第八章合子胚培養(yǎng)

第八章合子胚培育

合子胚培育的見解

1.1植物胚胎培育的見解

植物胚胎培育是指對植物的胚、子房、胚珠和胚乳進(jìn)行離體培育，使其發(fā)育成完滿植株的技術(shù)。當(dāng)前，胚胎培育除了應(yīng)用于育種工作外，還寬泛被用來研究胚胎發(fā)生過程中的生理代謝變化以及有關(guān)影響胚

發(fā)育的內(nèi)外因素等問題。而且，在離體胚培育成功的基礎(chǔ)上，又進(jìn)行了胚乳、胚珠和子房的培育，特別是未受精胚珠或子房培育，為進(jìn)行離體授粉(或試管受精)的研究供給了重要的技術(shù)條件。試管受精技術(shù)使戰(zhàn)勝遠(yuǎn)緣雜交中花粉與柱頭之間的不親和性成為可能。

1.2合子胚培育的見解

合子胚培育是指在無菌條件下分別和培育有性胚，以期獲取可育植株的一種技術(shù)。1904年，Hannig最早在無菌條件下進(jìn)行了離體胚培育實(shí)驗(yàn)，他當(dāng)時所培育的是兩種十字花科植物—辣根菜和蘿卜的成熟胚。在含無機(jī)鹽和蔗糖的半固體培育基上，Hannig成功將胚培育成可移栽的幼苗。隨后，很多研究者從一些植物的成熟種子，特別是從敗育致使種子不能夠萌生的植物中分別種胚，經(jīng)過離體培育獲取植株。依靠合子胚培育技術(shù)，現(xiàn)在已經(jīng)能夠挽救早熟敗育的雜志胚了。

胚培育的種類

離體胚培育可分為幼胚（未成熟胚）培育和成熟胚培育。離體培育中，這兩類胚的成苗路子和所需營養(yǎng)條件也不太同樣。

2.1成熟胚培育

由于成熟胚生長不依靠胚乳的儲蓄營養(yǎng)，只需供給合適的生長條

件及打破休眠，它即可在比較簡單的培育基上萌生生長，形成幼苗。

所以，培育基只需含無機(jī)鹽和糖即可。其他，成熟胚培育技術(shù)也要求

不嚴(yán)，將受精后的果實(shí)或種子(帶種皮)用藥劑進(jìn)行表面消毒，剝?nèi)》N

胚接種于培育基上，在人工控制條件下即可發(fā)育成完滿植株。

2.2幼胚（未成熟胚）培育

幼胚指的是還沒有成熟即發(fā)育初期的胚。它較成熟胚難培育，要求的技術(shù)和條件也較高。幼胚培育時，可能有三種生長方式：一是連續(xù)進(jìn)行正常的胚胎發(fā)育，保持胚性生長，最后形成擁有萌生能力的成熟胚；二是不能夠保持胚性生長，快速萌生為幼苗，這類未經(jīng)達(dá)成正常的

胚胎發(fā)育過程而形成幼苗的現(xiàn)象稱為“早熟萌生”(precociousgermination)。三是形成愈傷組織。由于早熟萌生形成的幼苗經(jīng)?；?/p>

形瘦小，甚至死亡。所以，進(jìn)行幼胚培育時，重點(diǎn)是保持胚性生長。為了保證離體幼胚能沿著胚胎發(fā)生的路子發(fā)育，其對營養(yǎng)的需求較成熟胚復(fù)雜。其他，經(jīng)過培育遠(yuǎn)緣雜交后的幼胚可獲取遠(yuǎn)緣雜種。

合子胚培育方法

3.1資料的選擇與滅菌

由于植物種類及實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌瑯?，幼胚培育對資料的要求也不同樣樣。若是是一般的實(shí)驗(yàn)或示范，最好是先用一種胚易于剝離的植物如大粒種子的豆科和十字花科植物；如希望培育資料的胚發(fā)育時期擁有一致性，應(yīng)選擇開花和結(jié)實(shí)習(xí)慣有規(guī)律的植物，如薺菜擁有總狀花序，各個胚珠處于不同樣的發(fā)育時期，一般沿花序軸由上而下，胚齡漸漸增

