分子發(fā)光光譜法課件

分子發(fā)光光譜法分子發(fā)光光譜法分子發(fā)光光譜法某些物質(zhì)的分子吸收一定能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，以光輻射的形式從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，這種現(xiàn)象稱(chēng)為分子發(fā)光，在此基礎(chǔ)上建立起來(lái)的分析方法為分子發(fā)光分析法。分子在退激過(guò)程中以光輻射形式釋放能量§5.1概述一、分子發(fā)光分析法及其分類(lèi)2021/2/42某些物質(zhì)的分子吸收一定能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，以光輻射的形式從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，這種現(xiàn)象稱(chēng)為分子發(fā)光，在此基礎(chǔ)上建立起來(lái)的分析方法為分子發(fā)光分析法。較高激發(fā)態(tài)基態(tài)吸收能量受激光輻射退激分子在退激過(guò)程中以光輻射形式釋放能量§5.1概述一、分子發(fā)光分析法及其分類(lèi)2021/2/42根據(jù)分子受激時(shí)所吸收能源及輻射光的機(jī)理不同分為以下幾類(lèi)：光致發(fā)光：以光源來(lái)激發(fā)而發(fā)光化學(xué)發(fā)光：以化學(xué)反應(yīng)能激發(fā)而發(fā)光—化學(xué)發(fā)光分析法電致發(fā)光：以電能來(lái)激發(fā)而發(fā)光—原子發(fā)射光譜法生物發(fā)光：以生物體釋放的能量激發(fā)而發(fā)光熒光—熒光分析法磷光—磷光分析法2021/2/43二、分子熒光分析法的特點(diǎn)1.靈敏度高熒光強(qiáng)度隨激發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)而增強(qiáng)（提高激發(fā)光強(qiáng)度，可提高熒光強(qiáng)度采用高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)可大大提高靈敏度，檢測(cè)限熒光分析法比分光光度法低2~4個(gè)數(shù)量級(jí)激發(fā)發(fā)射熒光強(qiáng)強(qiáng)激發(fā)光物質(zhì)2021/2/442.選擇性好不同的物質(zhì)用不同的光進(jìn)行激發(fā)，選擇不同的激發(fā)光波長(zhǎng)不同的物質(zhì)發(fā)射的熒光不同，選擇不同的檢測(cè)熒光波長(zhǎng)比較容易排除其它物質(zhì)的干擾，選擇性好3.實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單4.待測(cè)樣品用量少；儀器價(jià)格適中；測(cè)定范圍較廣具發(fā)光強(qiáng)度可定量測(cè)定許多痕量的無(wú)機(jī)物和有機(jī)物，廣泛應(yīng)用在生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)及農(nóng)牧產(chǎn)品分析、衛(wèi)生檢疫等領(lǐng)域。熒光法比磷光法應(yīng)用廣泛，不如分光光度法2021/2/45§5.2分子熒光和磷光的基本原理一、熒光和磷光的產(chǎn)生激發(fā)態(tài)分子在躍遷回到基態(tài)的過(guò)程中將多余的能量以光子形式輻射出來(lái)，這種現(xiàn)象稱(chēng)為“發(fā)光”激發(fā)單重態(tài)：分子吸收能量后，在躍遷過(guò)程中不發(fā)生自旋方向的變化。用S0、S1、S2分別表示分子的基態(tài)、第一和第二激發(fā)單重態(tài)。2021/2/46激發(fā)三重態(tài)：分子吸收能量后，在躍遷過(guò)程中伴隨著電子自旋方向的變化。用T1、T2分別表示分子第一和第二激發(fā)三重態(tài)。2021/2/471.振動(dòng)弛豫:它是指在同一電子能級(jí)上，電子由高振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)移至低振動(dòng)能級(jí)的無(wú)輻射躍遷過(guò)程。2.內(nèi)轉(zhuǎn)換:是指兩個(gè)電子能級(jí)非常靠近以致其振動(dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，常發(fā)生電子由高能級(jí)轉(zhuǎn)移至低能級(jí)的無(wú)輻射躍迂過(guò)程。3.系間跨越:不同多重態(tài)間的無(wú)輻射躍遷，同時(shí)伴隨著受激電子自旋狀態(tài)的改變，如S1→T1。4.外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子通過(guò)與溶劑或其他溶質(zhì)分子間的相互作用使能量轉(zhuǎn)換，而使熒光或磷光強(qiáng)度減弱或消失的過(guò)程。這一現(xiàn)象又稱(chēng)為“熄滅”或“淬滅”。2021/2/48S0S0S1S2T1λ2吸光內(nèi)轉(zhuǎn)換系間跨躍λ1吸光λ3熒光外轉(zhuǎn)換λ4磷光振動(dòng)馳豫2021/2/49熒光發(fā)射：當(dāng)分子處在單重態(tài)的最低振動(dòng)能層時(shí)，去激發(fā)過(guò)程是以10-7～10-9s左右的時(shí)間內(nèi)發(fā)射一個(gè)光子回到基態(tài)。磷光發(fā)射：激發(fā)態(tài)分子經(jīng)過(guò)系間跨躍到激發(fā)三重態(tài)后，并經(jīng)過(guò)迅速的振動(dòng)馳豫到達(dá)第一激發(fā)三重態(tài)（T1）的最低振動(dòng)能級(jí)上，從T1態(tài)分子經(jīng)發(fā)射光子返回基態(tài)。磷光的壽命比熒光的要長(zhǎng)得多2021/2/410從圖中看出磷＞熒＞

