重組DNA導(dǎo)入受體細胞課件

關(guān)于重組DNA導(dǎo)入受體細胞第1頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)導(dǎo)接合轉(zhuǎn)移1.重組體導(dǎo)入細菌細胞（1）大腸桿菌重組質(zhì)粒DNA分子進入受體細胞，并在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達的過程稱之為轉(zhuǎn)化（transformation)。轉(zhuǎn)化不僅適合于大腸桿菌受體細胞，而且適合于枯草桿菌和藍藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受體細胞。

化學(xué)誘導(dǎo)感受態(tài)法電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞（competencecell）是指處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)的細胞?！铩锏?頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三I.化學(xué)誘導(dǎo)感受態(tài)法

原理：E.coli細胞處于0℃，CaCl2的低滲溶液中，細胞膨脹成球形，細胞膜形成液晶結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細胞表面，經(jīng)42℃短時間熱沖擊處理，液晶結(jié)構(gòu)被擾動而使細胞膜出現(xiàn)間隙，促使DNA復(fù)合物進入細胞，在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細胞復(fù)原并分裂增殖，被轉(zhuǎn)化的細菌中，重組子中基因得到表達，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。第3頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三Ca2+處理的感受態(tài)細胞，其轉(zhuǎn)化率一般能達到106～108轉(zhuǎn)化子/gDNA。化學(xué)法簡單、快速、穩(wěn)定、重復(fù)性好，感受態(tài)細菌可以在-70℃保存，但轉(zhuǎn)化DNA大小有限制，不同物種需要不同的誘導(dǎo)方法。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子進入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。第4頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃離心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重懸4℃離心收集菌4℃離心收集菌分裝、-70℃凍存用冰冷的60mMCaCl2重懸Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重懸感受態(tài)細胞制備

制備感受態(tài)菌必須使用對數(shù)生長期的菌，且必須在冰冷的條件下制備。CaCl2處理充分，使細菌細胞膜失去一些蛋白。

儲存感受態(tài)菌要在-70℃以下，使用感受態(tài)菌時必須迅速融化，融化后一般不能再次凍存使用第5頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三10ng質(zhì)粒DNA100L感受態(tài)菌冰上混合，靜置10分鐘42oC1分鐘冰浴2min，加入1mLLB培養(yǎng)基37℃搖1小時10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA轉(zhuǎn)化過程第6頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三II.電轉(zhuǎn)化

可以轉(zhuǎn)化大分子DNA（>50Kb)，胞壁較厚的物種需要制備原生質(zhì)體后電轉(zhuǎn)化電穿孔轉(zhuǎn)化法最早用于將DNA導(dǎo)入真核細胞，1988年，Dower等人成功地應(yīng)用該法進行了大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。原理:利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細胞膜上進行電穿孔(electroporation),形成可逆的瞬間通道，從而促進外源DNA的有效吸收。電穿孔轉(zhuǎn)化法的效率受電場強度、電脈沖時間和外源DNA濃度等參數(shù)的影響，通過優(yōu)化這些參數(shù)，每微克DNA可以得到109～1010轉(zhuǎn)化子。電壓增高或電脈沖時間延長時，轉(zhuǎn)化效率將會提高，但受體細胞存活率會降低。研究表明，當電場強度和脈沖時間的組合方式導(dǎo)致50%～70%細菌死亡時，轉(zhuǎn)化效率達到最高?！锏?頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，4℃離心集菌冰冷的水重懸菌體4℃離心集菌冰冷的水重懸菌體4℃離心收集菌體少量冰冷的水重懸細胞分裝成50L電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25F脈沖控制器200-4000.5g質(zhì)粒DNA混合、冰浴加入1mLSOC培養(yǎng)液37°C中速震蕩60分鐘涂布轉(zhuǎn)化細胞制備：電轉(zhuǎn)化：第8頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三用于電穿孔轉(zhuǎn)化法的細胞處理要比感受態(tài)細胞的制備要容易，當細菌生長到對數(shù)中期后予以冷卻、離心，然后用低鹽緩沖液充分清洗降低細胞懸浮液的離子強度，并用10%甘油重懸細胞，使其細胞濃度為3×1010個／ml，分裝，在干冰上速凍后置于-70℃貯存。每小份細胞融解后即可用于轉(zhuǎn)化，有效期達6個月以上一般電穿孔轉(zhuǎn)化須在低溫下（0～4℃）進行，轉(zhuǎn)化效率要比在室溫下操作提高約100倍。由于細菌細胞相對較小，因此與DNA導(dǎo)入真核細胞時相比，大腸桿菌的電轉(zhuǎn)化要求有更高的場強，而反應(yīng)體積則相對要小，以20～40μl為宜。第9頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三第10頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三第11頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三（2）枯草芽孢桿菌Spizzen感受態(tài)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌可以形成自然感受態(tài)，在對數(shù)生長后期由信息素激發(fā)一種二元信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，激活一系列感受態(tài)相關(guān)基因的表達。Spizzen在1958年發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象并發(fā)展了感受態(tài)轉(zhuǎn)化的方法.基本步驟：細胞在較為豐富的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長后期，然后轉(zhuǎn)接到營養(yǎng)貧瘠的培養(yǎng)基中，可使其形成感受態(tài)（一般非常短暫）I.Spizzen感受態(tài)轉(zhuǎn)化★第12頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三在枯草芽孢桿菌中，轉(zhuǎn)化的過程包括外源DNA的吸附、斷裂、吸收降解和重組（或形成獨立的復(fù)制單元，如質(zhì)粒）幾個階段：吸附：這一過程發(fā)生在感受態(tài)細胞的表面，是一個非共價結(jié)合的過程。在枯草芽孢桿菌的感受態(tài)細胞表面平均約有50個DNA吸附位點，這些位點對雙鏈DNA有非常大的親和力雙鏈DNA的斷裂：在吸附發(fā)生后的30秒內(nèi)，DNA被核酸酶隨機斷裂，其平均長度約為7kb。DNA的降解和吸收：在斷裂發(fā)生之后，雙鏈DNA的一條鏈被完全降解，另一條鏈穿過細胞壁和細胞膜后進入胞內(nèi)。合成雙鏈并環(huán)化：變成雙鏈后依靠同源區(qū)環(huán)化。自身無同源區(qū)段（重復(fù)序列）的DNA，轉(zhuǎn)化效率極低。對于質(zhì)粒單體，需要體外酶切、連接成質(zhì)粒多聚體才能高效轉(zhuǎn)化。103~105個/gDNA缺點：對于生長差別較大的菌株需要重新確定轉(zhuǎn)接培養(yǎng)時間；酶切后質(zhì)粒無法轉(zhuǎn)化。由于需要借助同源重組來重新環(huán)化質(zhì)粒，對于recA缺陷菌株轉(zhuǎn)化效率非常低★第13頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三

