化學(xué)發(fā)光免疫法測(cè)定胰島素的實(shí)驗(yàn)研究

化學(xué)發(fā)光免疫法測(cè)定胰島素的實(shí)驗(yàn)研究【摘要】目的探討測(cè)定胰島素的可靠方法。方法采空腹血不抗凝，離心分離成血清，直接上機(jī)測(cè)定。結(jié)果線性范圍在0～/L；靈敏度：0mIU/L的IRI，其平均光量子數(shù)為3808，/L的IRI，其平均光量子數(shù)為30350，/L的IRI，其平均光量子數(shù)為357399，/L的IRI，其平均光量子數(shù)為684567。特異性：測(cè)定質(zhì)控血清時(shí)，測(cè)定值在靶值的95%～105%范圍內(nèi)。精密度：N=60CV≤5%。結(jié)論化學(xué)發(fā)光免疫法測(cè)定胰島素，靈敏度高，特異性好，精密度高，是一種可靠而穩(wěn)定的檢測(cè)方法。

【關(guān)鍵詞】胰島素；光量子數(shù)；前胰島素原；胰島素原；化學(xué)發(fā)光免疫法

【Abstract】ObjectiveToexploreareliablemethodforthedeterminationofGatherfastingagglutinatingblood,centrifugalizethemrespectivelytogettheserum,whichweredirectlysetoninstrumenttoLinearrang:0～/L，senitivity:themeanquantumof0mIU/LIRI,/LIRI,/LIRIandmIU/LIRIwere3808,30350,357399and:whenthecontrolserumwasdetermined,themeasurevlaluewaswithinthestandarddeviation,95%-105%.Precision:N=60CV≤5%.ConclusionChemiluminescenceisareliable,stablemeasurementmethodfordeterminationofinsulinwithhighsensitivity,precisionandspecificity.

【Keywords】insulin;quantum;preproinsulin;proinsulin;chemiluminescence

胰島素是一種蛋白質(zhì)激素，這是由胰島中的β細(xì)胞所合成、儲(chǔ)存和分泌的。IRI的功能是調(diào)節(jié)血液中葡萄糖的濃度水平。IRI初期是在β細(xì)胞中，以一種大分子量前胰島素原的形式存在。前胰島素原是一條由110氨基酸組成的單鏈前體。前胰島素原被切除掉24個(gè)氨基酸序列后形成胰島素原，胰島素原是胰島素和C-肽的前體［1］。IRI是由兩條氨基酸鏈組成的。最初，IRIA鏈?zhǔn)怯?1個(gè)氨基酸組成，B鏈?zhǔn)怯?0個(gè)氨基酸組成；而C-肽是由31個(gè)氨基酸組成。IRI是隨餐后血液中葡萄糖的濃度高低而產(chǎn)生應(yīng)答的。

IRI水平雖然不是糖尿病患者常規(guī)診斷方法，但是IRI水平的檢測(cè)對(duì)于空腹低血糖患者、普通人群中的胰島素耐受患者、β細(xì)胞分泌功能異?；颊叩囊饬x非常大［2，3］。

1材料與方法

原理IRI的測(cè)定是一種直接化學(xué)發(fā)光技術(shù)和雙抗體兩點(diǎn)夾心免疫分析法相結(jié)合的測(cè)定方法。第一種抗體稱為標(biāo)識(shí)抗體，是由單克隆抗胰島素抗體標(biāo)記吖啶酯形成的；第二種抗體稱為固相化抗體，是由單克隆抗胰島素抗體以共價(jià)鍵的方式與順磁性顆粒相結(jié)合形成的。血清中的胰島素與相應(yīng)抗體發(fā)生免疫反應(yīng)后產(chǎn)生光量子，其光量子數(shù)的多少與血清中胰島素的濃度成正比，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算即可求得血清IRI的濃度水平。

儀器與試劑儀器：BAERACS-180型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀。試劑及標(biāo)準(zhǔn)液由廣州寶迪有限公司提供。