激*易產(chǎn)生熒光

n*易產(chǎn)生磷光2021/2/411二、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜固定熒光的最大發(fā)射波長(zhǎng)，然后改變激發(fā)光的波長(zhǎng)，根據(jù)所測(cè)得的熒光強(qiáng)度與激發(fā)光波長(zhǎng)的關(guān)系作圖，得到激發(fā)光譜曲線。選擇最大激發(fā)波長(zhǎng)作為激發(fā)光波長(zhǎng)，然后測(cè)定不同發(fā)射波長(zhǎng)時(shí)所發(fā)射的熒光或磷光強(qiáng)度，得到熒光或磷光光譜曲線。2021/2/4122021/2/413三、分子熒光參數(shù)1．量子產(chǎn)率又稱(chēng)熒光效率物質(zhì)分子的熒光產(chǎn)率必然由激發(fā)態(tài)分子之活化過(guò)程的各個(gè)相對(duì)速率決定：2021/2/4142．熒光壽命熒光壽命是指停止激發(fā)之后，熒光強(qiáng)度降到最大強(qiáng)度的1/e所需要的時(shí)間，常用τ表示。I0，It分別表示在時(shí)間0和t時(shí)的熒光強(qiáng)度。利用熒光壽命，可以進(jìn)行熒光混合物分析。2021/2/415物質(zhì)只有吸收了紫外可見(jiàn)光，產(chǎn)生*n*躍遷，產(chǎn)生熒光*與n*躍遷相比，摩爾吸收系數(shù)大，壽命短*躍遷常產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，n*躍遷產(chǎn)生的熒光弱，但可產(chǎn)生系間竄躍，產(chǎn)生更強(qiáng)的磷光一般情況，有機(jī)芳香族化合物及金屬離子配合物是最強(qiáng)最有用的熒光體三、熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系2021/2/416具有共軛體系的芳環(huán)或雜環(huán)化合物，電子共軛程度越大，越易產(chǎn)生熒光;環(huán)越多，共軛程度越大，產(chǎn)生熒光波長(zhǎng)越長(zhǎng)，發(fā)射的熒光強(qiáng)度越強(qiáng)fex/nm

em/nm0.112052780.292863100.46365400苯萘蒽350菲線狀環(huán)結(jié)構(gòu)比非線狀結(jié)構(gòu)的熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)1.共軛體系——有較強(qiáng)的熒光2021/2/417芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)生熒光多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境污染物，可用熒光法測(cè)定3，4-苯并芘是強(qiáng)致癌物ex=386nm

em=430nm2021/2/4182.剛性平面結(jié)構(gòu)———較穩(wěn)定的平面結(jié)構(gòu)具有強(qiáng)熒光的分子多數(shù)有剛性平面結(jié)構(gòu)熒光素：氧橋把兩個(gè)環(huán)固定在一個(gè)平面上，具有平面結(jié)構(gòu)，強(qiáng)熒光物質(zhì)酚酞：無(wú)氧橋把兩個(gè)環(huán)固定，不能很好的共平面，為非熒光物質(zhì)2021/2/419例1，2-二苯乙烯反式：平面構(gòu)型強(qiáng)熒光體順式：非平面構(gòu)型非熒光體2021/2/4203.金屬螯合物的熒光大多數(shù)無(wú)機(jī)鹽類(lèi)金屬離子，不能產(chǎn)生熒光，但某些螯合物都能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光，可用于痕量金屬離子的測(cè)定不少有機(jī)配體是弱熒光體或不發(fā)熒光，但與Mn+形成螯合物后變?yōu)槠矫鏄?gòu)型，就會(huì)使熒光加強(qiáng)或產(chǎn)生熒光例：8-羥基喹啉為弱熒光體，與Mn+—Al3+、Mg2+形成螯合物后，能形成剛性結(jié)構(gòu)，熒光加強(qiáng)2021/2/4214.取代基的類(lèi)型對(duì)熒光物質(zhì)的熒光特征和強(qiáng)度也有很大影響。分成三類(lèi)：（1）增強(qiáng)熒光的取代基——有-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等給電子基團(tuán)由于基團(tuán)的n電子（孤對(duì)電子）的電子云與苯環(huán)上的

軌道平行，共享了共軛電子，擴(kuò)大了共軛體系，使熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)2021/2/422（2）減弱熒光的取代基

——-COOH、-NO2、-COOR、-NO、-SH吸電子基團(tuán),使熒光波長(zhǎng)短移，熒光強(qiáng)度減弱（3）影響不明顯的取代基——-NH3+、-R、-SO3H等(4)芳環(huán)上被F、Cl、Br、I取代后，使系間竄躍加強(qiáng)，磷光增強(qiáng)，熒光減弱。其熒光強(qiáng)度隨鹵素原子量增加而減弱，磷光相應(yīng)增強(qiáng)，這種效應(yīng)為重原子效應(yīng)。(5)取代基位置——對(duì)位、鄰位取代增強(qiáng)熒光，間位取代抑制熒光。2021/2/423四、環(huán)境對(duì)熒光、磷光的影響1.溶劑的影響

同一熒光物質(zhì)在不同的溶劑中可能表現(xiàn)出不同的熒光性質(zhì)，一般來(lái)說(shuō)，溶劑的極性增強(qiáng)，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移，熒光強(qiáng)度增大2.溫度的影響——低溫下測(cè)定，提高靈敏度因?yàn)檩椛滠S遷的速率基本不隨溫度變，而非輻射躍遷隨溫度升高顯著增大。大多數(shù)熒光物質(zhì)都隨溶液溫度升高熒光效率下降，熒光強(qiáng)度減弱。溫度對(duì)磷光影響更大2021/2/4243.pH的影響大多數(shù)含有酸性或堿性基團(tuán)的芳香族化合物的熒光性質(zhì)受溶液pH的影響很大。共軛酸堿對(duì)是具有不同熒光性質(zhì)的兩種型體，具有各自的熒光效率和熒光波長(zhǎng)。例：苯酚離子化后，熒光消失pH≈1有熒光pH≈13無(wú)熒光2021/2/425但兩個(gè)苯環(huán)相連的化合物，又表現(xiàn)出相反的性質(zhì)，分子形式無(wú)熒光，離子化后顯熒光例：—苯酚有熒光無(wú)熒光另外，表面活性劑也會(huì)影響熒光強(qiáng)度和特性。2021/2/4264.熒光猝滅（熒光熄滅）——熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。使熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱(chēng)為熒光猝滅劑(i)碰撞熄滅碰撞熄滅是熒光熄滅的主要原因。它是指處于激發(fā)單重態(tài)的熒光分子M*與熄滅劑Q相互碰撞后，激發(fā)態(tài)分子以無(wú)輻射躍遷的方式返回基態(tài)，產(chǎn)生熄滅作用。碰撞熄滅將隨溫度的升高而增加；將隨溶液黏度的減小而增大。2021/2/427（ⅱ）能量轉(zhuǎn)移它是指處于激發(fā)單重態(tài)的熒光分子M*與熄滅劑相互作用后，發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，使熄滅劑得到激發(fā)，其反應(yīng)如下(ⅲ)組成化合物的熄滅它是指熄滅劑和熒光分子在基態(tài)時(shí)發(fā)生配合反應(yīng)，生成不發(fā)熒光的配合物。2021/2/428(ⅳ)自熄滅和自吸收當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較大時(shí)，常會(huì)發(fā)生自熄滅現(xiàn)象，這可能由于激發(fā)態(tài)分子之間的碰撞引起能量損失。假如熒光物質(zhì)的吸收光譜和發(fā)射光譜有較大的重疊，由熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光，有一部分可能會(huì)被它自身的基態(tài)分子所吸收，這種現(xiàn)象稱(chēng)為自吸收。隨熒光物質(zhì)濃度的增加，自吸收現(xiàn)象將會(huì)加劇。2021/2/429五、熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系用強(qiáng)度為I0的入射光，照射到液池內(nèi)的熒光物質(zhì)時(shí)，產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)度If用儀器測(cè)得，在熒光濃度很稀(A<0.05)時(shí)，熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光強(qiáng)度If與濃度有下面的關(guān)系If=fIa=f（I0-I）Ia為吸收的輻射強(qiáng)度I0為入射光強(qiáng)度熒光池I0IIf熒光強(qiáng)度檢測(cè)器If=f（I0-I010-A）=fI0

（1-10-A）I=I010-A將上式展開(kāi)2021/2/430當(dāng)A﹤0.05時(shí)，方括號(hào)中其它各項(xiàng)與第一項(xiàng)相比可忽略不計(jì)，上式簡(jiǎn)化If=2.3fI0A=2.3fI0bc當(dāng)A﹤0.05時(shí)，If與f、I0、和c有關(guān)，對(duì)一給定物質(zhì)，當(dāng)激發(fā)光波長(zhǎng)和強(qiáng)度一定時(shí)，f、I0、和b為常數(shù)，合并為K

If=KCIp=KC定量分析依據(jù)2021/2/431熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度呈線形關(guān)系，If=KC只有在濃度低時(shí)使用，熒光物質(zhì)測(cè)定的是微量或痕量組分，靈敏度高。濃度高時(shí)，If與C不呈線形關(guān)系，有時(shí)C增大，If反而降低因?yàn)楣絒]中后面影響，有時(shí)發(fā)生熒光猝滅效應(yīng)。2021/2/432（一）熒光分析儀器——主要由光源、單色器、液槽、檢測(cè)器和顯示器組成光源第一單色器液池第二單色器檢測(cè)器放大器及記錄器exem與分光光度計(jì)有兩點(diǎn)不同①兩個(gè)單色器②檢測(cè)器與激發(fā)光互成直角I0§5.3熒光和磷光分析儀2021/2/4331、光源激發(fā)光源一般要求比吸收測(cè)量中的光源有更大的發(fā)射強(qiáng)度；適用波長(zhǎng)范圍寬熒光光度計(jì)中常用高壓汞燈和氙弧燈利用汞蒸氣放電發(fā)光的光源；常用其發(fā)射365nm、405nm、436nm三條譜線以365nm的譜線最強(qiáng)應(yīng)用最廣泛的一種光源，可發(fā)射250~800nm很強(qiáng)的連續(xù)光源2021/2/4342、單色器大多數(shù)熒光光度計(jì)一般采用兩個(gè)光柵單色器，有較高的分辨率，能掃描圖譜，既可獲得激發(fā)光譜，又可獲得熒光光譜第一單色器作用：分離出所需要的激發(fā)光，選擇最佳激發(fā)波長(zhǎng)ex，用此激發(fā)光激發(fā)液池內(nèi)的熒光物質(zhì)ex。第二單色器作用：濾掉一些雜散光和雜質(zhì)所發(fā)射的干擾光，用來(lái)選擇測(cè)定用的熒光波長(zhǎng)em。在選定的em下測(cè)定熒光強(qiáng)度，定量分析。2021/2/4353、樣品池盛放測(cè)定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上邊。4、檢測(cè)器把光信號(hào)轉(zhuǎn)化成電信號(hào),放大,直接轉(zhuǎn)成熒光強(qiáng)度熒光的強(qiáng)度一般較弱，要求檢測(cè)器有較高的靈敏度，熒光光度計(jì)采用光電倍增管。熒光分析比吸收光度法具有高得多的靈敏度，是因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比，提高激發(fā)光強(qiáng)度可大大提高熒光強(qiáng)度2021/2/436（二）磷光分析儀器與熒光分析儀器相似，主要差異如下：1.試樣室試樣需在液氮溫度（77K，-196℃）下測(cè)定低溫磷光（將液池放在盛放液氮的杜瓦瓶?jī)?nèi)）固體表面室溫磷光分析需特制試樣室2.磷光鏡有些物質(zhì)既可產(chǎn)生熒光，又能產(chǎn)生磷光。用機(jī)械切光裝置——磷光鏡區(qū)別熒光和磷光。利用熒光壽命短，磷光壽命長(zhǎng)消除熒光干擾。2021/2/437（一）定量分析方法定量分析依據(jù)If=KCIp=KC1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法——最常用的定量分析方法將已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與試樣在相同條件下處理，配制一系列標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)定它們的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度。以相對(duì)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)§5.4熒光和磷光分析及其應(yīng)用2021/2/4382.熒光猝滅法把熒光猝滅用在定量分析上，具有較高的靈敏度和選擇性若熒光物質(zhì)M與猝滅劑Q生成不發(fā)熒光的基態(tài)配合物MQM+Q=MQ（非熒光物質(zhì)）經(jīng)推導(dǎo)得出：猝滅劑加入前的熒光強(qiáng)度猝滅劑加入后試液的熒光強(qiáng)度常數(shù)猝滅劑濃度I前/I后與C（Q）有線性關(guān)系，可求猝滅劑含量2021/2/439與標(biāo)準(zhǔn)曲線法相似，對(duì)一定濃度的熒光體系，分別加入一系列不同量的猝滅劑Q，配成一個(gè)熒光物質(zhì)—猝滅劑體系，然后在相同條件下測(cè)定它們的熒光強(qiáng)度，得一曲線取相同熒光物質(zhì)CMCMCMCM

