氨基酸與蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)

關(guān)于氨基酸與蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)第1頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)種類與功能的多樣性1010-1012結(jié)構(gòu)蛋白貯藏蛋白收縮蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白第2頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三第一節(jié)氨基酸180多種天然AA，大多數(shù)是不參與蛋白質(zhì)組成的。這些AA被稱為非蛋白質(zhì)AA。參與蛋白質(zhì)組成的AA為蛋白質(zhì)AA，常見的只有20種

基本氨基酸，標(biāo)準(zhǔn)氨基酸表達(dá)方式：三字母或單字母的簡(jiǎn)寫符號(hào)第3頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三（一）-氨基酸的結(jié)構(gòu)通式除脯氨酸外，其他19種均具有如下結(jié)構(gòu)通式。各種氨基酸的區(qū)別在于側(cè)鏈R基的不同。-氨基酸可變部分不變部分一、基本氨基酸第4頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三(二)常見的標(biāo)準(zhǔn)AA－20種1,按側(cè)鏈R基的化學(xué)結(jié)構(gòu)，分為三類脂肪族氨基酸—15種C2:1C3:3C4:3C5:4C6:4芳香族氨基酸－3種雜環(huán)族氨基酸－2種第5頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三脂肪族氨基酸第6頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三芳香族氨基酸－3種第7頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三雜環(huán)族氨基酸第8頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三GlyAlaValLeuIlePheTyrTrpCysMetSS氨基酸的R基大小第9頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三2，根據(jù)酸堿性分類:

酸性氨基酸:2個(gè)–COOH、1個(gè)-NH2

Asp，Glu

堿性氨基酸:1個(gè)–COOH、2個(gè)堿性基團(tuán)

（胍基、氨基、咪唑基）

Arg，Lys，His

中性氨基酸:1個(gè)–COOH、1個(gè)-NH2

第10頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三3，按R基的極性性質(zhì)分為4類：非極性氨基酸：9

極性不解離：6極性氨基酸解離帶負(fù)電荷：2酸性極性解離解離帶正電荷：3堿性

第11頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三POLARNON-POLARTyrHisGly酸性中性BasicAspGluGlnCysAsnSerThrLysArgAlaValIleLeuMetPheTrpPro氨基酸的極性分類極性或非極性，是影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的關(guān)鍵第12頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三--+++SS有大有小有正有負(fù)有極性非極性

形形色色的氨基酸側(cè)基

第13頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三特殊氨基酸含硫氨基酸含羥基氨基酸-Cβ帶分支氨基酸二羧基一氨基氨基酸二氨基一羧基氨基酸亞氨基酸第14頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、氨基酸的構(gòu)型和旋光性*除甘氨酸外，皆含手性C，皆為L(zhǎng)-構(gòu)型（蛋白中的氨基酸）；旋光方向不同。左或右旋。旋光儀測(cè)定。比旋光度[α]D25(單位濃度、單位長(zhǎng)度下的旋光度，＝α/c*l)是氨基酸的重要物理常數(shù)之一，是鑒別各種氨基酸的重要依據(jù)。第15頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三四：特征光吸收在近紫外區(qū)(200-400nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。酪氨酸的max＝275nm，色氨酸的max＝280nm苯丙氨酸的max＝257nm第16頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三五氨基酸的酸堿性質(zhì)一）氨基酸的兼性離子形式：氨基酸的兩個(gè)重要性質(zhì)：氨基酸晶體的熔點(diǎn)高（200C）；氨基酸使水的介電常數(shù)增高。AA是兩性電解質(zhì)第17頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三COOHNH2

H+COO-R

-

C

-

HNH2

H+R

-

C

-

HCOO-NH2R

-

C

-

H酸性環(huán)境中性環(huán)境堿性環(huán)境+1-10pK1~2pK2~9.4等電點(diǎn)6.0等電點(diǎn)pI：所帶凈電荷為零。電場(chǎng)中不移動(dòng)。第18頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三此氨基酸在pH2或9附近，有緩沖作用。第19頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三第20頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三賴氨酸的解離及等電點(diǎn)計(jì)算HA2+A+A0A-第21頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)：分子呈電中性時(shí)溶液的pH值。為兼性離子兩側(cè)解離基團(tuán)的算術(shù)平均值。中性氨基酸：酸性和堿性基團(tuán)的算術(shù)平均值：pI=(pK’-COO-+pK’-NH2)/2，pI～6

