生物芯片分類及應用

關于生物芯片分類及應用第1頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三2（一）、兩個概念生物芯片

主要指通過平面微細加工技術在固體芯片表面構建的微流體分析單元和系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質(zhì)、核酸以及其它生物組分的準確、快速、大信息量的檢測?；蛐酒夹g是通過微陣列技術,將高密度DNA片段陣列通過高速機器人以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標記的DNA探針，借助堿基互補雜交原理，進行大量的基因表達及監(jiān)測等方面研究的最新革命性技術。第2頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三3微陣列芯片（Microarray）微型實驗室芯片(Lab-on-a-chip)液體芯片(Liquichip)（二）、生物芯片分類及應用第3頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三4Lab-on-a-chip微型實驗室芯片是通過在芯片上刻成微流路徑從而將涉及生物檢測的主要步驟—樣品準備/生化反應/結果檢測—整合在一張芯片上。第4頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三5第5頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三6第6頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三7LiquichipBead,Capturemolecule,Analyte,Reportermolecule是構成liquichip的4個主要部分。Bead上帶有兩種熒光，根據(jù)這兩種熒光的比例可以將bead分為多種。目前已有48種，正在開發(fā)中。Capturemolecule:作用相當于探針，能特異性的與被檢測物結合。Analyte:樣品中被檢測的成分。Reportermolecule:帶有熒光的報告分子，能特異性的與被檢測物結合。第7頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三8Liquichip反應的一般步驟：1.先將capturemolecule結合在bead上，2.將這種標記了的bead與樣品反應。Capturemolecule可以與相應的analyte特異性的結合，3.此時再加入熒光標記的，特異結合analyte的reportermolecule。4.檢測：用liquichipworkstation進行檢測。原理是同時對bead和reportermolecule上的熒光進行檢測。從而確定被結合的analyte的種類和數(shù)量。

第8頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三9Liquichip技術特點描述1．基于bead的這種固相反應技術，具有靈敏度高、信號強度高、靈活性好、所需樣品量少的特點。2．與傳統(tǒng)的蛋白芯片相比，有兩大優(yōu)勢，反應速度更快，靈活性更好。3．由于檢測方法的特點，在大部分的實驗過程中，都不需要洗脫步驟，省時，且不會破壞反應的動態(tài)平衡。4．有配套的蛋白表達和純化體系。（his-tag）

第9頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三10Lquichip應用領域：蛋白質(zhì)定量蛋白質(zhì)功能研究蛋白表達譜分析。

蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與核酸相互作用的研究。包括：免疫分析、酶分析、受體-配基分析、蛋白質(zhì)核酸相互作用分析分析。

第10頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三11微陣列芯片蛋白芯片基因芯片

第11頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三12蛋白芯片(ProteinChips)高通量微陣列蛋白分析方法利用抗體抗原結合原理，采用化學發(fā)光或熒光檢測

標記抗體或抗原，來檢測抗原或抗體。第12頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三13蛋白芯片應用免疫學分析

蛋白與蛋白之間相互作用

DNA與蛋白質(zhì)分子相互作用第13頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三14基因芯片基因芯片是通過微陣列技術,將高密度DNA片段陣列通過高速機器人以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標記的DNA探針，借助堿基互補雜交原理，進行大量的基因表達及監(jiān)測等方面研究的最新革命性技術。微陣列技術巨大優(yōu)勢在于它可以并行地宏量獲取生物信息，借助此技術發(fā)展的生物芯片則提供了以核酸雜交為基礎的基因水平的表達監(jiān)控，多態(tài)性研究和基因分型。從而使我們對基因表達調(diào)控有更深入的了解。第14頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三15基因芯片發(fā)展歷史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray第15頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三16基因芯片

按內(nèi)涵劃分：

cDNA芯片

Oligo芯片:25mer(affymetrix),70mer(Operon)，80mer（Clontech）,

按功能劃分：

基因組芯片：

檢測某一基因是否存在，若存在，拷貝數(shù)是多少。探針是DNA.