…

CM加不同量QCQ0CQ1CQ2CQ3…

CQx(CQ0=0)

測(cè)IfI前I后1I后2I后3

…I后

x計(jì)算I前/I后I前/I后1I前/I后2I前/I后3

…

I前/I后x

CQxCQI前/I后xI前/I后2021/2/4403.比較法——比較簡(jiǎn)單如果試樣數(shù)量不多，可用比較法進(jìn)行測(cè)量配一標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為Cs，Cs與未知液濃度Cx相近，并在相同條件下測(cè)定它們的熒光強(qiáng)度未知液If

x=KCx標(biāo)準(zhǔn)液If

s=KCs比較2021/2/4414.多組分混合物的熒光分析(1)如果兩組分的熒光峰相互不干擾,可直接測(cè)定可分別在各自的熒波長(zhǎng)處測(cè)定,求出它們的含量(2)如果兩組分的熒光峰相互干擾,但激發(fā)光譜有顯著區(qū)別,在某一激發(fā)光下一個(gè)組分產(chǎn)生熒光峰,另一組分不產(chǎn)生熒光;可選用不同的激發(fā)光進(jìn)行測(cè)定2021/2/442Al3+—8-羥基喹啉配合物的氯仿溶液

ex=365nm

em=520nmGa3+—8-羥基喹啉配合物的氯仿溶液

ex=436nm

em=520nm365nm激發(fā)光，Al3+的配合物產(chǎn)生熒光，而Ga3+配合物不產(chǎn)生熒光，無(wú)熒光峰；436nm激發(fā)光，Ga3+的配合物產(chǎn)生熒光，而Al3+配合物不產(chǎn)生熒光，無(wú)熒光峰在365nm條件下激發(fā)，520nm處測(cè)Al3+—8-羥基喹啉配合物，在436nm條件下激發(fā)，520nm處測(cè)Ga3+—8-羥基喹啉配合物例：2021/2/443(3)如果兩組分的熒光光譜和激發(fā)光譜相互干擾利用熒光強(qiáng)度的加和性（F=F1+F2+F3+…），在適宜的熒光波長(zhǎng)處測(cè)定，用聯(lián)立方程來(lái)求解例：硫胺熒CT

