微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)

關(guān)于微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第1頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三微生物的分離和純培養(yǎng)

1.無(wú)菌技術(shù)

2.用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)

3.用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)

4.單細(xì)胞（孢子）分離

5.選擇培養(yǎng)分離

6.二元培養(yǎng)物顯微鏡和顯微技術(shù)

1.顯微鏡的種類(lèi)及原理

2.顯微觀察樣品的制備第2頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三微生物個(gè)體：小利用群體研究屬性群體形式繁衍、保存人為規(guī)定的條件下培養(yǎng)繁殖得到的微生物群體為培養(yǎng)物第3頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三培養(yǎng)物純培養(yǎng)物混合培養(yǎng)物純培養(yǎng)能較好地得到重復(fù)結(jié)果，是微生物研究的重要技術(shù)之一第4頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三顯微技術(shù)是微生物研究的另一項(xiàng)重要技術(shù)個(gè)體小第5頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、微生物的分離和純培養(yǎng)無(wú)菌技術(shù)（aseptictechnique)

分離、轉(zhuǎn)接、純化時(shí)防止其他微生物污染的技術(shù)第6頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三試管、燒瓶、培養(yǎng)皿等常用器皿滅菌方法有：高壓蒸汽滅菌、高溫干熱、煮沸一、微生物的分離和純培養(yǎng)微生物培養(yǎng)常用器皿及滅菌第7頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三接種針或接種環(huán)分離或?qū)⑽⑸飶囊粋€(gè)培養(yǎng)器皿轉(zhuǎn)接到另一個(gè)，無(wú)菌操作。火焰旁邊或無(wú)菌箱或無(wú)菌室進(jìn)行。接種針采用迅速加熱和冷卻的鎳鉻合金制備液體培養(yǎng)物用無(wú)菌移液管或移液槍一、微生物的分離和純培養(yǎng)接種操作，最基本技術(shù)第8頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三第9頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三第10頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、微生物的分離和純培養(yǎng)無(wú)菌操作臺(tái)火焰旁無(wú)菌區(qū)第11頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)各種菌落一、微生物的分離和純培養(yǎng)菌落(colony)：?jiǎn)蝹€(gè)微生物在固體培養(yǎng)基或(內(nèi)層)生長(zhǎng)繁殖形成肉眼可見(jiàn)的，有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞生長(zhǎng)群體。菌落連成片為菌苔（lawn）第12頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、微生物的分離和純培養(yǎng)不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的菌落或菌苔一般都具有穩(wěn)定的特征（形狀、顏色等），是微生物分類(lèi)、鑒定的重要依據(jù)。第13頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三同一細(xì)菌在不同的培養(yǎng)平板上形成不同的特征菌落一、微生物的分離和純培養(yǎng)第14頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、微生物的分離和純培養(yǎng)第15頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三固體培養(yǎng)基：瓊脂或其他凝膠物質(zhì)固化的培養(yǎng)基。平板：即培養(yǎng)平板（cultureplate)。融化的固體培養(yǎng)基倒入無(wú)菌平皿冷卻凝固后即為平板用，于分離、培養(yǎng)微生物。一、微生物的分離和純培養(yǎng)第16頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三稀釋平板法（pourplatemethod)

將細(xì)菌或其他微生物無(wú)菌水梯度稀釋?zhuān)∩倭颗c冷卻至50℃固體培養(yǎng)基混合，搖勻，倒入培養(yǎng)皿，凝固，倒置培養(yǎng)24小時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)菌落。一、微生物的分離和純培養(yǎng)常用固體分離純培養(yǎng)方法：第17頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、微生物的分離和純培養(yǎng)稀釋平板法第18頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三涂布平板法（spreadplatemethod)

稀釋平板法因?yàn)榧?xì)菌與50℃培養(yǎng)基混合導(dǎo)致某些熱敏感菌死亡，及好氧菌埋在培養(yǎng)基中缺乏氧氣影響生長(zhǎng)，所以更常用涂布平板法。一、微生物的分離和純培養(yǎng)常用固體分離純培養(yǎng)方法：第19頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三第20頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三平板劃線分離法（streakplatemethod）

