微生物的培養(yǎng)基一

關(guān)于微生物的培養(yǎng)基一第1頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三微生物包括哪五類：病毒細(xì)菌放線菌真菌原生動(dòng)物特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡(jiǎn)單,多數(shù)個(gè)體十分微小(<o.1mm)的生物的總稱。通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu).且體內(nèi)一般不含有葉綠素.不能進(jìn)行光合作用.

原核

原生生物界真菌界病毒界真核第2頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三第3頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三病毒

第4頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三SARS病毒禽流感病毒第5頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三朊病毒（蛋白質(zhì)病毒）第6頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三真菌第7頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三如圖是酵母菌電子顯微鏡下的形態(tài)結(jié)構(gòu)酵母菌和霉菌青霉第8頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三

了解有關(guān)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識(shí)，進(jìn)行無菌技術(shù)的操作，進(jìn)行微生物的培養(yǎng)。

一、課題目標(biāo)：

掌握培養(yǎng)基的制備、高壓蒸氣滅菌和平板劃線法等基本操作技術(shù)，熟練、規(guī)范地進(jìn)行無菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。無菌技術(shù)的操作。二、課題重點(diǎn)和難點(diǎn)：三、技能目標(biāo)：第9頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三（2）按培養(yǎng)基的物理形態(tài)分：液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基一基礎(chǔ)知識(shí):（3）按培養(yǎng)基的功能分：P12基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基（1）按培養(yǎng)基的化學(xué)成分分：·天然培養(yǎng)基·合成培養(yǎng)基·半合成培養(yǎng)基閱讀課本P8第三段分別說出它們的優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)。第10頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三各種培養(yǎng)基的具體配方不同，但一般都包括哪些成分？答：不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、和氮源、無機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

注：另外還需要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),例如:生長(zhǎng)因子(即細(xì)菌生長(zhǎng)必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。

第11頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三第12頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三二無菌技術(shù)：無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。閱讀P8---P9說出消毒和滅菌有何不同？1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學(xué)藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線消毒……(1)常用消毒的方法：第13頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三1、灼燒滅菌:2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.(2)常用滅菌的方法：第14頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三分類定義方法滅菌法殺滅一切微生物物理法：熱力、輻射、微波、等離子體化學(xué)法：醛類、烷化劑高效消毒法殺滅一切致病微生物紫外線、含氯劑、臭氧、復(fù)配劑等中效消毒法殺滅除芽孢外的致病微生物超聲波、碘類、醇類、酚類低效消毒法殺滅細(xì)菌繁殖體、親脂病毒單鏈季胺鹽、雙胍類、中草藥、金屬離子無菌技術(shù)：第15頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三常

識(shí)1．無菌技術(shù)包括：（1）對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒；（2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行

滅菌

；（3）為避免周圍微生物污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近

旁進(jìn)行；（4）避免已滅菌處理的材料用具與

周圍物品

相接觸。2．消毒方法：（1）日常生活經(jīng)常用到的是

煮沸消毒法；（2）對(duì)一些不耐高溫的液體，則使用

巴氏

消毒法（作簡(jiǎn)要介紹）；（3）對(duì)接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強(qiáng)消毒效果，然后使用

紫外線進(jìn)行物理消毒。（4）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手使用酒精進(jìn)行消毒；（5）飲水水源用氯氣進(jìn)行消毒。3．滅菌方法：（1）接種環(huán)、接種針、試管口等使用

灼燒

滅菌法；（2）玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法，所用器械是

干熱滅菌箱；（3）培養(yǎng)基、無菌水等使用高壓蒸汽

滅菌法，所用器械是

高壓蒸汽滅菌鍋。（4）表面滅菌和空氣滅菌等使用

紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。第16頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三三、實(shí)驗(yàn)操作1.制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細(xì)菌）第17頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三【補(bǔ)充】培養(yǎng)基的配制原則：①目的要明確：根據(jù)培養(yǎng)的微生物種類、培養(yǎng)的目的等確定培養(yǎng)基的類型和配制量。②營(yíng)養(yǎng)要協(xié)調(diào)：培養(yǎng)基中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例要適宜。例如：碳氮比4∶1時(shí)，谷氨酸棒狀桿菌大量繁殖而產(chǎn)生谷氨酸少；碳氮比為3∶1時(shí)，菌體繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。③pH要適宜：細(xì)菌培養(yǎng)基pH中性或偏堿性，霉菌培養(yǎng)基呈酸性。第18頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三1．配制：計(jì)算、稱量、熔化2．調(diào)節(jié)pH：用3%的HCI/NaOH調(diào)節(jié)

pH7．0---7．23．分裝：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。4．包扎：操作步驟:第19頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三5．滅菌:

