生物制品制造新技術(shù)

關(guān)于生物制品制造新技術(shù)第1頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三教學(xué)目的與要求掌握基因工程疫苗的原理，了解基因工程疫苗的概念與進(jìn)展。了解生物技術(shù)診斷制劑，掌握這些生物技術(shù)診斷制劑的原理了解抗體工程的種類。第2頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三Introduction疫苗技術(shù)的3個(gè)階段：第一次革命：經(jīng)典的微生物疫苗時(shí)代：19世紀(jì)到20世紀(jì)第二次革命：20世紀(jì)70年代生物技術(shù)的出現(xiàn)：重組DNA技術(shù)為代表的基因工程疫苗時(shí)代第三次革命：20世紀(jì)90年代的DNA疫苗時(shí)代第3頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三重組DNA技術(shù)產(chǎn)生基因工程疫苗：重組亞單位疫苗、活載體疫苗、基因缺失疫苗和DNA疫苗等疫苗；生物技術(shù)診斷抗原制劑，如基因工程抗原、核酸探針、PCR和基因芯片等的制造新技術(shù)，抗體工程技術(shù)。治療性疫苗、腫瘤疫苗和生理調(diào)控疫苗等。反向遺傳學(xué)疫苗研制途徑。第4頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三第一節(jié)、基因工程疫苗基因工程疫苗：指用重組DNA技術(shù)研制的疫苗。重組亞單位疫苗、活載體苗、基因缺失疫苗，裸露DNA疫苗等。新途徑，新希望，受到重視。第5頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三一、重組亞單位疫苗（recombinantsubunitvaccines)

用DNA重組技術(shù)，將編碼病原微生物保護(hù)性抗原的基因?qū)朐嘶蛘婧思?xì)胞，使其在受體細(xì)胞中高效表達(dá)，分泌保護(hù)性抗原肽鏈。提取保護(hù)性抗原肽鏈，加入佐劑即制成生物制品，叫基因工程重組亞單位疫苗。第6頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三原理選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)PCR擴(kuò)增保護(hù)性抗原的基因重組DNA：把抗原的基因亞克隆到表達(dá)載體重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入系統(tǒng)的宿主細(xì)胞鑒定和選擇表達(dá)所需細(xì)胞培養(yǎng)繁殖制備疫苗第7頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三生產(chǎn)重組亞單位疫苗的表達(dá)系統(tǒng)：原核表達(dá)系統(tǒng)：大腸埃希氏菌（E.coli）和枯草桿菌（Bacillussubtilis）表達(dá)系統(tǒng)。（最常用），其他如：鏈霉菌基因表達(dá)系統(tǒng)等真核表達(dá)系統(tǒng)：如酵母表達(dá)系統(tǒng)；昆蟲基因表達(dá)系統(tǒng)；絲狀真菌基因表達(dá)系統(tǒng)；哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)植物表達(dá)系統(tǒng)參考：基因工程原理。第8頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三重組亞單位疫苗的優(yōu)點(diǎn)：安全性好，無感染，可用于不宜使用活疫苗動(dòng)物，如妊娠動(dòng)物。減少或消除了常規(guī)活疫苗或死疫苗難以避免的熱原、變應(yīng)原、免疫抑制原和其它有害的反應(yīng)原。穩(wěn)定性好，便于保存和運(yùn)輸，可與感染產(chǎn)生的免疫應(yīng)答相區(qū)別，適合疫病的控制和消滅計(jì)劃。成功例案：首次：口蹄疫基因工程亞單位疫苗；人乙型肝炎基因工程亞單位疫苗，廣泛應(yīng)用。預(yù)防仔豬和犢牛下痢的大腸桿菌菌毛基因工程重組亞單位疫苗。第9頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三二、重組活載體疫苗（live,vectoredvaccines)定義：用基因工程技術(shù)將保護(hù)性抗原基因（目的基因）轉(zhuǎn)移到載體中使之表達(dá)的活疫苗。分類：重組載體病毒活疫苗、重組載體細(xì)菌活疫苗細(xì)菌載體，沙門氏菌、大腸桿菌等；病毒載體：痘病毒，腺病毒和皰疹病毒等。例子：國外：腺病毒為載體的乙肝疫苗、以皰疹病毒為載體的新城疫疫苗等。優(yōu)點(diǎn)：活載體疫苗具有傳統(tǒng)疫苗的許多優(yōu)點(diǎn)，而且又為多價(jià)苗和聯(lián)苗的生產(chǎn)開辟了新路，是當(dāng)今與未來疫苗研制與開發(fā)的主要方向之一。