接種環(huán)沾取少許微生物，在無(wú)菌平板扇形、平行等劃線，隨劃線次數(shù)增加而分散開(kāi)，得到單菌落。平板劃線分離一、微生物的分離和純培養(yǎng)第21頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三第22頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三稀釋搖管法(dilutionshakeculturemethod）

厭氧微生物可用此法進(jìn)行純培養(yǎng)分離。操作：盛培養(yǎng)基試管加熱融化，冷卻至50℃，待分離材料用這些試管梯度稀釋?zhuān)瑩u勻，冷凝，石蠟封口一、微生物的分離和純培養(yǎng)第23頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三厭氧微生物分離裝置：一、微生物的分離和純培養(yǎng)厭氧罐厭氧手套箱第24頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)：一、微生物的分離和純培養(yǎng)有些微生物液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)，原生動(dòng)物、藻類(lèi)。稀釋法：接種物在液體培養(yǎng)基中順序稀釋?zhuān)叨认♂專(zhuān)總€(gè)試管中分配不到一個(gè)。若稀釋后同一梯度的平行試管中大多數(shù)（>95％）沒(méi)有微生物生長(zhǎng)，那么有微生物的可能是純培養(yǎng)，否則可能性下降。第25頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三顯微分離法直接分離單細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體培養(yǎng)獲得純養(yǎng)一、微生物的分離和純培養(yǎng)單細(xì)胞（單孢子）顯微分離：稀釋法缺點(diǎn)分離的優(yōu)勢(shì)菌顯微操作儀，專(zhuān)業(yè)程度高第26頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三

對(duì)某微生物生長(zhǎng)需要了解后，設(shè)計(jì)適合其生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)基，抑制其他菌生長(zhǎng)，即使該微生物在混雜群體中（很少也可)分離。一、微生物的分離和純培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離方法：第27頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三選擇培養(yǎng)基直接分離一、微生物的分離和純培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離方法：如：耐高溫菌采用高溫篩選；蛋白酶產(chǎn)生菌加牛奶篩選；抗抗生素可采用加抗生素篩選待分離的微生物生長(zhǎng)，其它微生物的生長(zhǎng)被抑制第28頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、微生物的分離和純培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離方法：富集培養(yǎng)特定的環(huán)境條件僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長(zhǎng)待分離微生物在群落中的數(shù)量大大增加從自然界中分離到所需的特定微生物第29頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三根據(jù)微生物的特殊要求，從自然界分離出特定已知微生物種類(lèi)；分離培養(yǎng)在特定環(huán)境中能生長(zhǎng)的微生物；富集培養(yǎng)第30頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、微生物的分離和純培養(yǎng)二元培養(yǎng)物：培養(yǎng)物只含兩種微生物，并有意識(shí)保持兩者之間的特定關(guān)系的培養(yǎng)物為二元培養(yǎng)物。如：病毒－－宿主，原生動(dòng)物－－細(xì)小微生物第31頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、微生物的分離和純培養(yǎng)微生物菌種保藏技術(shù)：為何保藏如何保藏性狀穩(wěn)定的菌種是微生物學(xué)工作最重要的基本要求，否則生產(chǎn)或科研都無(wú)法正常進(jìn)行。要求：菌種不死，不污染，不變易中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)（CCCCM)，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），美國(guó)典型菌種保藏中心（ATCC）等第32頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、微生物的分離和純培養(yǎng)微生物菌種保藏技術(shù)：如何保藏根據(jù)菌種特性和保藏目的不同，給特定環(huán)境使其存活而得以保存連續(xù)移種或改變環(huán)境條件：干燥、低溫缺氧、避光、缺乏營(yíng)養(yǎng)等第33頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三斜面：可保存數(shù)周至數(shù)年，可用石蠟或橡皮塞封口，低溫延長(zhǎng)保存時(shí)間液體：菌苔制成菌懸液，低溫（懸液保藏法）缺點(diǎn)：繁瑣、易污染、變異喪失原有特性一、微生物的分離和純培養(yǎng)微生物菌種保藏技術(shù)：傳代保藏斜面、半固體瓊脂柱、液體第34頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三斜面制作：第35頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、微生物的分離和純培養(yǎng)微生物菌種保藏技術(shù)：冷凍保藏液氮保藏、低溫冰箱等液氮可達(dá)－196℃，效果較好注意：速凍，減少冰晶損傷細(xì)胞第36頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、微生物的分離和純培養(yǎng)微生物菌種保藏技術(shù)：干燥保藏沙土管保藏、冷凍真空干燥保藏沙土管：產(chǎn)孢子菌。制成孢子懸液，加無(wú)菌沙土管，減壓抽干水分，石蠟封口，冰箱保存。冷凍真空干燥：加保護(hù)劑樣品預(yù)先冷凍，真空冰升華去水，低溫保存，保存數(shù)十年，目前最普遍、最重要的方法，菌種保藏中心多采用此法。菌種保藏時(shí)采用不同手段保藏，防止某種方法失敗導(dǎo)致菌種喪失。第37頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、顯微鏡和顯微技術(shù)決定顯微觀察效果重要因素：分辨率和反差分辨率：辨別兩點(diǎn)之間最小距離的能力反差：樣品與背景區(qū)別程度普通顯微鏡調(diào)焦螺旋光學(xué)系統(tǒng)：物鏡、目鏡、聚光器