酸性氨基酸：兩個(gè)酸性解離基團(tuán)的算術(shù)平均值pI=(pK’-COO-+pK’R-COO-

)/2，pI～2堿性氨基酸：兩個(gè)堿性解離基團(tuán)的算術(shù)平均值pI=(pK’-NH2+pK’R-NH2)/2，pI>7

第22頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三不同pH值時(shí)所帶電荷

pH=pI氨基酸呈電中性，電泳不移動(dòng)

pH<pI氨基酸帶正電荷，向陰極移動(dòng)

pH>pI氨基酸帶負(fù)電荷，向陽(yáng)極移動(dòng)在一定pH范圍中，溶液的pH離AA等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)，AA帶凈電荷愈多，泳動(dòng)速度越快。第23頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三補(bǔ)充：化學(xué)性質(zhì)亞硝酸反應(yīng)烴基化反應(yīng)?；磻?yīng)脫氨基反應(yīng)西佛堿反應(yīng)成鹽成酯反應(yīng)成酰氯反應(yīng)脫羧基反應(yīng)疊氮反應(yīng)側(cè)鏈反應(yīng)茚三酮反應(yīng)成肽反應(yīng)第24頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三除Pro生成黃色化合物外,其它AA生成藍(lán)紫色化合物（570nm）;

與茚三酮反應(yīng)（27）用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。茚三酮水合茚三酮第25頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三補(bǔ)充：含氮量穩(wěn)定氨基酸的結(jié)構(gòu)通式為α氨基酸。蛋白質(zhì)除含C,H,O外，還含有N。AA平均分子量為110。不同蛋白的含氮量皆在16%左右。只需測(cè)定N含量，N含量/16%即為蛋白含量。

----凱氏定氮法的理論基礎(chǔ)第26頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三第二節(jié)、氨基酸的分離分析根據(jù)R基的極性。原理：分配層析。

①濾紙層析：②薄層層析：根據(jù)氨基酸的凈電荷及R基的極性：

③離子交換層析：陰離子交換樹脂-N(CH3)3OH，陽(yáng)離子交換樹脂-SO3H根據(jù)氨基酸的凈電荷及質(zhì)點(diǎn)大?。?/p>

④電泳：第27頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三分配層析的一般原理

層析法――色層分析法（色譜）

系統(tǒng)的組成固定相（靜相）

流動(dòng)相（動(dòng)相）分配定律――當(dāng)溶質(zhì)在兩種給定的互不相溶的溶劑中分配時(shí)，在一定的溫度下達(dá)到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比值為一常數(shù).此比值即分配系數(shù)（kd）。第28頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三一）紙層析固定相：纖維素上吸附的水

流動(dòng)相：展層溶劑，有機(jī)相

層析時(shí)，混合AA在兩相中不斷分配，疏水性強(qiáng)的AA在固定相水中溶解度較小，與水的作用力也較小，隨展層劑的展層（移動(dòng)）也移動(dòng)較遠(yuǎn)距離（遷移率Rf大）。極性強(qiáng)的Rf值小，疏水性強(qiáng)的Rf大。分離、鑒定AA混合物的方法。第29頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三將下列每組混合物分別用正丁醇-醋酸-水進(jìn)行紙層析，指出每組的相對(duì)遷移率。(1)Val和Lys;(2)Phe和Ser;(3)Leu、Ala、Ser第30頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三第三節(jié)肽和蛋白質(zhì)一個(gè)氨基酸的羧基與另一個(gè)氨基酸的氨基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵，所形成的化合物稱為肽。一、肽、肽鍵與肽鏈由兩個(gè)氨基酸組成的肽稱為二肽，由幾個(gè)到幾十個(gè)氨基酸組成的肽稱為寡肽，由更多個(gè)氨基酸組成的肽則稱為多肽。組成肽鏈的氨基酸單元稱為氨基酸殘基。第31頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序。方向性：一條多肽鏈有兩個(gè)末端，自由-氨基，稱為氨基端或N-端；游離-羧基，稱為羧基端或C-端。氨基酸的順序：N-端→C-端如上述五肽可表示為：Ser-Val-Tyr-Asp-Glu