第10頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三(非復(fù)制性疫苗，又稱活-死疫苗：與重組活載體疫苗類似，但載體病毒接種后只產(chǎn)生頓挫感染，不能完成復(fù)制過程，無排毒的隱患，同時(shí)又可表達(dá)目的抗原，產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)。如用金絲雀痘病毒為載體，表達(dá)新城疫病毒HF基因，用于預(yù)防雞的新城疫。)第11頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三重組活載體主要包括病毒、細(xì)菌，詳見表5.1。第12頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三（一）重組載體病毒活疫苗

病毒載體兩種：A：復(fù)制缺陷性載體病毒，只有通過特定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的互補(bǔ)作用或通過輔助病毒疊加感染才能產(chǎn)生傳染性后代；B：具有復(fù)制能力的病毒，如皰疹病毒、腺病毒和痘病毒都可作為外源基因的載體而保持其傳染性。第13頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三例子：利用雞痘病毒為載體，國內(nèi)外已成功表達(dá)了流感病毒、新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒、馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒、狂犬病病毒、傳染性支氣管炎病毒、麻疹病毒、猿猴免疫缺陷病毒、艾美爾球蟲等的保護(hù)性抗原基因，其中部分產(chǎn)品已正式注冊。圖5.1概括了重組病毒活載體構(gòu)建策略與原理。第14頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三第15頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三（二）重組載體細(xì)菌活疫苗

優(yōu)點(diǎn)：細(xì)菌載體本身起佐劑作用，刺激產(chǎn)生強(qiáng)的B細(xì)胞和T細(xì)胞免疫應(yīng)答?？诜抽T氏菌疫苗還能刺激黏膜免疫，如把志賀氏菌、霍亂弧菌和大腸埃希氏菌的抗原基因?qū)肷抽T氏菌表達(dá)。研究少，涉及細(xì)菌多基因，較困難，如細(xì)菌外膜其他結(jié)構(gòu)：黏附分子侵襲蛋白和鞭毛脂多糖等復(fù)雜，如LPS表達(dá)涉及30多個(gè)基因的級聯(lián)反應(yīng)。代表：疫苗株沙門氏菌、李斯特氏菌和卡介苗、痢疾菌等。第16頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三三、基因缺失疫苗（genedeletedvaccines)定義：用基因工程技術(shù)將強(qiáng)毒株毒力相關(guān)基因切除構(gòu)建的活疫苗。該技術(shù)策略如下圖第17頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三基因缺失疫苗優(yōu)點(diǎn)：安全性好、不易返祖；免疫力堅(jiān)實(shí)，免疫期長，適于局部接種，誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜免疫力。例子：如霍亂弧菌苗；大腸桿菌苗；偽狂犬病毒基因缺失疫苗第18頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三四、基因疫苗（geneticvaccines)

包括DNA疫苗和RNA疫苗，由編碼能引起保護(hù)性免疫反應(yīng)的病原體抗原的基因片段和載體構(gòu)建而成。基因疫苗研制的基本步驟是：①目的基因的分析；②選擇合適的表達(dá)載體；③測序確認(rèn)編碼序列；④體外轉(zhuǎn)錄／翻譯驗(yàn)證試驗(yàn)；⑤動(dòng)物試驗(yàn)；⑥結(jié)果評價(jià)等。

顧慮:是否與細(xì)胞染色體組整合，抗DNA免疫反應(yīng)的可能影響；免疫耐受；免疫效力如何進(jìn)一步提高等。第19頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三五、多肽疫苗（peptidevaccines)定義：用化學(xué)合成法或基因工程手段合成病原微生物的保護(hù)性多肽或表位并將其連接到大分子載體上，再加入佐劑制成的疫苗。優(yōu)點(diǎn)：可在同一載體上連接多種保護(hù)性肽鏈或多個(gè)血清型的保護(hù)性抗原肽鏈，一次免疫就可防幾種傳染病。例子：最早報(bào)道（1982)成功的是口蹄疫多肽疫苗，還有乙型肝炎和瘧疾合成肽疫苗。第20頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三六、轉(zhuǎn)基因植物疫苗（transgenicplantvaccine)