將50ml培養(yǎng)基用玻棒轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～30min。將培養(yǎng)皿用舊報(bào)紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃下滅菌2h。

6．倒平板:

待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時(shí)，在酒精燈附近倒平板。2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種.7．無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24—48小時(shí)，以檢查滅菌是否徹底。第20頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三倒平板:第21頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三菌種的保存1、臨時(shí)保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長(zhǎng)成后置于4℃冰箱保存。

2、長(zhǎng)期保存：甘油冷凍管藏法第22頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時(shí)，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？問題討論

答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。注意:第23頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

答：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。第24頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基:

分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:

分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基:

分離固氮菌不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基:

分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基:

分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基:

分離雜交瘤細(xì)胞第25頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三2、純化大腸桿菌:接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法

平板劃線法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作,將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面.

在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體,這就是菌落.微生物的接種技術(shù)第26頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三第27頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三劃線后培養(yǎng)一段時(shí)間后第28頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三微生物的恒溫培養(yǎng)第29頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三微生物的恒溫培養(yǎng)第30頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三問題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。第31頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三

2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。第32頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三四、課題成果評(píng)價(jià)

（一）培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長(zhǎng)，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。（二）接種操作是否符合無菌要求如果培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn)，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。（三）是否進(jìn)行了及時(shí)細(xì)致的觀察與記錄培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會(huì)有明顯不同，及時(shí)觀察記錄的同學(xué)會(huì)發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)，并能觀察到其他一些細(xì)微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學(xué)生良好的科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。第33頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三本課題知識(shí)小結(jié):第34頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三【典例解析】

例1．關(guān)微生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是:A.是碳源的物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無機(jī)物只提供無機(jī)鹽D.無機(jī)氮源也能提供能量

解析：不同的微生物，所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對(duì)微生物的具體情況分析。對(duì)于A、B選項(xiàng)，它的表達(dá)是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時(shí)是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時(shí)是能源，如葡萄糖；有的碳源同時(shí)是氮源，也是能源，如蛋白胨。對(duì)于C選項(xiàng)，除水以外的無機(jī)物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無機(jī)鹽；而NaCl則只能提供無機(jī)鹽。對(duì)于D選項(xiàng)，無機(jī)氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細(xì)菌提供能量和氮源。答案：D第35頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三例2．下面對(duì)發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是:A.防止雜菌污染B.消滅雜菌C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌D.滅菌必須在接種前答案：B

解析：滅菌是微生物發(fā)酵過程的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。A說的是滅菌的目的，因?yàn)榘l(fā)酵所用的菌種大多是單一的純種，整個(gè)發(fā)酵過程不能混入其他微生物（雜菌），所以是正確的；B是錯(cuò)誤的，因?yàn)闇缇哪康氖欠乐闺s菌污染，但實(shí)際操作中不可能只消滅雜菌，而是消滅全部微生物。C是正確的，因?yàn)榕c發(fā)酵有關(guān)的所有設(shè)備和物質(zhì)都要滅菌；發(fā)酵所用的微生物是滅菌后專門接種的，滅菌必須在接種前，如果接種后再滅菌就會(huì)把所接菌種也殺死。第36頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三編號(hào)成分含量①粉狀硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml例3．右表是某微生物培養(yǎng)基成分，請(qǐng)據(jù)此回答：（1）右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)的微生物類型是

（2）若不慎將過量NaCl加入培養(yǎng)基中。如不想浪費(fèi)此培養(yǎng)基，可再加入

.用于培養(yǎng)金黃色葡萄球菌.自養(yǎng)型微生物

含碳有機(jī)物

第37頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三（3）若除去成分②，加入（CH2O），該培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)

。（4）表中營(yíng)養(yǎng)成分共有