加。每個蒴果含20～25個胚珠，且基本處于同一發(fā)育時期；如希望培育某一發(fā)育時期的胚，則須對剛開放的花進(jìn)行人工授粉，并認(rèn)識該植物授粉后的天數(shù)與胚胎發(fā)育的相應(yīng)關(guān)系；如培育遠(yuǎn)緣雜種胚，則必定在其夭折前進(jìn)行。

取回大田或溫室里授粉受精后的植物子房，用70％的酒精進(jìn)行幾秒表面消毒，再用0.1％氯化汞滅菌10-30min，用無菌水沖刷3～

次，即可用于胚的分別和培育。

3.2胚的分別及培育

3.2.1胚的分別

一般來說，在進(jìn)行胚的離體培育時，必定把胚從周圍的組織中剝

離出來。成熟胚只須剖開種子即可剝離，比較簡單。但有些種子種皮

很硬，須先在水中浸泡此后才能剖開。在剝?nèi)”容^小的胚的時候則須

借助解剖鏡，而且在剝離出來后，要立刻轉(zhuǎn)入培育瓶中。

關(guān)于幼胚的剝離，是把滅菌后的資料在無菌條件下切開子房壁，

用鑷子取出胚珠，剝離珠被，取出完滿的幼胚，并置培育基進(jìn)步行培

養(yǎng)。由于植物的種類及發(fā)育時期的不同樣，幼胚分其他技術(shù)和難度也不

同樣(p160～161，薺菜和大麥的幼胚剝離)。

3.2.2胚的培育

關(guān)于成熟胚來說，由于其生長不依靠胚乳的儲蓄營養(yǎng)，只需供給合適的生長條件及打破休眠，它即可在比較簡單的培育基上萌生生

長，形成幼苗。所以，培育基只需含無機(jī)鹽和糖即可。其他，成熟胚培育技術(shù)也要求不嚴(yán)，將受精后的果實(shí)或種子(帶種皮)用藥劑進(jìn)行表

面消毒，剝?nèi)》N胚接種于培育基上，在人工控制條件下即可發(fā)育成完滿植株。

幼胚較成熟胚培育難，要求的技術(shù)和條件也較高。胚胎發(fā)育過程可分為兩個時期：一為異養(yǎng)期(heterotrophyperiod)，即幼胚由胚乳及周圍的組織供給養(yǎng)分；二為自養(yǎng)期(autotrophyperiod)，此時

的胚已能在基本的無機(jī)鹽和蔗糖培育基上生長。胚由異養(yǎng)轉(zhuǎn)人自養(yǎng)是其發(fā)育的重點(diǎn)時期，這個時期出現(xiàn)的早晚因物種而異。在這兩個時期之內(nèi)，培育中的胚對外源營養(yǎng)的要求隨胚齡的增加而漸漸趨向簡單。

在人工培育基上幼齡胚平常很難培育，只管對培育基做了很多改良，胚在發(fā)育的極早時期仍發(fā)生夭折，幼胚很難培育成功。在這類情況下，利用胚乳看護(hù)培育，則可顯然提高幼胚的成活率，由于植物正常的生長發(fā)育中，胚是由牢牢包圍它的胚乳組織供給營養(yǎng)的。如進(jìn)行大麥未成熟胚離體培育時，若是在其周圍培育基上存在來自同一物種的離體胚乳，則對胚的生長有顯然促進(jìn)作用。有時異種胚乳對胚的生長比同種的更加合適，如進(jìn)行谷類胚乳看護(hù)培育時，把大麥的胚移植到小麥胚乳上，其生長優(yōu)于在大麥胚乳上。在大麥×黑麥的屬間雜交中，若把雜種未成熟的胚放在起初培育的大麥胚乳進(jìn)步行培育，可使30％～40％的雜種未成熟胚發(fā)育成苗，而傳統(tǒng)的胚培育法只有1％的成功率。