原理：用溶菌酶等處理消化部分細胞壁，制備原生質(zhì)體，在PEP(聚乙二醇）等促溶劑作用下使細胞膜形成小孔，胞外DNA通過小孔進入胞內(nèi),然后在再生培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。II.原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

優(yōu)點：不需要質(zhì)粒有自身同源區(qū)，因此對于單體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率也很高（106個/微克DNA

）缺點：轉(zhuǎn)化效率隨質(zhì)粒分子量變大而減??；部分抗生素在再生培養(yǎng)基失去篩選作用（例如卡那霉素在DM3培養(yǎng)基中無效）不適用于革蘭氏陰性菌III.電轉(zhuǎn)化

原理、步驟和大腸桿菌電轉(zhuǎn)化一樣，但轉(zhuǎn)化效率很低(<106個/微克DNA)

★第14頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三2.酵母菌的轉(zhuǎn)化方法（1）原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化法。在Ca2+和PEG的存在下，轉(zhuǎn)化細胞可達存活的原生質(zhì)球總數(shù)的1%-5%。但是操作周期長（再生需4~6天），而且轉(zhuǎn)化效率受到原生質(zhì)再生率的嚴重制約。酵母原生質(zhì)轉(zhuǎn)化法一個顯著特點是，一個受體細胞可同時接納多個質(zhì)粒分子，而且這種共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25%-33%。

酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的酵母載體PEG（聚乙二醇）CaCl2使細胞壁具有通透性，允許DNA進入。轉(zhuǎn)化★第15頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三（2）堿金屬離子介導(dǎo)的酵母菌轉(zhuǎn)化釀酒酵母經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）、PEG熱休克處理后，也可高效吸收質(zhì)粒DNA，而且具有以下特性：吸收線性DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA，二者相差80倍,共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象較為罕見。（3）電轉(zhuǎn)化法酵母菌原生質(zhì)體和完整細胞均可在電擊條件下吸收質(zhì)粒DNA，但在此過程中應(yīng)避免使用PEG，它對受電擊的細胞具有較大的負作用。其優(yōu)勢在于不依賴于受體細胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件，適用范圍廣，而且轉(zhuǎn)化率高達105轉(zhuǎn)化子/μgDNA。

酵母0.1mol/LLiCl處理插入外源基因的酵母載體感受態(tài)40%PEG4000★★第16頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三其他導(dǎo)入技術(shù)：接合轉(zhuǎn)移在質(zhì)粒轉(zhuǎn)移過程中，利用供體細胞可與受體細胞發(fā)生接合作用而將質(zhì)粒導(dǎo)入受體細胞的方法，供體細胞和受體細胞可以為不同微生物：例如大腸桿菌和鏈霉菌供體細胞含有輔助質(zhì)粒，輔助質(zhì)粒為可轉(zhuǎn)移的接合型質(zhì)粒，含有與接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因（tra），這類質(zhì)粒一般也是廣宿主質(zhì)粒。而重組質(zhì)粒一般不含tra基因，但有bom基因，可以被誘動轉(zhuǎn)移；一般是穿梭載體，保證在供體菌（E.coli）和受體菌（例如根瘤菌或鏈霉菌）中均能復(fù)制。將含輔助質(zhì)粒的細胞、含重組質(zhì)粒的供體細胞與受體細胞三者共同培養(yǎng)，便可實現(xiàn)重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細胞，稱為三親雜交接合轉(zhuǎn)移★第17頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三三親雜交接合轉(zhuǎn)移重組質(zhì)粒從大腸桿菌轉(zhuǎn)移到土壤農(nóng)桿菌★第18頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三葉盤消毒切取土壤農(nóng)桿菌浸泡看護培養(yǎng)基愈傷組織分化幼苗3.導(dǎo)入植物細胞（1）葉盤法（leafdisk)★第19頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三植物細胞原生質(zhì)體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液1-2kV,3-25F電擊愈傷組織幼苗分化（2）.電擊法（electroporation)☆第20頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三又稱高速微型子彈射擊法（High-velocitymicroprojectiles)以冷壓縮氣體為動力將吸附DNA的金屬微粒打入細胞內(nèi)，完成基因轉(zhuