活細(xì)胞檢測技術(shù)

活細(xì)胞分析檢測技術(shù)常規(guī)染色法檢測FCM技術(shù)檢測MTT法檢測MTT法的應(yīng)用活細(xì)胞的檢測某些染料當(dāng)細(xì)胞死亡時能透過變性的胞膜與解體的細(xì)胞核DNA結(jié)合，而令其著色。因而能鑒別細(xì)胞死活。一、臺盼藍(lán)排除法

1．試劑：

①4％臺盼藍(lán)母液：稱取4g盼藍(lán)，加少量雙蒸水研磨，加水（雙蒸）至100ml，離心后取上清液。②1.8％氯化鈉溶液。步驟：用前兩液以1:1混合，制成2%臺盼藍(lán)液。再取1滴細(xì)胞懸液和1滴2%臺盼藍(lán)液混合，放蓋片，置3分鐘，鏡下觀察200細(xì)胞。活細(xì)胞不著色，死細(xì)胞核呈藍(lán)色。計算百分比。二、中性紅排除法

步驟：（1）配1%中性紅水溶液（雙蒸水）。（2）染前用Hanks液作10倍稀釋，離心（1500轉(zhuǎn)/分）7分鐘，取上清為染液。（3）將細(xì)胞懸液與染液4:1混合，混勻后加蓋片靜置15～20分鐘。鏡下觀察。死細(xì)胞不著色，活細(xì)胞吸收中性紅液，呈紅色求百分率。三、吖啶橙（AO）熒光染色法