影響胚培育的因素

4.1培育基

4.1.1無機(jī)鹽

用于胚培育的無機(jī)鹽配方很多，對其中每種成分的作用并無精準(zhǔn)

的談?wù)?。成熟胚培育中，主要采用一些較簡單的培育基，如Tukey、

Randolph、White等。幼胚培育的培育基主要有MS、B5、Nitsch、Rijven、

White、Rangaswang、Norstog等。Monnier(1976)研究了幾種標(biāo)準(zhǔn)的

無機(jī)鹽溶液(包括Knop、Miller、MS等培育基)對薺菜胚培育的作用，

發(fā)現(xiàn)在必然的培育基上，未成熟胚的生長和存活之間其實(shí)不存在有關(guān)性

p165，圖10.6）。如在MS培育基中，未成熟胚的生長最好，但存活率卻低；在Knop培育基中，誠然其毒性小，但胚的生長卻較差。

Monnier經(jīng)過改動MS培育基中每一種鹽分的濃度，配制了一種既有

利于生長、也有利于存活的新培育基。在這類培育基上，胚的生長和

存活都很好，與MS培育基對照，這類培育基中K＋和Ca2＋的水平比較

＋高，而NH4的水平則低(p157表10.3)。

另據(jù)Umbeck和Norstog(1979)報(bào)道，培育基中的NH4＋關(guān)于大麥

—未成熟胚的正常生長和分化是必要的。當(dāng)以N03作為無機(jī)氮的獨(dú)一來

源時，500μm長的大麥胚在培育中只能略有生長，而這主若是由于

細(xì)胞伸長造成的。盾片等的分化則需要有＋的4.3～8.6mmo|／LNH4存在。在曼陀羅和紫花曼陀羅中，對未成熟胚的培育來說，NH4＋或是

必要的，或是一種較好的無機(jī)氮；另一方面，黃麻的胚則絕對需要硝

態(tài)氮。

4.1.2碳水化合物

在離體的成熟胚和未成熟胚培育中，一般都需要有一種合適的碳

源。迄今為止，蔗糖被認(rèn)為是碳水化合物的最好形式，在胚培育中的

應(yīng)用最為寬泛。在胚培育基中加入蔗糖不只是作為一種能源，而且是為了保持合適的浸透壓，后者關(guān)于未成熟胚的培育來說特別重要。最適蔗糖濃度因胚的發(fā)育時期而有所不同樣。成熟胚在含2％蔗糖的培育基中就能很好生長；幼胚則要求較高水平的糖濃度，若是濃度過低，會惹起幼胚過早萌生。這是由于在自然條件下，原胚就是被一種高滲液體包圍著的。適于原胚培育的蔗糖濃度一般為8％～12％。在長久的培育過程中，隨著培育時問的增加，必定把胚轉(zhuǎn)移到蔗糖水平漸漸降低的培育基中。

還有見解認(rèn)為，胚在離體條件下的生長和分化在很大程度上其實(shí)不依靠于浸透壓的大小，而主要取決于某些生長調(diào)治物質(zhì)的存在與否。

如高浸透壓阻攔離體未成熟胚早熟萌生的作用能夠用ABA有效地取代。

4.1.3氨基酸和維生素

在胚培育中加入氨基酸，不論是單調(diào)的仍是復(fù)合的，都能刺激胚

的生長。加單調(diào)氨基酸時，以谷氨酰胺最有效，如500mg／L的谷氨

酰胺可促進(jìn)多栽種物離體胚的培育，1600mg／L的谷氨酰胺能強(qiáng)烈促進(jìn)銀杏胚形成的幼苗生長。

水解酪蛋白(CH)是一種氨基酸復(fù)合物，素來被寬泛用于胚培育。

如水解酪蛋白和酵母提取物對薺菜及棉花心形胚生長有顯然的促進(jìn)

作用，水解酪蛋白是四時橘很小的球形胚(14～28μm×14～28μm)的培育所必要的。

胚對水解酪蛋白的敏感性因物種而異，栽種大麥最適濃度為

500mg／L；毛曼陀羅和曼陀羅的胚在含有400mg／LCH的培育基上長得最好；50mg／LCH能促進(jìn)紫花曼陀羅胚的生長，但100mg／L時則有損害作用。

