要以0.吊3-桐3%的H2蓮O2封閉眠內(nèi)源亂性過(guò)適氧化綿物酶雁，否枕則組被織中本血液倒系統(tǒng)誘的細(xì)猾胞會(huì)毫干擾宿實(shí)驗(yàn)價(jià)結(jié)果如果樓檢測(cè)樹系統(tǒng)蟻（二滿抗或未者三左抗）干以生庸物素疊作為警標(biāo)記暢，則足需要光封閉蒼內(nèi)源撲性生洞物素亞（有鹽專門網(wǎng)試劑指），受否則夸肝、追腎、雙甲狀悄腺等侄組織祥容易螺出現(xiàn)混假陽(yáng)坦性。常規(guī)捆的非尼免疫棕血清患（正握常血戀清）個(gè)封閉怪。下一醒步：遇抗體乳反應(yīng)（四慮）攏抗體滲反應(yīng)畝，關(guān)歐鍵在睬于設(shè)威置適疫當(dāng)?shù)妮x對(duì)照1陰性桌對(duì)照碌：抗遠(yuǎn)體稀漿釋液2陽(yáng)性宗對(duì)照薯：兩止個(gè)方揀面（現(xiàn)陽(yáng)性薪組織跟細(xì)胞檢、陽(yáng)趣性抗貝體）3抑制南對(duì)照4吸收槳對(duì)照5自身拳對(duì)照則（內(nèi)喊對(duì)照咳）6同型串對(duì)照桌；同忌種屬溝來(lái)源眉的純Ig萍G或其貍亞型7無(wú)關(guān)克對(duì)照除；其刮他抗池體在病安理科艘的日疏常診優(yōu)斷工艘作中螺，只唉要有椅陰性畫對(duì)照霧和陽(yáng)遺性對(duì)戚照即稠可。除一辰抗以杯外，嘉配套佛的抗艷體檢綠測(cè)試炒劑盒道種類間很多康，這汽些試友劑盒畫本身拖附帶做有詳嘆細(xì)的哲操作叉說(shuō)明脖，如迷二步際法、鈔三步鼻法等門，同良時(shí)會(huì)熱建議新如何優(yōu)選擇窄配套酬的顯老色系沈統(tǒng)。特殊芝類型夠的一男抗，完例如混嵌合舌抗體烘，則敘選擇食特殊嗚的配左套試玻劑盒威或二唉抗。即用威型與寬濃縮漁型抗抱體關(guān)于呈一抗夜的孵莊育時(shí)呢間：37怖℃季1柔h4征℃過(guò)夜可以潤(rùn)根據(jù)越實(shí)際寄需要就安排下一炸步；墊顯色膛反應(yīng)（五杏）堅(jiān)顯色斜系統(tǒng)臟與顯嫩色控晚制，幻玉決定尊實(shí)驗(yàn)穩(wěn)效果目前捉最常述用的療顯示劉劑顯色貍試劑宵顏姻色DA煩B棕黃揚(yáng)色AE根C磚紅胸色AP抱-R乘ed鮮紅事色Fa齊st告-B剝lu甩e亮綠案色BC沸IP徒/N爹BT蘭色前兩些種用鑒于辣燭根過(guò)歌氧化易物酶宜（HR茄P）系活統(tǒng)后三恰種用蹄于堿躍性磷程酸酶劣（AP）系出統(tǒng)評(píng)價(jià)飲：AE量C顯色窄物溶加于酒偵精和志二甲升苯，醋所以隊(duì)封片迅時(shí)不貍能用侄中性借樹膠迎，以抱免褪克色，馬而只朋能用宏甘油惑明膠武或市跡售的AE果C封片少劑，狗采用圖該種歪試劑乘顯色腔的片龜子不趁能長(zhǎng)隱期保排存，煎不利凱于回跨顧性幣研究哈。DA辜B顯色避較快超，鏡采下控菜制比寒較容心易，述保存魔方便惱，實(shí)襯驗(yàn)結(jié)事果比AE刪C顯色酷者清善晰，起為IH蘇C首選閥顯色雄試劑棗。BC塵IP所/N門BT顯色哲系統(tǒng)凳主要耀用于宣原位慢分子端雜交宜實(shí)驗(yàn)植，免誼疫組眉化可窮以選演用。童其缺嚷點(diǎn)是店不能魚用蘇茂木素乳復(fù)染燦（不澆能染森核）指，但楚是可碌以用褲其他獅染料援代替久，比擾如核派快紅聚等。三種扮顯色某系統(tǒng)系效果逝圖左上AE岸C左下BC茅IP餃/N學(xué)BT右DA塑B（六艱）五顯色公后處怕理步編驟，邀關(guān)系扔片子翻的外連觀和悄內(nèi)觀復(fù)染刮，分域化，殲返蘭前面福已經(jīng)粒強(qiáng)調(diào)帝過(guò)，域石蠟法片子聰在實(shí)戶驗(yàn)前藏經(jīng)過(guò)曲了脫絹蠟和祖水化警處理鋤，即羅二甲概苯先它脫蠟艘，然狡后沿姓無(wú)水輸乙醇邀逐漸宿到75禾%酒精禁。實(shí)驗(yàn)余完畢檔后，隊(duì)則必嗓須沿戀著上呼面順稍序反壘向走閑一遍家，目床的是鋤脫水畫和透頃明，粗使得吳組織點(diǎn)細(xì)胞下清晰闖和易暈于保箱存，謝同時(shí)拿也去翠掉一識(shí)些附躁著于紀(jì)片子役上的選雜質(zhì)注意書：適泉用于DA艱B和BC狹IP陜/N坦BT顯色過(guò)系統(tǒng)慨，AE膜C不可眉（？騰）。強(qiáng)調(diào)艦：整卷個(gè)實(shí)竊驗(yàn)過(guò)巨程不池能干杜片（七）痰結(jié)陜果判爸?jǐn)啵鷮?shí)驗(yàn)顫是否棋成功末的要蜘素在對(duì)涉照實(shí)限驗(yàn)的妹基礎(chǔ)擔(dān)上進(jìn)蹄行判顏斷結(jié)合蓬抗體恰和患匠者的蘿資料熟悉名病理駱基本繳知識(shí)倒和病干變特安點(diǎn)真陽(yáng)侍性與摔假陽(yáng)飛性真陰薯性與肆假陰幕性判斷費(fèi)結(jié)果豎的基歐本原糖則陽(yáng)性果細(xì)胞抖定位讀是否拍明確饅，是恰胞膜其、胞牌