機(jī)械裝置：鏡座、支架、載物臺(tái)、

普通顯微鏡結(jié)構(gòu)示意圖顯微鏡種類(lèi)和原理：第38頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、顯微鏡和顯微技術(shù)光學(xué)顯微鏡一般配置的最大放大倍數(shù)是多少？為什么？目鏡：10~15╳；物鏡：100╳；總放大倍數(shù)1000~1500╳；如何實(shí)現(xiàn)光學(xué)顯微鏡一般配置的最大放大倍數(shù)？其原理？使用油鏡，即在100╳,物鏡和載玻片之間滴加香柏油；香柏油與玻璃折射率相近第39頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、顯微鏡和顯微技術(shù)

0.5l分辨率（最小可分辨距離）=————nsinq分辨率與所用波長(zhǎng)成反比！第40頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三N：玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率空氣（n=1.0）、水（n=1.33）、香柏油（n=1.52）顯微觀察時(shí)可根據(jù)物鏡的特性而選用不同的介質(zhì)二、顯微鏡和顯微技術(shù)第41頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、顯微鏡和顯微技術(shù)浸沒(méi)油與玻璃的折射率相近很多原來(lái)由于在透鏡及載片表面的反射和折射而損失的光線可以進(jìn)入物鏡，使照明亮度提高，改善觀察效果。第42頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三暗視野顯微鏡二、顯微鏡和顯微技術(shù)活細(xì)菌在普通顯微鏡下是透明，觀察不清，采用暗視野顯微鏡，如：黑夜看星星就很清楚。