又稱為食用疫苗（ediblevaccine）

兩種表達(dá)系統(tǒng)：整合表達(dá)系統(tǒng)，把編碼病原體保護(hù)性抗原基因?qū)胫参锛?xì)胞內(nèi)，并整合到植物細(xì)胞染色體上，整合了外源基因的植物細(xì)胞在一定條件下生長成新的植株。這些植株在生長過程中可表達(dá)出疫苗抗原，并把這種性狀遺傳給子代，形成表達(dá)疫苗的植物品系。瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，利用重組植物病毒為載體，將編碼疫苗抗原的基因插入植物病毒基因組中，再用此重組病毒感染植物，抗原基因隨病毒在植物體內(nèi)復(fù)制、裝配并高效表達(dá)。第21頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三第二節(jié)、生物技術(shù)診斷制劑包括：1、重組表達(dá)抗原(recombinantantigen)2、核酸探針（nucleicacidprobe,geneprobe）、3、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）4、基因芯片（DNAchip）等。

特點(diǎn)：特異性強(qiáng)，可獲得常規(guī)方法無法制備的一些診斷制劑，易于標(biāo)準(zhǔn)化、產(chǎn)業(yè)化。第22頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三一、重組表達(dá)抗原重組表達(dá)抗原：是用DNA重組技術(shù)，將編碼特定抗原的基因插入原核或真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中使其高效表達(dá)，分離純化產(chǎn)物制造成重組表達(dá)抗原。優(yōu)點(diǎn)：高特異性、高純度、均質(zhì)性好、重復(fù)性強(qiáng)、成本較低，可大批量生產(chǎn)等；可獲得常規(guī)方法無法制備的診斷抗原；也可以獲得對人獸共患病特別是高危險(xiǎn)病原體（如免疫缺陷病毒、結(jié)核分枝桿菌、炭疽桿菌等）的診斷抗原。例子：已制備出標(biāo)準(zhǔn)的乙型肝炎各組分診斷抗原。發(fā)展前景看好。第23頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三二、核酸圖譜分析核酸酶切圖譜寡核苷酸指紋圖譜等。核酸電泳圖譜第24頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三（一）核酸電泳圖譜分析指分離純化的核酸，因其相對分子質(zhì)量的差異而在電泳中具有不同的遷移速率并形成不同的帶型。通過帶型異同度的分析可確定生物體間的遺傳關(guān)系（兩種）

1．質(zhì)粒圖譜分析：質(zhì)粒是耐藥性、毒力因子等特殊遺傳特性的載體。多數(shù)細(xì)菌往往含有大小和數(shù)量不等的質(zhì)粒，具有相對穩(wěn)定性，質(zhì)粒圖譜分析是細(xì)菌分型和流行病學(xué)調(diào)查的重要工具，具有診斷價(jià)值。

優(yōu)點(diǎn)：該法簡便、特異、快速、可靠，缺點(diǎn)：對一些無質(zhì)?；蛸|(zhì)粒不穩(wěn)定的菌株，以及質(zhì)粒相對分子質(zhì)量相同而核苷酸序列不同的菌株無分辨能力。第25頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三2.RNA電泳圖譜分析：分節(jié)段RNA病毒的電泳圖譜分析常用。根據(jù)不同RNA片段相對分子質(zhì)量具有一定差異，在PAGE電泳中的遷移速率有所不同，染色后顯示出不同的電泳圖譜，因而可對不同的病毒或相同病毒不同毒株的基因組加以分析比較。第26頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三（二）核酸酶切圖譜分析生物的cDNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的不同片段，瓊脂糖電泳后可形成不同的帶型，即核酸酶切圖譜，又稱DNA指紋圖譜。用相同的限制性內(nèi)切酶消化的DNA所產(chǎn)生片段的異同程度，直接反映生物體間的遺傳關(guān)系。用不同的限制性內(nèi)切酶消化DNA可分析基因間的連鎖關(guān)系。用于比較不同病原體基因組的差異，了解它們之間遺傳關(guān)系。限制性酶切片段長度多態(tài)分析（RFLP）是其中一種。第27頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三（三）寡核苷酸指紋圖譜分析將純化的RNA經(jīng)一種特殊的RNA酶（通常為T1酶）消化后，產(chǎn)生許多理化特性和大小不同的寡核苷酸片段，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠雙相電泳分離后進(jìn)行放射自顯影，形成一類似指紋的圖譜，即寡核苷酸指紋圖譜。用于RNA病毒的研究，如基因組遺傳多樣性研究，同一病毒不同毒株的地理分布、歷史演變和宿主類群關(guān)系的研究，野毒株與疫苗株的比較等。第28頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三三、核酸探針：放射性同位素、地高辛或生物素等標(biāo)記核酸分子或其片段的一條鏈作為核酸探針，與處理樣本中存在的互補(bǔ)鏈結(jié)合為雙鏈，這個(gè)反應(yīng)就稱為核酸雜交或分子雜交。分為DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交、RNA-RNA雜交。根據(jù)方法不同，又分為原位雜交和轉(zhuǎn)印雜交。在轉(zhuǎn)印雜交中，檢測DNA的稱為Southern雜交，檢測RNA稱為Northern雜交。廣泛用于特定基因的檢測和基因轉(zhuǎn)錄活性的研究。第29頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三四、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)PCR技術(shù)是簡便、一快速、特異、敏感的檢測手段，適于檢測不宜分離培養(yǎng)或含量極微的樣品中病原體，或分析不同樣品中基因片段的異同。PCR與酶切圖譜分析和分子雜交技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用可獲得更好的效果。種類：如（RT-PCR)、熒光PCR、巢式PCR、多重PCR、定量PCR等。第30頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三