表達譜芯片：確定基因表達的途徑與表達產(chǎn)物。探針是RNA或cDNA

測序芯片：通過探針與微陣列的配對分析獲得探針的序列結果。第16頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三17基因芯片應用基因表達檢測多態(tài)性分析遺傳圖譜定位基因分型通過雜交反應測定序列第17頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三18基因芯片應用領域遺傳疾病研究癌癥家系遺傳疾病普通基因突變疾病感染性疾病藥物篩選動物植物遺傳篩選育種

個人基因身份證環(huán)境監(jiān)測第18頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三19（三）、生物芯片應用優(yōu)勢高通量平行分析樣品自動化程度高省時省力所需樣品試劑少保護環(huán)境成本低第19頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三20生物芯片應用優(yōu)勢生物信息數(shù)據(jù)累積為生物信息公共數(shù)據(jù)庫添加更多數(shù)據(jù)有利于研究基因序列與生物表型之間的關系有助于理解疾病發(fā)生的機制第20頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三21二、生物芯片制作技術介紹第21頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三22生物芯片制作方法分類第22頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三23

原位合成

(InSituSynthesis)化學合成原子印章原位光刻合成第23頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三24原位光刻合成美國著名的Affymetrix公司率先開發(fā)的寡聚核苷酸原位光刻專利技術，是生產(chǎn)高密度寡核苷酸基因芯片的核心關鍵技術。第24頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三25

原位光刻合成原理Lightdirectedoligonucleotidesynthesis.Asolidsupportisderivatizedwithacovalentlinkermoleculeterminatedwithaphotolabileprotectinggroup.Lightisdirectedthroughamasktodeprotectandactivateselectedsites,andprotectednucleotidescoupletotheactivatedsites.Theprocessisrepeated,activatingdifferentsetsofsitesandcouplingdifferentbasesallowingarbitraryDNAprobestobeconstructedateachsite.第25頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三26預先合成后點樣

(off-chipsynthesis)接觸式點樣非接觸式點樣第26頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三27基因芯片點樣的方式接觸式點樣---適合于DNA芯片的制作即點樣針直接與固相支持物表面接觸，將DNA樣品留在固相支持物上第27頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三28接觸式點樣Best!第28頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三29ArrayItChipMakerPins帶有細槽的不銹鋼針尖載樣能力:200to600nL點樣體積:250pLto2.5nL(pinsize)點樣直徑:100μmto500μm(pinsize)DippingofpinforsamplepickupTouchingofslidewithpintoleavespotControlprintvolumewithpinsize第29頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三30StealthandChipmakerPin(TeleChem)第30頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三31Chipmaker點樣技術第31頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三32StealthPins第32頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三33CatalogNumberSpotDiameter(μm)Uptakevolume(μl)DeliveryVolume(nl)Minimumspotspacing(μm)Maximumsubgridperpin(spots)Density(spots/cm2)MaximumnumberOfspots(18mm×72mm)SMP390-1000.250.612036*366,35082,944SMP4120-1300.251.016028*283,84250,176SMP5150-1600.251.320022*222,37230,967SMP6180-1900.251.524018*181,58820,736SMP7200-2200.271.726016*161,25416,384SMP8210-2300.281.827516*161,25416,384SMP9260-2900.282.034012*127069,216SMP10300-3300.292.340010*104906,400第33頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三34TeleChem公司點樣針技術不斷發(fā)展的專利針技術共有30種針供選擇與斯坦福大學共同發(fā)展專利pin,帶樣穩(wěn)定，樣品利用率高單次帶樣可連續(xù)點樣達200--1500次特殊不銹鋼材料，適用于各種溶液實際點樣直徑75--250um,可根據(jù)不同樣品選擇相應pin相當容易更換pin和pinhead以適應不同需要第34頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三35基因芯片點樣的方式非接觸式點樣---適合于蛋白芯片的制作

它是以電磁閥或壓電原理將樣品直接噴至固相支持物表面第35頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三36非接觸式噴點技術ThermalSolenoid螺線管PiezoelectricDP第36頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三37Synquad：通過高分辨率注射器泵和微螺線管閥門有機結合起來精確控制滴液

Piezoelectric：用壓電晶體將液體從孔中噴出的壓電技術，兩個壓電晶體同時加脈沖通電觸發(fā)這兩個壓電晶體往噴管中間變形擠壓噴管側壁，噴管出現(xiàn)收縮壓迫液體從噴嘴噴出。