暗視野顯微鏡結(jié)構(gòu)與照明示意圖第43頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三暗視野顯微鏡二、顯微鏡和顯微技術(shù)特殊聚光器實(shí)現(xiàn)斜射照明，給樣品照明的光線不直接穿過(guò)物鏡，而經(jīng)樣品反射或折射后進(jìn)入物鏡，使樣品與背景差別大，可以清楚看到透明微小顆粒。用于：生活細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性觀察。第44頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三相差顯微鏡二、顯微鏡和顯微技術(shù)第45頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三相差顯微鏡二、顯微鏡和顯微技術(shù)光線透過(guò)透明標(biāo)本，波長(zhǎng)（顏色）和振幅（亮度）沒(méi)有多大變化，用普通顯微鏡觀察透明標(biāo)本，其形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)難以分辨。細(xì)胞各部分折射率和厚度不同，當(dāng)光線通過(guò)時(shí)，直射光和衍射光光程有差別，而人眼看不到，但是可通過(guò)相差顯微鏡看到。相差顯微鏡采用特殊光學(xué)裝置：環(huán)狀光闌和相差板，利用光的干涉，將光的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)槿搜劭梢?jiàn)的振幅差（明暗），使能不染色而看到活細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的某些顯微結(jié)構(gòu)。其發(fā)明人F.Zernike因此獲1953年諾貝爾物理獎(jiǎng)。第46頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三相差顯微鏡下的血液流動(dòng)：第47頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、顯微鏡和顯微技術(shù)透射電子顯微鏡（簡(jiǎn)寫(xiě)TEM）用波長(zhǎng)短的電磁波取代可見(jiàn)光，使分辨率提高。工作原理類(lèi)似，因光源不同，有區(qū)別:1)電子若遇空氣中分子會(huì)發(fā)生偏轉(zhuǎn)使物象不清楚，因此鏡筒高真空2)電子帶電荷，電鏡是用電磁圈使之聚焦3)電子成像人眼看不到，用熒光屏顯示或感光膠片記錄第48頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三大腸桿菌透射電子顯微鏡圖第49頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三掃描電子顯微鏡（SEM）掃描電子顯微鏡大腸桿菌掃描電鏡圖二、顯微鏡和顯微技術(shù)工作原理與光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡不同，是電子束掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，電子產(chǎn)生多少與標(biāo)本表面立體形貌有關(guān)。電子經(jīng)探測(cè)器收集，經(jīng)光電倍增管和放大器，產(chǎn)生樣品立體圖像于熒光屏上。主要用于：樣品表面結(jié)構(gòu)第50頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三掃描隧道顯微鏡（STM）二、顯微鏡和顯微技術(shù)80年代出現(xiàn)的，原理：利用量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)。其橫向分辨率：0.1～0.2nm，縱向分辨率：0.001nm這種分辨率足以對(duì)單個(gè)原子觀察。利用這種顯微鏡直接觀察蛋白質(zhì)、DNA、RNA等以及virus等結(jié)構(gòu)。第51頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三

廚房抹布上的細(xì)菌和霉菌棉纖維上的汗垢掃描隧道顯微鏡下的DNA第52頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三顯微樣品制備二、顯微鏡和顯微技術(shù)樣品好壞直接影響觀察結(jié)果。考慮因素：根據(jù)所用顯微鏡特點(diǎn)采用合適制樣方法，盡可能使樣品生理結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，采用各種方法提高反差。第53頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、顯微鏡和顯微技術(shù)顯微樣品制備之光學(xué)顯微鏡制樣光學(xué)顯微鏡制樣活體觀察染色壓滴法懸滴法菌絲埋片法活菌死菌美藍(lán)染色簡(jiǎn)單染色鑒別染色革蘭氏染色、鞭毛染色、芽孢染色第54頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、顯微鏡和顯微技術(shù)特點(diǎn)：避免染色對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，用于運(yùn)動(dòng)性、攝食特性、生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中形態(tài)變化等觀察壓滴法：菌懸液滴載玻片，加蓋玻片直接觀察懸滴法：蓋玻片滴一滴菌懸液，反轉(zhuǎn)置于特制凹載玻片直接觀察菌絲埋片法：無(wú)菌小玻璃紙鋪平板表面，涂布孢子懸液，培養(yǎng)后，取下玻璃紙置于載玻片，觀察光學(xué)顯微鏡樣品制備－－活體觀察第55頁(yè)，講稿共61頁(yè)，2023年5月2日，星期三活體觀察難看到微生物的細(xì)致形態(tài)和結(jié)構(gòu)，需染色觀察。染色前需要對(duì)樣品固定，目的：殺死細(xì)菌使菌體黏附在玻片上；還可增加對(duì)染料的親和力。常用：酒精火焰加熱和化學(xué)固定兩種方法二、顯微鏡和顯微技術(shù)光學(xué)顯微樣品