絲氨酰纈氨酰酪氨酰天冬氨酰谷氨酸肽單位主鏈：側(cè)鏈第32頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、肽的解離性質(zhì)肽具有酸堿兩性性質(zhì)和等電點(diǎn)。肽的酸堿性質(zhì)主要來(lái)自游離末端-NH2和游離末端-COOH以及側(cè)鏈R上可解離的基團(tuán)。每一種肽都有其相應(yīng)的等電點(diǎn)。末端-NH2,-COOH比游離氨基酸的酸堿度降低。

第33頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三第34頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、生物活性肽在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。部分肽中含有D-氨基酸。第35頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三

CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOHCH2CH2CHNH2COOHCH2SH

1.參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng)2.作為輔酶參與氧化還原反應(yīng)保護(hù)巰基酶或含Cys的蛋白質(zhì)中

SH的還原性防止氧化物積累GSH+GSH----GSSG第36頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三第四節(jié)、蛋白的分離根據(jù)：所要提取的蛋白（目的蛋白）與其它蛋白（雜蛋白）的不同進(jìn)行分離?！鋈芙舛炔煌?反相柱層析；鹽析

■分子量不同:透析；凝膠過濾法■所帶電荷不同:電泳；離子交換層析

特有的親和力：親和層析第37頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三一）鹽析法：溶解度不同不同的蛋白質(zhì)溶解度不同。且溶解度隨外界條件如鹽濃度，pH值，溫度等而變。■

鹽對(duì)蛋白質(zhì)濃度的影響●鹽溶

Salting-in:

加少量鹽使蛋白質(zhì)溶解度變大●鹽析

Salting-out:加大量鹽使蛋白質(zhì)由溶液中沉淀出來(lái)第38頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三■

蛋白質(zhì)溶解度和pH值及鹽濃度有關(guān)0.0010.0050.01

0.02[NaCl](mol/L)pI4.85.05.25.45.6pH溶解度蛋白的穩(wěn)定因素：（1）帶電層（2）水化層加入少量鹽：增加帶電層，促進(jìn)溶解。

--------鹽溶第39頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三Aggregate蛋白質(zhì)分子表面的疏水性區(qū)域，聚集許多水分子，當(dāng)加入鹽時(shí)，這些水分子被抽出，暴露出來(lái)的疏水性區(qū)域互相結(jié)合，形成沉淀?！?/p>

鹽析

Salting-out：Ionicstrength溶解度+-+++-----+AmmoniumsulfateSodiumsulfateAlittlesalting-ineffectNH4+SO42-=hydrophobic第40頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三不同蛋白的溶解度曲線

硫酸銨分級(jí)沉淀第41頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三二）凝膠過濾法：分子量不同又稱為分子篩層析。依蛋白質(zhì)分子量的差異，通過具有分子篩性質(zhì)的凝膠而分離。葡聚糖凝膠G10-G200瓊脂糖凝膠2B,4B,6B聚丙烯酰胺凝膠S100－S600第42頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三■凝膠顆粒第43頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三小分子進(jìn)入凝膠分子內(nèi)，被滯留大分子在凝膠顆粒間移動(dòng)，較快流出溶劑流動(dòng)方向按分子量從大到小依次流出第44頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三問題：已知下列蛋白的分子量。問以凝膠過濾法洗脫時(shí)蛋白質(zhì)的洗脫順序如何？（凝膠分級(jí)范圍為5000～400，000）④②⑤①③第45頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三三）親和層析法：特定親和力如兩分子間有專一性親和力（特別的結(jié)合和識(shí)別能力，具有針對(duì)性），以其中一種作為“魚餌”，可把另外一種“釣”出來(lái)。其它蛋白不被吸引而結(jié)合不上。第46頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三■親和層析法的作用機(jī)理：固相載體(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXB親和基團(tuán)的配體XBAA第47頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三四）蛋白電泳在外電場(chǎng)的作用下，帶電顆粒向著與其電性相反的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。蛋白質(zhì)有各自的等電點(diǎn)。在非等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒均帶有不同的電荷。蛋白質(zhì)顆粒在電場(chǎng)中移動(dòng)的速度（v）取決于電場(chǎng)強(qiáng)度(E)，所帶的凈電荷(q)以及與介質(zhì)的摩擦系數(shù)(f，即顆粒大小及形狀)。第48頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS（十二烷基磺酸鈉）是一種陰離子型表面活性劑，它能夠與蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基按大約12比例結(jié)合，使蛋白以一條無(wú)構(gòu)型的長(zhǎng)條分子存在，且分子表面均勻結(jié)合一層負(fù)的SDS的電荷，蛋白質(zhì)分子原有電荷間的差別則可以忽略。用已知分子量的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，則可以估算出不同蛋白質(zhì)的分子量。第49頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三第50頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三第五節(jié)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定定義——1969年，國(guó)際純化學(xué)與應(yīng)用化學(xué)委員會(huì)（IUPAC）規(guī)定：蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)多肽連中AA的排列順序，包括二硫鍵的位置。第51頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三F.Sanger

