抗菌藥物敏感試驗

關(guān)于抗菌藥物敏感試驗第1頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三2敏感和耐藥的概念

從本質(zhì)上講：細菌對某種抗菌藥物是敏感還是耐藥，常以該抗菌藥物的治療濃度與MIC的關(guān)系而定。常用劑量的抗菌藥物通過常用途徑所能達到的血藥濃度第2頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三3

血藥濃度與MIC之間的關(guān)系

敏感中介耐藥耐藥上限下限第3頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三4

抗菌藥物的治療濃度與MIC的關(guān)系：若MIC小于治療濃度，則為“敏感”（Sensitive,S），推薦使用。若MIC大于治療濃度，則為“耐藥”（Resistant,R）；若MIC介于治療濃度的上下限之間，則為“中度耐藥”（Intermediate,I）或中度敏感敏感和耐藥的概念

第4頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三5第5頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三6敏感治療濃度的上限

即表中的

R治療濃度的下限

即表中的S耐藥中介耐藥治療濃度CLSI標準MIC第6頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三7

第一節(jié)、抗菌藥物敏感性試驗方法需氧和兼性厭氧菌第7頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三8稀釋法

?肉湯稀釋法（試管稀釋法）

?瓊脂稀釋法（平板稀釋法）紙片擴散法（紙片法）E-試驗聯(lián)合藥物敏感試驗需氧和兼性厭氧菌藥敏試驗的方法

第8頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三9稀釋法的特點定量的藥敏試驗，測定MIC、MBC。方法比較繁瑣，手工操作一般不作為常規(guī)試驗，常用于調(diào)查罕見耐藥。自動微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)采用微量稀釋法檢測MIC。第9頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三10二、紙片擴散法（discdiffusiontest)

（Kirby-Bauer法）

原理：將浸有抗菌藥物的紙片貼在涂有測試菌的瓊脂平板上?？咕幬锵颦傊闹軘U散形成遞減的梯度濃度。藥物敏感細菌在紙片周圍一定距離內(nèi)的生長受到抑制，形成抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對藥物的敏感程度。二者呈正相關(guān)。第10頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三11抑菌圈邊緣的藥物濃度與MIC第11頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三12

抑菌圈的大小與MIC：二者呈負相關(guān)，即抑菌圈愈大，MIC愈小。第12頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三13紙片法藥敏試驗抑菌圈直徑與結(jié)果解釋的標準抗菌藥物與細菌

紙片含量

抑菌圈直徑：mm相應MICμg/ml

耐藥中介度敏感耐藥敏感丁胺卡那霉素30μg≤1415-16≥17≥32≤16氨芐青霉素

測腸桿菌

10μg≤1112-13≥14≥32≤8

測葡萄球菌

10μg≤28—≥29

測嗜血桿菌

10μg≤19—≥20≥4≤0.25

測腸球菌

10μg≤16—≥16≤2第13頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三14

操作方法：1.制備M-H瓊脂平板，厚度4mm。2.制備0.5麥氏比濁管濁度的菌液（培養(yǎng)16～24h，4~5個菌落）。3.菌液均勻涂布于平板。（15分鐘接種完畢）4.無菌貼標準抗生素紙片于M-H瓊脂表面，5.經(jīng)過35℃16～24h孵育。6.量取抑菌環(huán)直徑，根據(jù)CLSI標準，報告細菌對該抗生素敏感、耐藥、中介。第14頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三15操作方法：1.將在約56℃恒溫的無菌M-H瓊脂傾注直徑為90mm