ex=385nm

em=435nm

吡啶硫胺熒CP

ex=410nm

em=480nm相互干擾熒光光譜重疊在385或410nm下激發(fā)，在435和480nm下分別測(cè)熒光強(qiáng)度2021/2/444在385或410nm下激發(fā)，在435和480nm下分別測(cè)熒光強(qiáng)度If435/385=26339104CT+210104CPIf480/385=9685104CT+1022104CPIf480/410=2816104CT+1709104CPIf435/410=6419104CT+252104CP硫胺素濃度吡啶硫胺素濃度If=KC——K:純物質(zhì)在選定波長(zhǎng)下測(cè)If,求K385nm激發(fā)或410nm激發(fā)2021/2/445（二）熒光分析法的應(yīng)用熒光分析法具有靈敏度高、取樣量少等優(yōu)點(diǎn)1.無(wú)機(jī)化合物的分析無(wú)機(jī)化合物中，能直接產(chǎn)生熒光并應(yīng)用于測(cè)定的為數(shù)不多，但與有機(jī)化合物生成發(fā)熒光的有機(jī)配合物后，進(jìn)行熒光分析的元素達(dá)70多種，其中較常采用熒光法測(cè)定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素能夠同金屬離子形成熒光配合物的有機(jī)試劑絕大多數(shù)是芳香族化合物，形成五元環(huán)或六元環(huán)的螯合物，分子的剛性平面結(jié)構(gòu)增大，變?yōu)閺?qiáng)熒光體熒光猝滅法也是熒光分析中經(jīng)常采用的方法。可采用熒光猝滅法間接測(cè)定的離子有：F-、S2-、Co2+、Ni2+、Cu2+等2021/2/4462.有機(jī)化合物的分析脂肪族有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，本身能發(fā)熒光的很少，一般需要與某些試劑反應(yīng)后才能進(jìn)行熒光分析芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)熒光；可直接用熒光法測(cè)定。對(duì)于具有致癌活性的多環(huán)芳烴——熒光分析法是最主要的測(cè)定方法2021/2/447為提高測(cè)定的靈敏度，有時(shí)也將芳香族化合物與適當(dāng)試劑反應(yīng)之后進(jìn)行測(cè)定可測(cè)定結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大量有機(jī)物質(zhì)，如：各種維生素、葉綠素、氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和輔酶以及各種藥物、毒物和農(nóng)藥等2021/2/448例：3，4–苯并芘3，4–苯并芘為強(qiáng)致癌物質(zhì)煤炭、石油、天然氣等燃料不完全燃燒以及吸煙、焚燒垃圾都會(huì)產(chǎn)生3，4–苯并芘，汽車(chē)尾氣也是主要來(lái)源食品加工過(guò)程也會(huì)產(chǎn)生3，4–苯并芘，尤其是煙熏、油炸、烘烤食品分析測(cè)定：用環(huán)己烷將3，4–苯并芘從試樣中提取出來(lái)，用堿將提取液的脂肪類(lèi)物質(zhì)皂化，然后用色譜法分離純化，用95%C2H5OH稀釋?zhuān)脽晒夥止夤舛扔?jì)測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量2021/2/449例：VB2——又稱(chēng)核黃素，是一種生長(zhǎng)促進(jìn)劑，常存在于動(dòng)物肝臟、肉類(lèi)、蛋黃、豆類(lèi)、花生、蘑菇和海藻中，VB2易溶于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性溶液。在低濃度情況下，I=KC，I與C呈線性關(guān)系，在pH6~7熒光最強(qiáng)在430~440nm藍(lán)光照射下，發(fā)出綠色熒光，em=535nm下測(cè)I，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定缺VB2會(huì)得口角炎、舌炎、唇炎、脂溢性皮維生素B22021/2/450（三）磷光分析法應(yīng)用能產(chǎn)生磷光的物質(zhì)數(shù)量很少，磷光分析不及熒光分析普遍，但磷光分析法已在藥物分析、臨床及環(huán)境分析領(lǐng)域得到一定的應(yīng)用。低溫磷光分析已應(yīng)用在萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多環(huán)芳烴及含O、S、N的雜環(huán)化合物分析固體表面室溫磷光分析法已成為多環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物的快速、靈敏的分析手段。2021/2/451§5.5化學(xué)發(fā)光分析法一、概述化學(xué)發(fā)光是利用化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的能量，使其中一種產(chǎn)物的分子的電子被激發(fā)成激發(fā)態(tài)分子，當(dāng)其返回基態(tài)時(shí)發(fā)射一定波長(zhǎng)的光而建立的分析方法。化學(xué)發(fā)光與熒光的主要區(qū)別：受激發(fā)時(shí)所需的能量來(lái)源不同，需要化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中所提供的化學(xué)能2021/2/452化學(xué)發(fā)光分析具有以下特點(diǎn)靈敏度高——例：用熒光素酶和三磷酸腺苷ATP的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可測(cè)定低至2×10-17mol·L-1ATP線性范圍寬——一般有5~6個(gè)數(shù)量級(jí)儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低廉分析速度快，易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化局限性：可供發(fā)光用的試劑有限發(fā)光機(jī)理有待進(jìn)一步研究2021/2/453二、化學(xué)發(fā)光分析的基本原理（一）化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的基本條件發(fā)光反應(yīng)必須滿(mǎn)足以下條件1.化學(xué)反應(yīng)必須產(chǎn)生足夠的化學(xué)能化學(xué)發(fā)光基于化學(xué)反應(yīng)提供足夠的能量。在可見(jiàn)光區(qū)觀察化學(xué)發(fā)光，需170~300kJ·mol-1激發(fā)能，具有過(guò)氧化物中間產(chǎn)物的氧化還原反應(yīng)可滿(mǎn)足要求，化學(xué)反應(yīng)多是在有O3、H2O2等參加的高能反應(yīng)中。2.處于激發(fā)態(tài)分子能夠以輻射躍遷的方式返回基態(tài)。2021/2/454（二）化學(xué)發(fā)光效率和發(fā)光強(qiáng)度化學(xué)發(fā)光效率CL激發(fā)態(tài)分子的化學(xué)效率激發(fā)態(tài)分子的發(fā)光效率r取決于發(fā)光所依據(jù)的化學(xué)反應(yīng)本身f與熒光效率的影響因素相同，既取決于發(fā)光體本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，也受環(huán)境的影響2021/2/455化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度具有高效率的化學(xué)發(fā)光是生物體中亦稱(chēng)生物發(fā)光。如：螢火蟲(chóng)發(fā)光反應(yīng)的效率幾乎接近100%。非生物體的化學(xué)發(fā)光效率一般不超過(guò)1%化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度ICL（t）與反應(yīng)速度、化學(xué)發(fā)光效率有如下關(guān)系對(duì)下列化學(xué)發(fā)光反應(yīng)A+B→C*+D