(1953,CambridgeU)

Insulin胰島素(A,Bchains)以傳統(tǒng)氨基酸定序法決定蛋白質(zhì)序列SSSSSS+NH3NH3+-OOCQGIVEQCCTSICSLYLENYCNCOO-FSFVNQHLCGHLVEALYLVCGERGFYTPKT

B-chain

A-chain第52頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三一）、Edmandegradation降解法測(cè)定氨基酸順序的一般測(cè)定步驟（1）測(cè)定多肽鏈的數(shù)目，拆分多肽鏈，分析多肽鏈的N末端和C末端殘基（2）斷裂多肽鏈內(nèi)、間的二硫鍵（3）測(cè)定每條多肽鏈的AA組成（4）多肽鏈斷裂成小肽段

（5）測(cè)定各個(gè)肽段的AA順序（6）確定肽段在多肽鏈中的次序

（7）確定原多肽鏈中二硫鍵的位置第53頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三Sanger法。2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP-肽）。酸解，得黃色DNP-氨基酸，用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進(jìn)行鑒定。（一）N末端分析法二硝基氟苯（DNFB）法是游離氨基酸、多肽及蛋白共有的一個(gè)反應(yīng)第54頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三用途：可以用來(lái)鑒定多肽或蛋白質(zhì)NH2末端氨基酸.DNS

+

AA多肽蛋白弱堿DNS-AA多肽蛋白酸DNS-AA

+游離AA（乙醚抽提，有熒光）丹磺酰氯法第55頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三(二)二硫鍵的斷裂在可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍（使蛋白變性，亞基分開）存在下，使用過量的-巰基乙醇，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化。第56頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三(三)氨基酸組成的分析：酸，堿解后氨基酸分析儀測(cè)定第57頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三（四）多肽鏈的部分水解1、酶裂解法

胰蛋白酶

蛋白水解酶（蛋白酶）：糜蛋白酶（肽鏈內(nèi)切酶）

嗜熱菌蛋白酶

胃蛋白酶

第58頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三胰蛋白酶Trypsin

：R1=賴氨酸Lys和精氨酸Arg側(cè)鏈（專一性較強(qiáng)，水解速度快）。胰凝乳（糜）蛋白酶：專一性﹤胰蛋白酶

斷裂Phe,Trp,Tyr等芳香族AA的羧基形成的肽鍵。水解位點(diǎn)2、化學(xué)試劑法：溴化氰。R1=甲硫氨酸。第59頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三五）氨基酸序列的測(cè)定1、Edman化學(xué)降解法Edman（苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分析法實(shí)際上也是一種N-端分析法。此法的特點(diǎn)是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。第60頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三

用途：可以用來(lái)鑒定多肽或蛋白質(zhì)NH2末端氨基酸。亦稱Edman反應(yīng)弱堿

AAPITC+多肽蛋白

AAPTC—多肽蛋白無(wú)水甲酸或HFPTH-AA+少一個(gè)AA的多肽或蛋白（乙酸乙酯抽提）苯異硫氰酸酯（PITC）法：第61頁(yè)，講稿共69頁(yè)，2023年5月2日，星期三此反應(yīng)可循環(huán)進(jìn)行進(jìn)行n輪反應(yīng)，可測(cè)出n個(gè)殘基順序一次：60－70個(gè)殘基的肽段順序第