常用于胚培育的維生素類有硫胺素、吡哆醇、煙酸、泛酸鈣等。

維生素對發(fā)育初期的幼胚培育是必要的，而已萌生生長的胚，因其細(xì)

胞能合成自己需要的維生素，維生素的加入可能對其形態(tài)發(fā)生有控制

作用。所以，最好是只有在經(jīng)過實(shí)考證實(shí)了它們的必要性此后，再在

培育基中加入維生素。硫胺素對植物胚培育的根伸長有促進(jìn)作用，煙

酸、泛酸鈣和生物素則對莖生長的促進(jìn)作用更加顯然。

4.1.4植物生長調(diào)治劑

除了在某些植物中為了打破休眠以外，沒有憑證表示離體的成熟或未成熟胚的正常發(fā)育需要外源生長調(diào)治物質(zhì)。實(shí)質(zhì)上，生長素關(guān)于胚的生長平常表現(xiàn)控制作用。Monnier(1978)建議，在胚培育基中不應(yīng)加入植物激素，免得惹起構(gòu)造異樣。他認(rèn)為胚對大部分生長調(diào)治物質(zhì)都是自主的。在這點(diǎn)上最少對GA3來說已在菜豆上獲取了清楚的證明，其中胚柄能夠知足離體胚對激素的需要。可是，若是為了由胚和胚段引誘愈傷組織，則平常都須在培育基中加入生長素或細(xì)胞分裂素，或二者都加。

在大麥未成熟胚(500m長)培育中，若加入ABA，特別是當(dāng)有NH4+存在的情況下，不單能夠控制由GA3和激動素所促成的早熟萌生，而且能使胚序次進(jìn)行正常的發(fā)育。

4.1.5天然有機(jī)物

正常植物體上，胚的生長受胚乳滋潤，所以，加入一些天然的胚

乳或種子提取物，對離體胚的生長有促進(jìn)作用。20世紀(jì)40年月，Van

Overbeek等使用椰子汁培育曼陀羅的心形胚獲取成功后，人們寬泛

地在胚培育中使用椰子汁。使用多種天然提取物(大麥胚乳、麥芽、

馬鈴薯塊、大豆等提取物)進(jìn)行大麥幼胚(0.5mm胚)培育，只有大麥

胚乳可促進(jìn)其生長，形成幼苗。在其他植物中也發(fā)現(xiàn)近似情況，如玉

米胚乳組織的提取物可促進(jìn)培育的玉米胚生長。Kent和Brink(1947)

報(bào)道，海棗和香蕉的浸提物、小麥面筋水解物、牛奶和番茄汁(TJ)

能夠促進(jìn)大麥未成熟胚的生長和控制它們的早熟萌生。在上述這些物

質(zhì)中以番茄汁收效最好。其他，還發(fā)現(xiàn)蜂王漿對銀杏幼胚正常分化有

促進(jìn)作用，并能減少培育胚的死亡率，控制胚形成愈傷組織。

4.1.6培育基的pH

培育基的pH對胚的培育也有必然的影響。如薺菜胚珠液的pH值約為6.0，而其離體胚在pH值為5.4～7.5的培育基中都能正常生長。對紫花曼陀羅心形初期的胚培育最適pH值在5.0～7.5的范圍內(nèi)。8日齡的水稻胚在pH值5和9時，生長最好。Norstog和Smith(1963)