五、基因芯片DNA芯片（DNAchip),DNA微陣列（DNAmicroarray)、寡核苷酸微芯片（oligonucleotidemicrochip)指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后與待測的標(biāo)記樣品中的基因按堿基配對原理進(jìn)行雜交，再通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行掃描，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號作出比較和檢測。第31頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三20世紀(jì)90年代初，美國Fodor博士提出并研究。用于基因表達(dá)譜分析、新基因的發(fā)現(xiàn)、基因突變與多態(tài)性分析、基因組文庫作圖、疾病的診斷與預(yù)測、藥物篩選，以及司法與刑偵、環(huán)境與食品衛(wèi)生監(jiān)督等。六、其它技術(shù)核苷酸序列分析、多位點(diǎn)酶電泳等。

第32頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三第三節(jié)、抗體工程技術(shù)多克隆抗體

(Polyclonalantibody)一.概念給動(dòng)物接種抗原所獲得的免疫血清或抗血清是多種抗體的混合物,它是由多種抗原決定簇刺激多株B細(xì)胞增殖分化所產(chǎn)生的,稱為多克隆抗體。第33頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三二.多克隆抗體的應(yīng)用免疫學(xué)檢測被動(dòng)免疫治療和緊急預(yù)防三.存在問題特異性差,用于免疫學(xué)檢測容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)

第34頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三單克隆抗體

(Monoclonalantibody,McAb)

一、單抗概念:

通過B細(xì)胞雜交瘤技術(shù),獲得特異性針對某一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆，產(chǎn)生均一性的抗體。

二、B細(xì)胞雜交瘤的類型

小鼠-小鼠大鼠-大鼠小鼠-人人-人

1975年Kohler和Milstein建立體外淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，1984年獲得諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。第35頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三三、單抗與多抗區(qū)別如圖：5.2。第36頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三四、單抗的制備（一）淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)：（lymphocytehybridomatechnology)。將經(jīng)預(yù)定抗原免疫的淋巴細(xì)胞與失去次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT）或胸腺嘧啶核苷激酶(TK）合成能力的骨髓瘤細(xì)胞系細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過培養(yǎng)、篩選或克隆化，獲得既能分泌針對預(yù)定抗原的單抗又有無限制增殖能力的雜交瘤細(xì)胞系。第37頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三（二）雜交瘤技術(shù)的原理

1.親本細(xì)胞的選擇

小鼠骨髓瘤細(xì)胞:次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)缺陷型

免疫脾細(xì)胞:來自經(jīng)抗原免疫的BALB/c小鼠的脾臟（B細(xì)胞）第38頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三2.細(xì)胞融合骨髓瘤細(xì)胞

脾細(xì)胞融合后細(xì)胞的類型:

未融合的脾細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞未融合的瘤細(xì)胞細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞

PEG

第39頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三3雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)

DNA合成的途徑：糖+氨基酸氨基喋呤

(Aminopterin,A)TK核苷酸DNA

胸腺嘧啶核苷TMP(Thymidine,T)

核苷酸前體HGPRT

次黃嘌呤IMP(Hypoxanthine,H)第40頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三融合后細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中存活情況脾細(xì)胞（HGPRT+,TK+,不能長期生長）骨髓瘤細(xì)胞（HGPRT-,TK-，不能生長）雜交瘤細(xì)胞（HGPRT+,TK+