方法取血清于樣品杯中，置全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀上，調(diào)整好檢測(cè)參數(shù)：血清25μl+第一試劑50μl于37℃孵育5min，加第二試劑250μl于37℃孵育，用蒸餾水對(duì)反應(yīng)杯進(jìn)行分離、抽吸、清洗，最后分別加300μl酸試劑和堿試劑到反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行反應(yīng)發(fā)光，讀取光量子數(shù)，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出結(jié)果。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備采用兩點(diǎn)定標(biāo)法，將標(biāo)準(zhǔn)血清/L和/L安放于儀器的定標(biāo)位置上，編入測(cè)定程序，上機(jī)測(cè)定自動(dòng)打印出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2結(jié)果

精密度取混合血清分成兩份，一份當(dāng)天測(cè)定60次，結(jié)果IRI的值為22±/L，其對(duì)應(yīng)的CV值為%；另一份做批間試驗(yàn)，測(cè)定10次，測(cè)定值為21±/L，其對(duì)應(yīng)的CV值為%。

靈敏度0mIU/L的IRI，其平均光量子數(shù)為3808，/L的IRI，其平均光量子數(shù)為30350，/L的IRI，其平均光量子數(shù)為357399，/L的IRI，其平均光量子數(shù)為684567。IRI測(cè)定的范圍為0～/L。

回收試驗(yàn)在IRI為25mIU/L的血清中分別加入濃度為1mg/L的胰島素原、濃度為500μg/L的C-肽、濃度為1mg/L的胃泌素、濃度為1mg/L的胰高血糖素、濃度為1mg/L的胰泌素進(jìn)行回收試驗(yàn),分別測(cè)得其回收率為:%，%，%，%，%。

線性分析對(duì)一份定值血清稀釋不同濃度，觀察測(cè)定體系光量子數(shù)的變化量，即為IRI與光量子數(shù)的關(guān)系。結(jié)果顯示：IRI在本法的測(cè)定范圍是0～/L。當(dāng)IRI大于/L時(shí)，開(kāi)始偏離線性。因此對(duì)濃度高的標(biāo)本必須先進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專(zhuān)缓鬁y(cè)定。

干擾試驗(yàn)當(dāng)溶血、黃疸時(shí),對(duì)結(jié)果干擾甚微。

正常參考值取100份經(jīng)我院體檢合格者的血清，其中男50份，女50份，年齡19～55歲，平均37歲。檢測(cè)結(jié)果IRI：±/L。男女之間差異無(wú)顯著性。

3討論

目前定量測(cè)定IRI的方法不多，過(guò)去一般用放射免疫法，該法測(cè)定步驟繁瑣，為半自動(dòng)化操作，測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)達(dá)3天，測(cè)定范圍窄，且使用試劑具有放射性，對(duì)操作人員造成身體傷害及對(duì)周?chē)纬晌廴尽，F(xiàn)在基本已被化學(xué)發(fā)光免疫法所代替，該法測(cè)定步驟簡(jiǎn)單，為全自動(dòng)化操作，測(cè)定時(shí)間短，全過(guò)程最短為半小時(shí)即可完成，而它使用的試劑安全無(wú)放射性，為一般化學(xué)試劑，對(duì)操作人員無(wú)傷害，對(duì)周?chē)h(huán)境污染甚微。不過(guò)它也有缺點(diǎn)：其試劑為抗體試劑，有效期短，容易失效，定標(biāo)周期短，一般為2周。在試劑的有效期內(nèi)和定標(biāo)周期內(nèi)，對(duì)血清標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果非常準(zhǔn)確可靠。綜上所述，化學(xué)發(fā)光免疫法測(cè)定胰島素是目前首選的方法。

【參考文獻(xiàn)】

1康格非,巫向前.生物化學(xué)和生物化學(xué)檢驗(yàn)，第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2001，256.

2ChevenneD,TrivinF,Porq