（1）取少量血細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞或其它懸液細(xì)胞，數(shù)量在1×10級。（2）滴加0.01吖啶橙（AcriclineOrange,AO）生理鹽水液1～2滴，加蓋片后染色5分鐘。（用0.1%吖啶橙水溶液與0.1MPBS以1:9混合）。（3）熒光顯微鏡下觀察，采取激發(fā)濾片BG-12（或BV），阻斷濾片波長515nm士者。結(jié)果：活細(xì)胞的胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈綠色熒光，死細(xì)胞的胞核呈紅色熒光。嗜中性顆粒為桔紅。嗜酸和嗜堿性顆粒為鮮紅色。四、苯胺黑排除試驗苯胺黑染色液毒性小，較長時間染色也不致傷害細(xì)胞，使死細(xì)胞增多。死細(xì)胞著染苯胺黑較臺盼藍(lán)和中性紅略慢，可用于鑒定細(xì)胞死活和微量細(xì)胞毒。試劑：1%苯胺黑水溶液（過濾后用），含2.5%小牛血清的生理鹽水。操作步驟：（1）取細(xì)胞，制成1～5×細(xì)胞/ml懸液。（2）染前將1%苯胺黑水溶液與含血清的生理鹽水作1:9混合稀釋，使其成為0.1%苯胺黑鹽水溶液。（3）取0.1ml細(xì)胞懸液和0.1ml苯胺黑鹽水溶液混合，置室溫10分鐘。（4）取1滴染色的細(xì)胞懸液滴于載片，覆以蓋片，高倍鏡下觀察，著染藍(lán)黑色者為死細(xì)胞。數(shù)200細(xì)胞分別計數(shù)死、活者，計數(shù)活細(xì)胞百分比。五、伊紅丫排除試驗：試劑：生理鹽水配制0.2%伊紅丫溶液操作步驟：（1）取細(xì)胞，制成1～5×細(xì)胞/ml懸液。（2）取0.1ml細(xì)胞懸液和0.1ml伊紅丫染液混合。（3）取1滴混合液滴于載片，加蓋片后置1分鐘，在高倍鏡下觀察，著紅染色者為死細(xì)胞。數(shù)200個細(xì)胞，分別計數(shù)活、死細(xì)胞，求活細(xì)胞百分比。六、溴化乙啶（EB）和碘化丙啶（PI）排除法碘化丙啶（PropidiumIodine,PI）和溴化乙啶（Ethidiumbromide,EB）均屬啡啶類，為核酸嵌入型染料?？汕度攵嗪塑账峤Y(jié)構(gòu)，與DUA雙鏈特異性結(jié)合?；罴?xì)胞胞膜可排斥這兩種試劑穿透進(jìn)入。而死細(xì)胞胞膜易被穿透，致使胞核著色，PI等對死活細(xì)胞的鑒別染色非常敏感，常用于FACS測定。七、雙醋酸熒光素（FDA）染色試劑：將雙醋酸熒光素（FDA）以mlg/mc溶于丙酮，分裝作為保存液?？捎?20℃下長久保存。操作步驟；（1）用前，將保存液PBS稀釋成1:400,000。（2）將細(xì)胞滴加FDA稀釋液染色（3）將細(xì)胞標(biāo)本立即置熒光顯微鏡下，用激發(fā)濾片藍(lán)紫、紫外、陰隔濾片515nm觀察，活細(xì)胞應(yīng)呈綠色熒光。單擊芳顯示FC中M在活天細(xì)胞葬檢測此中的垂應(yīng)用八、叢測定威細(xì)胞開存活源和增民殖的MT畜T方法用MT斥T法測伸定活白細(xì)胞逐及細(xì)涼胞增競殖，予是基朋于黃第色的MT姥T能被鳴活細(xì)幻玉胞線欲粒體勢脫氫毒酶（作如琥狀珀酸綿脫氫師酶和和心肌晨黃酶撈）還寨原成績藍(lán)色才的Fo未rm雨az憐an，從而絮可用采比色渠法推爹測細(xì)智胞濃嗚度。瞇死細(xì)章胞或拿紅細(xì)姑胞沒捎有這廣種能奶力。譯甲脯待產(chǎn)生樓的量必與細(xì)炕胞數(shù)漂成正鉗比，外活化掉的細(xì)途胞比篇靜止聞的細(xì)差胞產(chǎn)田生更疤多甲論脯，夾其最弟大優(yōu)遷點是詠不需贊要任聲何洗焦滌步蝴驟可進(jìn)以在墾酶標(biāo)筑儀上席快速預(yù)分析治和測山定大旦量樣狗品。線粒落體中鳴的脫青氫酶徐(如扇琥珀宏酸脫鑰氫酶筐、心濟肌黃廉酶)死可將數(shù)四甲嘴基偶繼氮唑姿鹽(MT憂T)的唑鈔環(huán)打偽開，穩(wěn)生成序藍(lán)色權(quán)的產(chǎn)桂物fo碑rm梯az川an。根據(jù)青這個愛原理填，Mo腹sm項an猜n于1呈98值3年襖創(chuàng)立鉆了MT片T檢測驕法，歡此法戲在測看定細(xì)豆胞的肆存活菌和增沙殖方漏面非懸常有嘴效，土因為摟這種裙顏色股的變辰化僅回僅發(fā)窩生在場活的序細(xì)胞柿中，炊并且拳甲果的形米成量冒與活金細(xì)胞考數(shù)和相功能跡狀態(tài)梯是成窩比例殃的。飾目前MT細(xì)T測定悶法已暗經(jīng)廣皆泛地纖應(yīng)用冤于多令種生博長因以子如陣表皮慘生長咬因子載、腫慚瘤壞秤死因殼子、點白細(xì)朝胞介顏素-堆2等稠的檢肌測工鋒作中起。MT星T測定腿法方隙法對數(shù)并生長波期細(xì)畝胞按駝一定夜?jié)舛刃蚪臃N主10茅0μl到9摧6孔焰培養(yǎng)追板(Co梅st侮ar栽)，設(shè)5侄個重程復(fù)孔懷，空尼白為燦不含程細(xì)胞蕩的完覆全培螺養(yǎng)基娃，陰隙性對瞧照為乖空白妥培養(yǎng)普基及臣細(xì)胞嫁。加朱入一側(cè)定數(shù)抗量的MT貿(mào)T于孔靠中，歡置3車7℃午、5恰%CO2培養(yǎng)童箱中悉繼續(xù)攏培養(yǎng)測一定債時間宋。然椒后每桃孔加孟入fo肢rm禾az京an溶解摘液，溝其中鐘短時織溶解碼液以紗加樣折器混傘合，貪放置辮一定慮時間蠅。肉潔眼觀慎察蛋黃白質(zhì)錦絮狀含沉淀顛情況挺，倒幻玉置顯擴微鏡廢下觀則察針鮮狀染擠料結(jié)聲晶的慮情況灑并判杜斷其違溶解敢程度道。用車全自尼動酶巷標(biāo)儀薄(BI泰O-早RA悶D詠Mo銹de糊l隱45作0)測定味其D值，傘測定捏波長怖為5堂70nm閣，參考食波長星為6壞55nm務(wù)。MT綱T測定鴉已有是效地夢應(yīng)用岸于生窮物學(xué)掘和醫(yī)富學(xué)的始許多殊研究環(huán)之中要，如富淋巴茫毒素麗，生舒長因婚子，倒白細(xì)矩胞介恥素-峽2，賽干擾住素，轟淋巴亮細(xì)胞窯轉(zhuǎn)化烤和補士體介鉛導(dǎo)的朗細(xì)胞華毒