，能夠生長）第41頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三4.雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆化

篩選：免疫熒光ELISA等克隆化：有限稀釋法單個(gè)細(xì)胞顯微操作法軟瓊脂培養(yǎng)法第42頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三5.單克隆抗體的生產(chǎn)

體內(nèi)：BALB/c小鼠體內(nèi)誘發(fā)含有單抗的腹水體外：無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)等6.單克隆抗體的純化

硫酸銨沉淀法離子交換層析

A蛋白-Sepharose親和層析第43頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三（三）操作步驟見下圖：第44頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三1.B細(xì)胞的制備：純Ag免疫小鼠2-3次，間隔2-4周，最后一次免疫結(jié)束后3-4天取其脾臟，制成108/mL的脾細(xì)胞懸液。

2．骨髓瘤細(xì)胞的制備：小鼠骨髓瘤細(xì)胞，如SP2/0或NS-1

具有營養(yǎng)缺陷（缺少次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶），不能在HAT培養(yǎng)基上生長。在10％新生犢牛血清的DMEM中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，細(xì)胞數(shù)達(dá)105-106/mL，即可。第45頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三3．飼養(yǎng)細(xì)胞準(zhǔn)備小鼠胸腺細(xì)胞、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作用：減少培養(yǎng)板對雜交瘤細(xì)胞的毒性，清除一部分死亡的細(xì)胞。在融合前，將飼養(yǎng)細(xì)胞制成所需的濃度加入培養(yǎng)孔中。第46頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三4.HAT選擇培養(yǎng)基

H：次黃嘌呤(hypoxanthine),T：胸腺嘧啶核苷(thymidine)，T、H是DNA旁路合成途徑的原料；

A：氨基喋吟(aminopterin)，DNA合成阻斷劑。在HAT培養(yǎng)基，未融合的骨髓瘤細(xì)胞不能生長；未融合的脾細(xì)胞則在2周內(nèi)自然死亡，只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能在培養(yǎng)基中生長。（見：HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞示意圖）第47頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三第48頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三HAT培養(yǎng)基篩選原理H,次黃嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶DNA內(nèi)源性途徑(主要途徑)

谷氨酰胺or單磷酸尿苷酸二氫葉酸還原酶AHT外源性途徑(旁路途徑)(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)

次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶

(HGPRT

)胸腺嘧啶激酶

(TK)(Thymidinekinase)B淋巴細(xì)胞：HGPRT+，

TK+骨髓瘤細(xì)胞：HGPRT-，

TK-雜交瘤細(xì)胞：HGPRT+，

TK+存活（不可長期存活）死亡外源性途徑(旁路途徑)存活第49頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三5．細(xì)胞融合1）將B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以10:1-1:1混合，2）離心棄上清，然后緩慢加融合劑50％聚乙二醇(PEG4000),3）靜置90S，漸加入HAT培養(yǎng)基，4）分裝培養(yǎng)：分別加入有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板孔中，置5％-10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5d后更換1/2HAT培養(yǎng)基，第10d改用HT培養(yǎng)基，第15d用完全DMEM培養(yǎng)基。

細(xì)胞融合的常用試劑及其配制方法參見表5.3第50頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三第51頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三6．雜交瘤細(xì)胞篩選應(yīng)用ELISA、間接免疫熒光抗體試驗(yàn)檢測各孔中的抗體，篩選陽性孔。7．雜交瘤細(xì)胞的克隆化雜交瘤細(xì)胞陽性孔，盡早克隆化。（保證單個(gè)克隆，防止染色體丟失，而喪失分泌抗體的能力）,克隆3-5次使雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定?？寺』姆椒ㄈ缦拢旱?2頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三(1)有限稀釋法:

將陽性孔的細(xì)胞稀釋成5-10個(gè)細(xì)胞/ml，加入96孔培養(yǎng)板，0.lml/孔，每孔約含一個(gè)細(xì)胞，每天用倒置顯微鏡觀察確證是一個(gè)細(xì)胞生長。

