質(zhì)粒提取定量與酶切鑒定

質(zhì)粒DNA的提取、定量

與酶切鑒定ExtractionandIdentificationofPlasmidDNA實(shí)驗(yàn)流程圖一、堿裂解法提取質(zhì)粒三、質(zhì)粒酶切二、質(zhì)粒定量四、酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測最后做

掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的方法掌握紫外吸收測定DNA的方法了解質(zhì)粒酶切鑒定原理掌握瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)材料大腸桿菌DH5a菌株pMD18-T載體易瑞質(zhì)粒小量提取試劑盒TakaraEcoRI限制性內(nèi)切酶TakaraHindIII限制性內(nèi)切酶Takara10×M酶切緩沖液BioWest電泳瓊脂糖干粉0.5×TBE核酸電泳緩沖液EB核酸熒光染料Takara6×電泳上樣緩沖液實(shí)驗(yàn)儀器微量移液器離心機(jī)恒溫水浴箱紫外檢測儀電泳儀水平電泳槽獨(dú)立于細(xì)菌染色體以外，能獨(dú)立自主復(fù)制的閉合環(huán)狀DNA分子基因工程常采用的載體一、堿裂解法提取質(zhì)粒DNA堿裂解法；煮沸裂解；羥基磷灰石柱層析法；質(zhì)粒DNA釋放法；酸酚法等質(zhì)粒提取方法：堿裂解法基本原理

基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。染色體DNA：氫鍵斷裂，變性。質(zhì)粒DNA：大部分氫鍵斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離。（不完全變性）質(zhì)粒DNA：復(fù)性，溶于溶液中染色體DNA：不能復(fù)性；形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。pH=12.6（堿性）NaAc溶液（pH4.8）pH=中性染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來離心pM圈D1乓8-泊T溶液S1（細(xì)辣菌懸塑浮液炭）裂解箭液S2中和愚液S3洗滌女液W洗脫向液RN那as茶eA(眠10仙0m仰g/憂ml尸)DN判A吸附沾柱試劑嚴(yán)盒的樓組成脾：溶液S1：50mm規(guī)ol/L葡萄泳糖10mm古ol/LED色TA25mm逮ol/LTr思is私-H悠Cl(p派H贊8.落0)2毫克/毫升泥溶壞菌酶裂解挑液S2：20獅0mm引ol/LNa圓OH1%釣S諒DS中和廢液S3：3鮮mo裕l/辛LNa劍Ac(p余H4呀.8摟)溶液1,取1.釘5m呼l培養(yǎng)怒物加加入Ep貪pe暴nd襖or持f管中逢，室狹溫離腔心12事00同0r教pm承×1牲mi倦n，棄葵上清包，將精離心引管倒蜜置，茫使液咽體盡棋可能償流盡膠。2,加入25菠0μ馳l溶液S1中，哪旋渦泛振蕩脂，使米細(xì)菌陰沉淀便分散海，徹曾底懸跪浮。3,加入25天0μ指l裂解菜液S2，顛賓倒4～6次混火勻（不要條劇烈僵振蕩），閥室溫深靜置3m押in（不爪超過5m子in）。4,加入35目0μ級l中和越液S3，立注即溫晉和顛掌倒6~袍8次混狠勻，耀至出晚現(xiàn)白廉色絮夢狀沉賣淀。5，室旬溫12纏00蒙0r蹈pm離心10夠mi闊n。6,分次盜小心牛取上賺清液湖轉(zhuǎn)至漢吸附戒柱中撈（帶較收集贏管）臭，每殺次60奇0μ杜l，室踏溫12誦00每0r屆pm離心30販s，棄肥濾液屢，將還吸附肢柱重葛新放瞧回收督集管鬧中。7,向吸亞附柱魄中加幼入60草0μ粱l洗滌娘液W，12晃00川0r舍pm離心30漫s，棄味濾液侵。8,重復(fù)銹步驟7一次樹。9,空柱10為00叛0r除pm離心2m度in。10奧,取出窄吸附聰柱，峽放入累一個(gè)浮干凈漆的離貸心管肚中，錘在吸包附膜毛的中子間加50餃μl典5乳6℃預(yù)吉熱的際洗脫紅液，傲室溫路放置1m奪in，12棄00所0r予pm離心1m險(xiǎn)in，收喜集洗須脫液恒（即嫌純化靈的質(zhì)蒙粒DN賴A），-2尊0℃保存界備用謙。實(shí)驗(yàn)賴流程1.筒5m靈L菌液12榨00山0r筍pm1思mi彩n菌體宗沉淀溶液S125旁0μ糠l劇烈晝震蕩裂解信液S225寧0μ絲式l顛倒鋤混勻4-王6次中和輔液S335撇0μ戴l溫和娛地顛倒品混勻6-深8次12，00納0r茄pm10麻m己in室溫捎靜置3~民5m同in至出月現(xiàn)白汪色絮喚狀沉蘿淀取60速0μ搞l上清彈至吸妨附柱默管12，00梯0r淘pm30底s12，00翅0r猜pm30貸s洗滌撫液W60商0μ仔l(wèi)12，00姑0r某pm30找s12，00痕0r次pm2上mi釋n取吸市附柱歪至另一旗新EP管洗脫既液50進(jìn)μl12，00享0r里pm1包mi揭n室溫咽靜置1m水in棄濾尚液空柱收集泛洗脫取液備悉用洗滌分液W60屠0μ約l棄濾葡液棄濾拆液2.懸浮蹄細(xì)胞1.收集翁細(xì)胞3.裂解冒細(xì)胞4.中和6.洗柱7.洗脫5.過柱匙分離加入難洗脫掏液加入寨洗滌岸液W二、贊質(zhì)粒DN筒A定量偷測定利用引核酸吳在26偏0n鹿m處有承紫外舌吸收休的特鏈性基本桂原理紫外章分光狠光度笛計(jì)操作壯步驟取5l提取丈的質(zhì)侄粒DN耍A，加固入95l蒸餾布水混合才均勻3.用紫切外分萬光光宰度計(jì)蠶測定A26志0DN宋A或RN趟A的定城量A26租0=1火.0相當(dāng)即于50μg/等ml雙鏈DN殘A40μg/虜ml單鏈DN眠A（或RN怎A）20μg/伴ml寡核霉苷酸紫外難光吸榨收法：DN瞎A純品:OD26慰0/O年D28襯0=健1.籠8RN擇A純品:OD26膜0/O附D28籠0=笑2.汪0DN踢A或RN漆A的純賀度判匯定三、對質(zhì)粒DN侮A的酶憑切分槽析質(zhì)粒DN脹A:～3勢kb載體:落pM擺D1返8-兩T2.戶7k烈b基因:植CH兵D51.刺4騎kb限制蘭酶特品異性汗地結(jié)缺合于廉一段惕被稱臟為限制滑酶識螺別序釋列的特年殊DN磨A序列糕之內(nèi)隸或其瞎附近途的特異貿(mào)位點(diǎn)上，牛并在塵此切割瓶雙鏈DN阻A。分子炎克隆同中常恒用的愉為II型限范制酶燒，其寄識別瞇位點(diǎn)瞞長度覽為4～6個(gè)核區(qū)苷酸段的反向農(nóng)重復(fù)熊序列。限制冷性內(nèi)鍋切酶GGATCCCCTAGGEc桃oRⅠ和Hi遠(yuǎn)nd督Ⅲ的識糊別序恰列和疤切口蝴是：Ec縱oRⅠ：G↓靠AA哨TT漂CHi講nd俯Ⅲ：A↓張AG序CT肥TpM紋D1桐8-件T反應(yīng)物

體積（μl)10×M酶切緩沖液2質(zhì)粒DNA10HindIII1EcoRI1H2O

6在一筆個(gè)潔勤凈的1.奇5御ml離心豈管中驕混勻戒下列舟反應(yīng)仙物：混合爛后37荷℃水浴1～2h質(zhì)粒DN晶A的酶巴切分柏析操觀作1234影響歐酶切永反應(yīng)濫的因恨素底物DN潔A的純折度反應(yīng)罩系統(tǒng)么：(反應(yīng)旦緩沖捉液)反應(yīng)今體積尾：甘油未濃度<5吵%保溫文時(shí)間棟與溫糾度四、擋瓊脂床糖凝就膠電粉泳電泳棗：帶電踏粒子島在電恢場中葬泳動(dòng)養(yǎng)的現(xiàn)芬象影響疫遷移洪率的雞因素耗？電場樣品征：大小貢（分惠子量鴨）形狀摟（構(gòu)絡(luò)型）電荷共價(jià)朽閉環(huán)萍超螺黑旋DN性A＞線性DN濫A＞開階環(huán)的左雙鏈目環(huán)狀DN好A質(zhì)粒DN慎A三種嗎構(gòu)型屬：共價(jià)材閉環(huán)菊超螺之旋線性開環(huán)獄的雙含鏈環(huán)臣狀瓊脂己糖凝夜膠瓊脂棉糖（Ag燙ar猛os賽e）是港一種得多聚摟糖，困由半河乳糖奧及其戒衍生日物構(gòu)情成的宣中性結(jié)物質(zhì)際，不況帶電灑荷。業(yè)瓊脂肆糖透罪明無浪紫外稻吸收，因此汪，目屈前多鼠用瓊凱脂糖介為電昌泳支陪持物舍進(jìn)行螺平板顛電泳臭。膠濃度（％）線性DNA分子大小（kb）0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.4～61.50.2～42.00.1～3本次型電泳稿使用1.先0%瓊脂譜糖凝罰膠瓊脂餡糖凝付膠濃扣度與DN振A分子柜的有魄效分蜂離范域圍瓊脂巧糖凝夏膠的煩制備上樣彼：加樣錄前，批樣品披先與6×上樣孔緩沖腥液混震勻電泳：電壓10漫0v；30勤mi懼n結(jié)果鍬觀察鍬：凝膠斧成像墨儀瓊脂苦糖凝步膠電杠泳操滋作瓊脂浙糖凝唱膠電躺泳1.凝膠禮準(zhǔn)備①役稱1g瓊脂摟糖置凈三角吧瓶中罪，加0.槐5×正TB并E乒10筑0m捆l；②膛微稱波爐貿(mào)加熱鴿大約2分鐘組，熔機(jī)化瓊鬼脂糖誕；2.膠床趁準(zhǔn)備①攝將剪梳子圣垂直木插入誦到膠窗床的滿小凹城槽內(nèi)赴，梳洪齒底蠻端和估床面偏有1m利m的間辦隙；②角將列膠床掉放在心調(diào)整懇好的臺水平者臺上嗽；鋪膠噴：將斬冷卻攤至60綱℃的凝哥膠倒賢入準(zhǔn)渡備好畜的膠碰床內(nèi)森，凝突膠厚牧度約5蒼mm；室溫朱下靜品置凝軋膠固陽化?；饘Ъ饶z量的膠脈床置航于電懇泳槽帝中，載并使樣品行孔位飄于電否場負(fù)帆極；向電參泳槽初中加黎入0.里5×歪TB袋E電泳堆緩沖睜液，交越過謹(jǐn)凝膠吩表面叔即可涉；輕輕道拔出斃固定秀在凝屑膠中步的梳始子；樣品環(huán)準(zhǔn)備被：向盡核酸礦樣品更中加曉入約研為樣緞品體歌積1/閥6的上愚樣緩縱沖液侄，用華加樣疫器輕鼻輕混書勻；上樣嚇：用媽加樣產(chǎn)器吸平取樣展品，丸輕輕阿的加塞入到壩凝膠腔的樣符品孔設(shè)中，加樣條量為6μl；蓋上縮慧電泳杏槽，將接通鞠電源賽，開策始電估泳；電泳柴條件?。弘娎^壓80墊v；時(shí)黑間25～30分鐘霉；電泳諷結(jié)束甜后，襲切斷獨(dú)電源劑，取獄出凝乘膠。電泳肌結(jié)果濾分析貨：紫狐外檢棍測儀趙直接線觀察守電泳初條帶13兆.取出剃凝膠氧，置天于凝膠橡成像提儀中觀搭察結(jié)唯果，賺并拍擇照記嫁錄。瓊脂祝糖凝桿膠電暑泳上作樣1：DN喇A廚Ma義rk提er（5l）2：提嫁取的項(xiàng)質(zhì)粒DN贏A（5l）3：質(zhì)氧粒DN盼A酶切使產(chǎn)物（10l）+-1234每組肥上2個(gè)樣領(lǐng)品DN飼A縱Ma漲rk糖er倡(la降dd交er藏)Lo近ad打in也g治Bu過ff總