DP第37頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三38非接觸式點樣：

synQUADTechnology第38頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三39??AspirateandPrintforMakingArrays第39頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三40CharacteristicsofsynQUADTechnologyWidedispenserangeLownanolitertohighmicroliterExcellentlinearityPreciseandaccurateCV’stypicallylessthan10%Precisionlessthan5%Non-contactdispensemechanismEasiermechanicalalignment(384,1536,…)“On-the-fly”printingpossibleCapableofdispensingontomembranesorslidesMultipleliquidhandlingmodesAspirate/DispenseContinuousReagentDispensing第40頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三41synQUADvsPiezoelectricPrintingsynQUAD/nQUADPatentedbyCartesianUsescommerciallyavailablecomponentsRobustandreliabledeliverymechanismLownanolitertolowmicroliterdispensevolumemaximumdensity:200to400spots/cm2PiezoelectricAbbottholdskeypatentsontechnologyDispensesusceptibletoairbubblesMid-picoliterdispensevolume~2500spots/cm2第41頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三42三、

生物芯片檢測系統(tǒng)CCD掃描儀

非共聚焦激光掃描儀激光共聚焦掃描儀第42頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三43數(shù)值孔徑與采光效率NA0.3NA0.8NA=sin(),whereisthe?angleofthecone第43頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三44激光共聚焦（聚焦）Thefluorescencesourceisattheobjectivelens’focusLightgoesthroughthepinholetothedetector第44頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三45激光共聚焦（非聚焦）Fluorescencesourcebelowfocus(e.g.outoffocus)Outoffocuslightismostlyblockedatthepinhole第45頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三46ConfocalArtifactRejection

NoPinholeWithPinholeDustartifactsreducedbyatleastafactorof10第46頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三47CCDCameraSystemsAdvantages:FewmovingpartsFastscanningofbrightsamplesDisadvantages:NAlimitedtoabout0.40:LessappropriatefordimsamplesOpticalscattercanlimitperformanceNeedto“stitch”togetherlargeimagesConfocalLaserScannersAdvantagesSmalldepthoffocusreducesartifactshighlightcollectionefficiency.PMTdetectorshavethehighestsensitivityinthevisiblerange第47頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三48DNAscopeLM+

激光共聚焦芯片掃描儀第48頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三49xxyzxMACROscope?Filters第49頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三50HowtheScanSystemWorksF-thetaTelecentricScanSystemSampleScanningMirrorLaserScanLensBAC第50頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三51HowtoscanawholesampleHomeSensorScanningMirrorSampleLaserScanLens第51頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三52DNAscopeLM+優(yōu)點

共聚焦面積寬:20mm70mm可以掃描多種介質(zhì)(ImagesbothGlassSlideMicroarraysandCLONDIAGATtubes)背景噪聲低，信噪比高全自動成像，分析結果Smallfootprint(W20cmxL30cmxH20cm)第52頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三53

ImagingArraysBothDry&WetDryPBSbufferCy3Cy5Cy3andCy5labeledproteindottedonglasssubstrateandimagedat5micronresolutioninbothdryandwetformats第53頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三54Tube1Tube2Cy3ImagesoftwoClondiagArrayTubes第54頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三55四、

生物芯片技術思路的比較第55頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三56ComparisonofDNAChipTechnologies

SensitivityofDNAchipbasedassaysisafunctionof:ProbeandtargetDNA/RNA(Complexity)Chipsurface(autofluorescence&non-spec.bkg)Attachmentchemistry/methodology(hyb.efficiency&crosshyb.)Hybridizationefficiency(lotsoffactors)Detectiontechnology(signaltype,efficiency,noise)

Oligo-Chip cDNA-Chip GenomicChip20nor80n<2,000n>50,000n sequencingexpressionexpressiongenomicanalysis第56頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三57cDNA芯片的缺點由于不同的基因長短不同，Tm值各異，成千上萬的基因在同一張芯片上雜交，使得雜交條件很難同一。同一個體中總是存在一些基因家族的同源序列，加上有的物種存在基因重疊序列的相互干擾，使得傳統(tǒng)的cDNA芯片的分辨能力受到限制，結果的準確性也受到影響。有些組織中在DNA雙鏈中的無意義鏈中存在重疊的基因；而且不同RNA的剪切方式等基因表達方式很難用cDNA芯片來區(qū)分。PCR產(chǎn)物是結合穩(wěn)定的DNA雙鏈，加入探針后在雜交中必然存在競爭性抑制，影響探針和模板的結合能力和穩(wěn)定性，進一步影響cDNA芯片的分辨能力和結果的可信度，這對于低豐度的基因影響尤為明顯。PCR產(chǎn)物濃度不均一也可能導致錯誤的結論。