(2)顯微操作法：用有直角彎頭的毛細(xì)吸管，在倒置顯微鏡下將分散在培養(yǎng)皿上的單個(gè)細(xì)胞吸入管內(nèi)，移種到培養(yǎng)板中，即可獲得單個(gè)細(xì)胞形成的克隆。第53頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三(3)軟瓊脂平板法：在45℃水浴中，將飼養(yǎng)細(xì)胞與0.5％瓊脂糖（用DMEM配制）混合，倒入培養(yǎng)皿凝固后作為底層，后將陽性孔細(xì)胞懸于預(yù)熱至45℃的培養(yǎng)基中與等量0.5％瓊脂糖混合，再加于平皿內(nèi)，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，經(jīng)1-2周后可見小白點(diǎn)，即為一個(gè)克隆，自軟瓊脂上吸出移入培養(yǎng)板中培養(yǎng)即得單個(gè)克隆的雜交瘤細(xì)胞。

第54頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三8．雜交瘤細(xì)胞的凍存原始克隆、克隆化后的雜交瘤細(xì)胞，加DMSO，分裝于小安瓶內(nèi)保存于液氮中。9．單抗的生產(chǎn)方法

(1)動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)系統(tǒng)：BALB/c小鼠體內(nèi)誘發(fā)含有單抗的腹水；

(2)細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)系統(tǒng)：無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)等。10.單克隆抗體的純化

硫酸銨沉淀法離子交換層析

A蛋白-Sepharose親和層析第55頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三（一）用作診斷試劑

1.檢測淋巴細(xì)胞表面分子，區(qū)分不同分化階段的淋巴細(xì)胞，鑒別淋巴細(xì)胞。

2.鑒定病原體，準(zhǔn)確診斷傳染病。

3.用于腫瘤的診斷和分型

4.激素類單抗用于測定體內(nèi)激素含量，判斷內(nèi)分泌的功能狀態(tài)

五、單克隆抗體的應(yīng)用（醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用）第56頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三（二）用作研究工具純化抗原分析和探查抗原結(jié)構(gòu)分析抗原決定簇分子的功能（三）用于疾病的治療抗細(xì)胞表面分子單抗，用于移植排斥反應(yīng)的防治抗細(xì)胞因子單抗用于自身免疫性疾病的治療抗腫瘤單抗用于腫瘤的導(dǎo)向治療第57頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三單克隆抗體用于免疫治療存在的問題單克隆抗體的特異性由于腫瘤特異性抗原較少，缺乏對腫瘤有嚴(yán)格特異性的單抗，對正常組織有交叉反應(yīng)異種抗體反應(yīng)鼠源性單抗用于人體，導(dǎo)致異源性超敏反應(yīng)第58頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三一、概念：根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進(jìn)行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體?；蚬こ炭贵w

(Geneticengineeringantibody)第59頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三二、制備過程：

a、獲得抗體基因片段b、將抗體基因片段導(dǎo)入真核細(xì)胞（如雜交瘤細(xì)胞）或原核細(xì)胞（如大腸桿菌），使之表達(dá)有免疫活性的抗體片段。主要包括：嵌合抗體、單鏈抗體、重構(gòu)抗體、人源化抗體、Ig相關(guān)分子、噬菌體抗體、（抗體文庫。）第60頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三三、幾種重要的抗體（一）嵌合抗體（chimericantibody)指在同一抗體分子中含有不同種屬來源抗體片段的抗體，又稱雜種抗體。多為“鼠-人”類型，既抗體的Fab或F(ab)2來源于鼠類，而Fc片段來源于人類。減少了抗體中的鼠源性成分。第61頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三（二）重構(gòu)抗體（reshapingantibody)將鼠抗體的超變區(qū)基因嵌入人抗體Fab骨架區(qū)的編碼基因中，再將此DNA片段與人Ig恒定區(qū)基因相連，然后轉(zhuǎn)染雜交瘤細(xì)胞，使之表達(dá)嵌合的V區(qū)抗體。（即在人抗體可變區(qū)序列內(nèi)嵌入鼠源抗體的高變區(qū)基因序列）第62頁，講稿共71頁，2023年5月2日，星期三（三）單鏈抗體（single-chainantibody)

即FV分子或單鏈抗體蛋白：由VL區(qū)氨基酸序列與VH區(qū)氨基酸序列經(jīng)肽連接物（linker）連接而成。（此外肽連接物還可將藥物、毒素或同位素與單鏈抗體蛋白相融合。）相對分子質(zhì)量小，作為外源性蛋白的免疫原性較低；在血清中比完整的單克隆抗體或F(ab)2片段能更快地被清除；無Fc片段，體內(nèi)應(yīng)用時(shí)可避免非特異性殺傷；能