的平板，其厚度

4mm。第15頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三162.無菌挑取孵育16～24h的血平板上4~5個菌落。第16頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三173.將菌置于無菌生理鹽水中，校正其濁度于0.5麥氏比濁管濁度的菌液。1.5×108CFU/ml第17頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三184.用無菌棉簽浸入細菌懸液中，將拭子在試管上壁輕輕擠壓以擠去過多的菌液。棉簽在三個方向均勻抹瓊脂表面（每次轉(zhuǎn)60℃）使菌液均勻分布，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。第18頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三195.蓋上平板的蓋子，放置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，放置3~10分鐘后貼上標準抗生素紙片。第19頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三206.用無菌鑷子或紙片分配器將抗菌紙片粘貼于M-H瓊脂的表面，一旦紙片貼上，不能移動；各抗菌紙片中心距離應大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應大于15mm。第20頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三217.經(jīng)過35℃16～24h孵育。8.取抑菌環(huán)直徑，根據(jù)CLSI標準，報告細菌對該抗生素敏感、耐藥、中介。第21頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三22紙片擴散法質(zhì)量控制

培養(yǎng)基：M-H平板厚度，4mm細菌懸液：0.5麥氏標準的細菌濃度藥敏紙片的質(zhì)量各抗菌紙片中心距離應大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應大于15mm。

9cm的平板貼6個培養(yǎng)時間質(zhì)控菌株↗↗↘↗抑菌圈直徑？↘↘↗第22頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三23第23頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三24根據(jù)抑菌圈的直徑，依照CLSI標準，作出敏感、耐藥、和中介的判斷。為‘‘定性”結(jié)果。CLSI推薦的最簡單的藥敏試驗。紙片擴散法的特點第24頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三25三、E試驗法（濃度梯度法）

原理：E試條是一條5mm×50mm無孔試劑載體，一面固定有一系列預先制備的濃度呈連續(xù)指數(shù)增長的抗菌藥物，另一面有判別的刻度?？咕幬锏奶荻瓤筛采w有15--20個對倍稀釋濃度的寬度范圍。將E試條放在細菌接種過的瓊脂平板上，經(jīng)孵育，圍繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點的刻度濃度即為抗菌藥物抑制細菌的MIC。依照CLSI標準判斷其敏感、耐藥、中介。

2561288016第25頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三26無菌生長區(qū)有菌生長區(qū)第26頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三27

橢圓形細菌生長抑制區(qū)2561288016判讀抑菌濃度（MICug/ml)第27頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三28第28頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三29第29頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三30Etest法特點優(yōu)點連續(xù)濃度梯度，與瓊脂稀釋法相關(guān)性好（相關(guān)系數(shù)為0.9）.可測MIC。操作簡單，影響因素少，穩(wěn)定性高。缺點：E試條較昂貴;

不適用于生長緩慢的苛養(yǎng)菌。第30頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三31用于病原菌尚未確定的急、重癥感染的經(jīng)驗治療,以擴大病原治療的覆蓋面治療多種細菌所引起的混合感染對于某些耐藥菌可取得協(xié)同抗菌作用減少或推遲治療過程中細菌耐藥性的產(chǎn)生避免藥物達到毒性劑量。四、聯(lián)合藥物敏感試驗聯(lián)合藥物意義第31頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三32增強作用：兩種抗生素聯(lián)用的效果大于它們單獨使用時的效果之和；20％～25％相加作用：它們聯(lián)用時的效果等于單用兩種抗生素效果之和；60％～70％無關(guān)作用：兩種抗生素聯(lián)用的效果，僅相當于其中一種具有較強作用的抗生素的效果；拮抗作用：兩種抗生素聯(lián)用時的效果反而小于它們分別使用時的效果之和。

10％～15％兩種藥物的聯(lián)合使用的效果第32頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三33

兩種抗菌藥物作用部位不同：β－內(nèi)酰胺類抗生素（抑制細菌細胞壁合成）與氨基糖苷類抗生素（干擾細菌的代謝）。增強作用：增加了藥物進入細菌細胞桿菌肽（降低細胞通透性）與氨基糖苷類藥物（干擾細菌的代謝）。拮抗作用：降低了藥物進入細菌細胞抗菌藥物協(xié)同作用發(fā)生原理第33頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三34棋盤稀釋法

利用肉湯稀釋法原理，依據(jù)兩種藥物的MIC，以棋盤設(shè)計兩種藥物不同濃度的組合。計算抑菌濃度指數(shù)（fractioninhaibitoryconcentration,FIC)聯(lián)合藥物敏感試驗方法第34頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三35棋盤稀釋法首先分別測定擬聯(lián)合的抗菌藥物對檢測菌的MIC。藥物最高濃度為MIC的2倍，對倍稀釋。兩種藥物的稀釋分別在方陣的縱列和橫列進行，這樣在每管（孔）中可得到不同濃度組合的兩種藥物混合液。接種菌量為5×105CUF／ml，35℃孵育18h后觀察結(jié)果。計算部分抑菌濃度（FIC）指數(shù)。第35頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三36抑菌濃度指數(shù)（FIC）FIC＝A藥聯(lián)合時的MICA藥單測的MICB藥聯(lián)合時的MICB藥單測的MIC＋FIC﹤0.5為協(xié)同作用；0.5～1為相加作用；

1～2為無關(guān)作用；﹥2為拮抗作用第36頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三37A藥：321684B藥:16

8

42生長生長生長生長生長生長生長生長生長生長

生長第37頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三38藥敏試驗方法的比較K-B法：

WTO推薦使用的最簡單的定性藥敏試驗。稀釋法：準確測定MIC、MBC，比較繁瑣，試管法一般不作為常規(guī)試驗。

微生物自動分析系統(tǒng)采用微量稀釋法原理。E試驗：可測定MIC。第38頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三39第二節(jié)結(jié)核分枝桿菌的藥敏試驗

（了解）首次分離的分枝桿菌需做藥敏試驗，有助于合理用藥和監(jiān)測藥物敏感性。另外經(jīng)過三個月正規(guī)治療，標本分離培養(yǎng)仍為陽性患者，或感染的嚴重疾患（如播散性結(jié)核病和結(jié)核性腦膜炎）。以及來自高耐藥流行區(qū)的患者，均須做體外藥敏試驗。第39頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三40四種方法比例法放射同位素法絕對濃度法耐藥率法直接法：直接采用圖片陽性的體液標本。（須經(jīng)充分消化五雜菌）間接法：經(jīng)分離純培養(yǎng)后的次代培養(yǎng)菌。第40頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三41無藥藥2藥3藥1Middlebrook7H10瓊脂培養(yǎng)3周間接比例法（WHO推薦）敏感：含藥格無結(jié)核桿菌生長，或菌落數(shù)﹤1%對照格耐藥：含藥格菌落數(shù)≧1%對照格。不含藥的對照格菌落數(shù)應為50~1504格平板第41頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三42分枝桿菌微量直視快速藥敏試驗法4000倍第42頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三43培養(yǎng)72h觀察結(jié)果INH敏感RFP耐藥陽性對照陰性對照第43頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三44第三節(jié)厭氧菌體外藥敏試驗

（了解）厭氧菌感染多為內(nèi)源性感染，厭氧菌藥物敏感性穩(wěn)定，一般不做體外藥敏試驗。下述情況應考慮藥敏試驗：明確厭氧菌引起的嚴重感染；已確證的厭氧菌感染，經(jīng)驗性選藥治療未能奏效；需長期用藥的厭氧菌感染。第44頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三45基本原理和方法與需氧菌相同，只是在培養(yǎng)基、操作環(huán)境和培養(yǎng)條件等應根據(jù)厭氧菌的特定需要變動。培養(yǎng)基為布氏血瓊脂再加人補充劑5μg/ml氯化血紅素，5％脫纖維羊,1μg/mlVitK。厭氧孵育條件質(zhì)控菌株為脆弱類桿菌ATCC25285。厭氧菌體外藥敏試驗第45頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三46藥敏試驗結(jié)果的臨床價值