第57頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三58寡核苷酸芯片比cDNA芯片的優(yōu)點

探針序列經(jīng)過系統(tǒng)優(yōu)化，減少非特異雜交，能有效區(qū)分有同源序列的基因；減少二級結構及其對雜交結果的影響

雜交溫度均一，提高雜交效率

；合成產(chǎn)物濃度均一，避免因樣品濃度差異而造成點樣量差異；可以設計檢測不同剪切方式的基因；

無需擴增，防止擴增失敗影響實驗。第58頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三59預合成后點樣系統(tǒng)的綜合成本

－cDNA芯片方法/步驟

試劑/儀器（萬）

人員（人）

耗時（月）

構建或購買基因文庫

1-31-2

3-6

PCR引物設計與合成55-65萬

（2000個片段）1

3PCR產(chǎn)物純化及定量1.2/20

（2000個片段1

2點樣

點樣儀60萬

1

3天

雜交

0.3萬試劑1

2掃描

掃描儀60萬

1

1-2合計

197.5

–209.56-7

11-15

第59頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三60預合成后點樣系統(tǒng)的綜合成本

－自己合成寡聚核苷酸芯片方法/步驟試劑/儀器（萬）人員（人）耗時（月）寡聚核苷酸的篩選及合成(2000個基因)200（每個基因用1個70堿基的寡核苷酸片段代替，合成1個堿基14元人民幣計）。1(寡核苷酸片段的篩選，還需專業(yè)的軟件)3-4個月，如購置DNA合成儀，成本？，但時間較長點樣點樣儀60萬11個月

雜交0.3萬試劑12個月掃描掃描儀60萬11-2個月總計320.3萬47-9第60頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三61預合成后點樣系統(tǒng)的綜合成本

－應用Operon探針寡聚核苷酸芯片方法/步驟試劑/儀器（萬）人員（人）耗時（月）探針100點樣60（點樣儀）1

1

雜交0.3（試劑）1

2掃描60（掃描儀）1

1-2總計220.334-5第61頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三62Affymetrix技術平臺綜合成本芯片２０萬雜交６小時洗滌４小時掃描４分鐘合計220萬１〈１２小時第62頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三63總結采用Affymetrix公司的生物芯片系統(tǒng)平臺比較適合于實力雄厚的科研實驗室，可以在最短的時間內(nèi)盡快獲得精確可靠的并且可能是前人未曾獲得的實驗結果，并可在國際權威雜志上獲發(fā)表，盡快在相關研究領域在國際領域占領一席之地。

第63頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三64總結采用合成后點樣的生物芯片平臺比較適合于目標定位于研發(fā)、生產(chǎn)的實驗室及生物公司。雖然購買芯片點樣掃描系統(tǒng)的經(jīng)費看起來比購買Affymetrix系統(tǒng)的費用要低，研發(fā)的方向可以結合實驗室的研究特點，比較靈活，但前期研究需要投入較大的人力、物力和時間，綜合成本并不低，而且獲得的芯片信息量小，可靠性較低，使用該系統(tǒng)生產(chǎn)的芯片為材料進行的研究一般為驗證性工作，且因為材料的可靠性低，很難在國際權威雜志上獲得認可。目前開發(fā)生產(chǎn)的生物芯片尚無獲得醫(yī)療許可的產(chǎn)品。第64頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三65五、

生物芯片制作所需耗材第65頁，講稿共73頁，2023年5月2日，星期三66

MicroarrayingAccessories（芯片配件）PinsandPrintheadsOmniGridSlidesandReagentsOmniGridEpoxy(環(huán)氧基修飾)OmniGridAmine(氨基修飾)OmniGridAldehyde(醛基修飾)CompletelineofassociatedreagentsHybridizationChambersHybChamber