課題多聚酶鏈式反應擴增片段課件

關(guān)于課題多聚酶鏈式反應擴增片段第1頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三脫氧核糖含氮堿基磷酸AGCT1、DNA的基本單位－脫氧核苷酸一、DNA分子的結(jié)構(gòu)12345O第2頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三鳥嘌呤脫氧核苷酸胞嘧啶脫氧核苷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸2、脫氧核苷酸的種類A腺嘌呤脫氧核苷酸GCT第3頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三第4頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三ATGCAGCT3、DNA分子的平面結(jié)構(gòu)氫鍵5'端3'端5'端3'端第5頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三4、DNA的立體結(jié)構(gòu)

——雙螺旋結(jié)構(gòu)第6頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三2、時間：細胞分裂間期（有絲分裂間期，減數(shù)第一次分裂的間期）1、概念：以親代DNA為模板，根據(jù)堿基互補配對合成子代在DNA的過程。3、場所：主要是細胞核（其次是線粒體、葉綠體）二．細胞內(nèi)DNA復制的過程第7頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三4、條件：①模板：親代DNA的兩條母鏈②原料：游離的四種脫氧核苷酸③能量：ATP④

酶：解旋酶、DNA聚合酶⑤引物：一小段RNA，能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對5、過程（1）解旋：解旋酶、ATP（2）以DNA的兩條母鏈為模板，根據(jù)堿基互補配對規(guī)則，合成子鏈。（3）子鏈、母鏈螺旋構(gòu)成子代DNA第8頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三DNA體內(nèi)復制（示意）第9頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三6、復制特點半保留復制，邊解旋邊復制，多起點復制。7、DNA復制的方向DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸第10頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三條件組分作用模板DNA的兩條單鏈提供復制的模板原料四種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料酶解旋酶TaqDNA聚合酶不需要催化合成DNA子鏈能量ATP不需要引物一般是一小段DNA使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸

1、PCR的技術(shù)（DNA體外復制）的條件DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃

）復性（緩慢冷卻）一、PCR的原理（PCR的技術(shù)原理）第11頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三一、PCR的原理（PCR的技術(shù)原理）1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸高溫變性低溫復性重復1~3步30輪3、DNA復制的方向DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸2、步驟：變性——復性——延伸第12頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三PCR技術(shù)的原理總結(jié)利用DNA分子的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結(jié)合，從而完成體外DAN分子的擴增。體外DNA復制的條件：

四種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶、引物、模板；緩沖溶液和嚴格控制溫度的溫控設(shè)備。復制的方向：子鏈的5’端向3’端延伸。第13頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三二、PCR的反應過程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ變性95oC復性55oC延伸72oC5/3/3/5/第14頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三5引物15引物2第二次復制第一次復制55

55

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5模板DNA55

555

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5525～30次循環(huán)（復制）后，模板DNA的含量可以擴大100萬（220）倍以上。第15頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三每個循環(huán)包括：變性——復性——延伸從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也可以作為模板參與反應，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結(jié)合，進行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異性地復制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增。PCR的反應過程總結(jié)第16頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三三、PCR反應的實驗操作1、PCR儀設(shè)備及用具2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次實質(zhì)上一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器第17頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三三、PCR反應的實驗操作（1）按配方將所需試劑擺放在實驗桌上（準備）（2）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（移液）（3）蓋嚴離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合）（4）將微量離心管放在離心機上（離心）（5）將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序（反應）循環(huán)數(shù)變性復性延伸第一次94°C,10min－－30次９4℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min第18頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三四、結(jié)果分析與評價DNA含量的測定：稀釋→對照調(diào)零→測定→計算（公式見P63）波長260nm處讀數(shù)蒸餾水做對照50倍第19頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三（一）理論上DNA擴增數(shù)目的計算四、課題成果評價1、一條DNA，復制n次，DNA為2n2、

a條DNA，復制n次，DNA為ax2n（二）實驗中DNA含量的測定1、原理可以通過測量DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)第20頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三2、過程①稀釋2μL

PCR反應液，加入98μL蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋②對照調(diào)零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值③測定并計算DNA含量（g/mL）＝50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)第21頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三50：在厚度為1cm比色杯中的吸光值為1,DNA

的含量為50g/ml的第22頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三體內(nèi)DNA復制與PCR的技術(shù)區(qū)別：體內(nèi)復制PCR技術(shù)解旋在解旋酶作用下，細胞提供ATP，部分解開加熱到94oC,雙鏈全部解開，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DNA片段DNA聚合酶細胞自身的DNA聚合酶（不耐高溫）TaqDNA聚合酶復制特點半保留復制，邊解旋邊復制，多起點復制。半保留復制，完全解旋后復制，從模板鏈的一端開始復制。復制的方向子鏈的5’端向3’端延伸子鏈的5’端向3’端延伸第23頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三課堂小結(jié)多聚酶鏈式反應擴增DNA片段PCR原理DNA的復制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復性受溫度影響PCR過程變性復性延伸操作步驟配制PCR反應體系移入離心管放入PCR儀設(shè)置工作參數(shù)DNA擴增測定含量稀釋調(diào)零測定并讀數(shù)計算第24頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三練習鞏固1、關(guān)于PCR技術(shù)的應用，錯誤的一項是A古生物學、刑偵破案、DNA序列測定B診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學CDNA序列測定、基因克隆、刑偵破案‘D診斷遺傳疾病、合成核苷酸、DNA序列測定第25頁，講稿共28頁，2023年5月2日，星期三2、DNA的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延伸？3、PCR技術(shù)最突出的優(yōu)點是A原理簡單B原料易找CTaqDNA聚合酶有耐熱性D快速、高效、靈活、易于操作從子鏈的5’端向3’端延伸第