影響抗菌藥物臨床療效的因素很多，據(jù)報道藥敏試驗結(jié)果與臨床療效的符合率約為70%

，因此細菌培養(yǎng)及藥敏試驗報告只能作為臨床用藥的參考，應根據(jù)患者用藥后的治療反應和臨床病情及時調(diào)整用藥。醫(yī)學檢驗的靈魂是與臨床溝通。第46頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三47新的藥敏試驗方法探索流式細胞術(shù)檢測抗生素最低抑菌濃度分枝桿菌藥物最低抑菌濃度的快速測定方法研究第47頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三48細菌耐藥性的發(fā)生過程：細菌獲得與耐藥相關(guān)的基因編碼與耐藥有關(guān)的蛋白表現(xiàn)出對某種抗生素的耐藥基因：537表型：書533頁敏感性第48頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三49第35章第三節(jié)

細菌耐藥性檢測第49頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三50生物化學技術(shù)檢測酶的等電點(等電聚焦電泳)頭孢哨噻吩濾紙片法碘淀粉測定法分析酶的底物譜及抑制物譜紙片法和稀釋法1、β-內(nèi)酰胺酶檢測臨床意義：產(chǎn)ESBL克雷伯菌和大腸埃希菌對青霉素、頭孢菌素和氨曲南治療無效。一、耐藥表型檢測第50頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三51G-菌產(chǎn)生的頭孢菌素酶檢測

-----頭孢哨噻吩濾紙片法

用接種環(huán)挑取受試菌于頭孢哨噻吩（產(chǎn)色頭孢菌素）濾紙片上(商品化)，10分鐘內(nèi)由淺黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色即陽性結(jié)果，表示頭孢菌素的β-內(nèi)酰胺環(huán)被酶打開。臨床意義：產(chǎn)生該酶的細菌對頭孢菌素類抗生素耐藥。第51頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三52G+菌產(chǎn)生的青霉素酶檢測

-----碘淀粉測定法

受試菌混于青霉素溶液，振搖30分鐘。加入淀粉液后，再加入碘液，溶液變藍，繼續(xù)振搖。10分鐘之內(nèi)藍色消失者為產(chǎn)酶株。青霉素酶青霉素青霉素噻唑酸碘碘淀粉復合物變?yōu)闊o色

多為金黃色葡萄球菌產(chǎn)生，對青霉素G耐藥。第52頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三53超廣譜β-內(nèi)酰胺酶

Extended-Spectyumβ-Lactamase，ESBL

ESBLs能水解青霉素類，頭孢菌素和氨曲南。不能水解碳青烯酶類，如亞胺培南多數(shù)可被β內(nèi)酰胺酶抑制劑（如克拉維酸，三唑巴坦及舒巴坦）所抑制。如為ESBL陽性，則對青霉素類，頭孢菌素和氨曲南均報告耐藥，不考慮體外藥敏結(jié)果。第53頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三54常見產(chǎn)ESBLs菌株最常見是腸桿菌科細菌（大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌）；其次，陰溝腸桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、弗勞地枸櫞酸菌、銅綠假單胞菌、奈瑟菌等。

第54頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三55ESBLs的臨床意義對產(chǎn)ESBLs菌株，目前最有效的抗生素為碳青霉烯類（泰能），其次，頭孢西丁及含酶抑制劑的復合劑、氨基糖甙類部分有效。若臨床出現(xiàn)產(chǎn)ESBLs菌株，會在病人和醫(yī)院之間及不同菌株間相互傳播，應引起充分的重視。第55頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三56紙片初篩：培養(yǎng)基：Muller-Hinton瓊脂藥敏紙片接種：按標準紙片擴散法孵育：35℃大氣環(huán)境，16-18小時結(jié)果：頭孢泊肟（10ug／片）抑菌環(huán)≤22mm

頭孢他啶（10ug／片）抑菌環(huán)≤22mm

氨曲南（30ug／片）抑菌環(huán)≤27mm

頭孢噻肟（30ug／片）抑菌環(huán)≤27mm

頭孢曲松（30ug／片）抑菌環(huán)≤25mm

超β-內(nèi)酰胺酶檢測紙片擴散法ESBLs的底物可能產(chǎn)生ESBLs第56頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三57