C+hICL隨時(shí)間和反應(yīng)物消耗的變化逐漸減小2021/2/456A+B→C*+DA為待測(cè)物質(zhì)，C為發(fā)光物質(zhì)，當(dāng)反應(yīng)物B的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)過(guò)量于待測(cè)物濃度時(shí)，B的濃度可認(rèn)為是常數(shù)。因此，發(fā)光反應(yīng)可視為一級(jí)反應(yīng)t時(shí)刻的發(fā)光強(qiáng)度與該時(shí)刻的分析物濃度成正比化學(xué)發(fā)光總強(qiáng)度與分析物濃度呈線性關(guān)系。常用發(fā)光總強(qiáng)度來(lái)定量分析發(fā)光總強(qiáng)度2021/2/457三、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類(lèi)型1.液相化學(xué)發(fā)光——研究和應(yīng)用的比較廣泛的有魯米諾（Luminol）光澤精、沒(méi)食子酸、洛粉堿、過(guò)氧草酸鹽等。魯米諾是最常用的發(fā)光試劑，它可以測(cè)定Cl2、HOCl、OCl-、H2O2、O2和NO2，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)時(shí)量子效率為0.01~0.05魯米諾（3–氨基苯二甲酰環(huán)肼）在堿性溶液中和H2O2等氧化劑反應(yīng)生成最大波長(zhǎng)為425nm的光輻射2021/2/458氧化劑425nm反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)能被產(chǎn)物氨基鄰苯二甲酸根吸收，處于激發(fā)狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)發(fā)射熒光可檢測(cè)低至10-9mol·L-1的H2O22021/2/459魯米諾H2O2的化學(xué)反應(yīng)，可以被一些痕量的過(guò)渡金屬元素所催化，使發(fā)出的光大大增強(qiáng)，由此可測(cè)定Co（Ⅱ）,Cu（Ⅱ）,Ni（Ⅱ）,Cr（Ⅲ）