報(bào)道，培育基的pH值關(guān)于大麥未成熟胚的器官分化是重點(diǎn)因素，最

適值約為4.9。當(dāng)pH值在5.2以上時，胚雖能生長，但不發(fā)生顯然

的分化。

4.2培育條件

4.2.1溫度

大部分植物胚培育的溫度為25～30℃，但也有些植物需要較低

或較高的溫度。如馬鈴薯胚培育時溫度20℃較好，香子蘭的胚在32～

34℃下生長最好，柑橘、蘋果、梨25～30℃是合適的，棉花胚32℃

生長最好。有些植物，如桃的胚培育則需在變溫條件下進(jìn)行。

4.2.2光照

由于胚在胚珠內(nèi)的發(fā)育是不見光的，所以一般認(rèn)為在黑暗或弱光下培育幼胚比較合適，光對胚胎發(fā)育有略微的控制作用。離體培育條件下進(jìn)一步發(fā)育的幼胚對光的需求，因植物種類而異。棉花幼胚先在黑暗中培育，爾后轉(zhuǎn)入較強(qiáng)光照下培育，子葉的葉綠素生成很慢，但轉(zhuǎn)人弱光下培育，子葉很簡單產(chǎn)生葉綠素；薺菜胚培育，每日賞賜12h的光照比全黑暗條件好。

4.3胚柄

胚柄是一個短壽的構(gòu)造，長在原胚的胚根一端，當(dāng)胚達(dá)到球形期時，胚柄也發(fā)育到最大。有關(guān)胚柄的構(gòu)造、細(xì)胞學(xué)和生理生化的詳盡研究表示，胚柄積極參加幼胚的發(fā)育過程。一般胚柄較小，很難與胚一同剝離出來，所以培育的胚都不具備完滿的胚柄。有研究指出在幼胚培育中，胚柄的存在對幼胚的存活是重點(diǎn)。如紅花菜豆較老的胚，不論有無胚柄的存在，均能在培育基中生長；但幼胚培育時，不帶胚柄會顯然降低形成小植株的頻次。由于幼胚培育中，胚柄的存在會顯然刺激胚的進(jìn)一步發(fā)育，而且這類作用在胚發(fā)育的心形期達(dá)到熱潮。使用生長調(diào)治物質(zhì)，如5mg／L赤霉素能有效地取代胚柄的作用。如

紅花菜豆胚心形期時胚柄中赤霉素的活性比胚自己高30倍，子葉形成后，胚柄開始解體，GA3水平開始下降，但胚中GA3的水平增高。當(dāng)

沒有胚柄存在時，必然濃度范圍的KT可促進(jìn)幼胚的生長，但其作用難與赤霉素對照。

但Monnier(1978)的見解是，無胚柄的極幼齡胚所以難于培育，是由于在除去胚柄時所惹起的損害造成的。在薺菜幼胚培育中，無胚柄的胚在胚柄與胚連結(jié)點(diǎn)周邊的胚根原地區(qū)會出現(xiàn)細(xì)胞壞死的現(xiàn)象。

胚培育的應(yīng)用

5.1經(jīng)過“胚挽救"獲取遠(yuǎn)緣雜種

合子胚培育的最大用途是借以成立罕有的遠(yuǎn)緣雜種。在很多種間和屬間雜交中，受精作用能正常達(dá)成，胚也能進(jìn)行初期的發(fā)育，但由于胚乳發(fā)育不正?；螂s種胚與胚乳之間生理上的不協(xié)調(diào)，造成雜種胚初期夭折，即發(fā)生所謂“受精后阻攔”，最后不能夠形成有萌生力的種子。在這類情況下，經(jīng)過“胚挽救”即可戰(zhàn)勝這類受精后阻攔，產(chǎn)生遠(yuǎn)緣雜種。“胚挽救”的方式有3種：一是雜種幼胚在人工培育基上培育，二是雜種幼胚的胚乳看護(hù)培育，三是雜種幼胚的愈傷組織培育：

5.1.1雜種幼胚在人工培育基上培育

在發(fā)生“受精后阻攔”的情況下，若把雜種胚在開始夭折以前剝

離出來，置于一種合適的人工培育基上培育，則雜種胚經(jīng)常表現(xiàn)出正

常生長的潛力，最后長成雜栽種株。比方，黃香草木犀是一種很重要

的牧草，但其植株中含有大量對牛有害的物質(zhì)—香豆素。同屬的另一

個物種白香草木犀香豆素含量很低，為了把這個有利性狀轉(zhuǎn)入到前一

個物種，將這兩個物種進(jìn)行了雜交，結(jié)果是，雜種胚雖能生長一段時

間，但由于授粉8～10d后胚珠夭折，未能獲取種子。今后經(jīng)過雜種幼胚培育的方法，終于由這個雜交組合中獲取了雜栽種株。采用近似方法，在花百合與王百合之間，鹿子百合與天香百合之間，以及車軸草屬的若干物種之間也獲取了雜種。