培養(yǎng)基：Muller-Hinton瓊脂藥敏紙片濃度：頭孢噻肟30ug、頭孢噻肟/克拉維酸30ug/10ug

頭孢他啶30ug、頭孢他啶/克拉維酸30ug/10ug接種：按標準紙片擴散法孵育：35℃大氣環(huán)境，16-18小時結(jié)果：復合制劑藥物紙片的抑菌圈直徑比非復合制劑藥物紙片的直徑

≧5mm

以上者為產(chǎn)ESBLs菌。ESBLs的底物ESBLs的抑制劑(1)．紙片確證試驗：第57頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三58混合克拉維酸藥物紙片無克拉維酸藥物紙片的直徑直徑差﹥5mm：ESBL第58頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三59

篩選試驗：選用頭孢泊肟、頭孢他啶、氨曲南、頭孢噻肟或頭孢曲松至少2種以上，用標準肉湯稀釋法稀釋至1μg/ml,凡被測菌在上述各管中能夠生長(MIC≥2μg/ml)，高度懷疑為ESBLs，應進一步作確認試驗來加以確診。（2）液體稀釋法第59頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三60

確認試驗：用標準肉湯稀釋法測定MIC的方法,頭孢噻肟單獨稀釋(0.25～64μg/ml)及頭孢噻肟(稀釋范圍相同)加克拉維酸(每管4μg/ml);

頭孢他啶單獨稀釋(0.25～128μg/ml)及頭孢他啶加克拉維酸(每管4μg/ml),

上述2種藥物必須同時進行試驗,結(jié)果加克拉維酸和不加克拉維酸的

MIC差值≥8倍(3個稀釋度)，可確認為ESBLs菌株。（2）液體稀釋法第60頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三61二、細菌耐藥基因檢測基因檢測方法檢測細菌耐藥性的優(yōu)缺點抗生素耐藥性的基因檢測方法基因檢測方法的應用第61頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三62基因檢測細菌耐藥性的優(yōu)點：能早期指導臨床醫(yī)生治療用藥。分子遺傳學方法可以直接從臨床標本入手，無需菌株的培養(yǎng)，極大地節(jié)省時間，減輕實驗室生物危險性。有助鑒別那些處于中介水平或常規(guī)藥敏結(jié)果模棱兩可的結(jié)果。分子生物學方法被認為是“金標準”。在細菌耐藥性的流行病追蹤調(diào)研中，耐藥基因檢測比抗生素敏感方法更準確。發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因。第62頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三63基因檢測方法檢測抗生素耐藥性的缺點：當樣品中菌量很少時，其敏感性會大大降低。對每一個測試的抗菌藥物，均需要設(shè)計相應的分子檢測方法，一次只能檢測一種耐藥機制。目前仍有許多耐藥機制是未知的，無法進行分子檢測。耐藥基因的檢測也會存在假陽性問題。對許多耐藥基因的檢測方法，目前還缺乏臨床對照研究以評價其準確性、重復性及臨床應用價值。第63頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三64常見的細菌耐藥相關(guān)基因舉例基因耐藥抗生素細菌種類基因大小bpAnt(4’）氨基糖苷類金黃色葡萄球菌473ant（6’)-la氨基糖苷類糞腸球菌470mecAβ－內(nèi)酰胺類金黃色葡萄球菌400blaTEMβ一內(nèi)酰胺類大腸埃希菌424catD氯霉素艱難桿菌270第64頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三65耐藥基因檢測方法：分子方法檢測耐藥基因的基礎(chǔ)是PCR。在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展的方法：分子雜交、DNA序列分析，基因微振列技術(shù)等。

第65頁，講稿共74頁，2023年5月2日，星期三66PCR-序列特異性引物擴增耐藥基因標本提取DNAPCR擴增目的基因DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析12341234耐藥基因的的特異性引物理想的靶序列應當是耐藥基因的編碼區(qū)域，而非編碼區(qū)外的基因(如插入序列或啟動子序列)。特異性高，需要設(shè)立陰性對