在稻屬植物中，很多研究者都想經(jīng)過種間雜交選育抗病蟲害和抗逆的高產(chǎn)水稻品種，但胚的夭折素來是實(shí)現(xiàn)這個目標(biāo)的一個嚴(yán)重障

礙。胚培育正是戰(zhàn)勝這個阻攔的有效路子。在若干個平常不能夠成功的稻屬種間雜交中，人們經(jīng)過對雜種胚進(jìn)行培育而獲取了正常的雜栽種株。

在番茄中，為了把抗病蟲害的特點(diǎn)由野生物種轉(zhuǎn)移到栽種物種，

一個理想的路子是把栽種番茄和野生番茄進(jìn)行雜交。當(dāng)把野生番茄用

做母本時，由于受精前阻攔，雜交不能夠成功?？墒欠唇粫r能夠受精，

可是由于胚的夭折不能夠形成有生活力的種子。而借助于胚培育，在以

栽種番茄做母本的雜交中獲取了雜栽種株。

其他，在有些遠(yuǎn)緣雜交中，如在大麥×黑麥的雜交中，為了能夠

獲取適于培育的胚，授粉此后必定在穗子上噴灑GA3，NAA和2ip(二

甲基丙烯嘌磷)的混淆液。在未經(jīng)辦理的穗子上，胚在達(dá)到適于培育

的大小以前，種子的發(fā)育已經(jīng)停止。

5.1.2雜種幼胚的胚乳看護(hù)培育

若是胚的夭折發(fā)生在發(fā)育的極初期，由于人工培育基很難取代天

然胚乳的作用，采用以上方法挽救雜種仍會碰到很大困難，在這類情

況下，則可試一試胚乳看護(hù)培育法。

5.1.3雜種幼胚的愈傷組織培育

在以上兩種方法皆難奏效的情況下，則可試一試雜種幼胚愈傷組織培育法，即先把雜種幼胚引誘成愈傷組織，經(jīng)過或長或短的繼代培育此后，再引誘雜種愈傷組織分化植株。這類方法是20世紀(jì)80年月發(fā)展起來的一種十分有效的方法。比方，在小麥和簇毛麥的屬間雜交中，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)(1991)采用這類方法，由可是2個不足1mm大小的雜種

幼胚，在不到1年的時間內(nèi)，獲取了數(shù)以萬計(jì)的雜栽種株，經(jīng)過雜種愈傷組織和雜種試管苗的染色體加倍，獲取了不計(jì)其數(shù)的雙二倍體種子。

除了以上介紹的例子外，采用未成熟胚愈傷組織培育方法，在大麥×小麥，栽種番茄×智利番茄等遠(yuǎn)緣雜交中也都獲取了成功。

在遠(yuǎn)緣雜交此后，經(jīng)過染色體的定向除去而產(chǎn)生單倍體，是胚培育的另一項(xiàng)新用途。如在栽種大麥×球莖大麥的雜交中，受精作用不難達(dá)成，但在胚胎發(fā)生的最初幾次分裂時期，球莖大麥染色體碰到選擇性的裁汰，結(jié)果形成了單倍體的胚，它們生長相當(dāng)遲緩，加之受精

后2～5d胚乳漸漸解體，所認(rèn)為了獲取大麥的單倍體植株，必定把胚剝離出來進(jìn)行培育。

5.2獲取單倍體

在遠(yuǎn)緣雜交此后，經(jīng)過染色體的定向除去而產(chǎn)生單倍體，是胚培育的另一項(xiàng)新用途（p175）。

5.3打破種子休眠，縮短育種周期

很多植物的種子發(fā)育不完滿或有控制物存在而影響種胚萌芽。如

一些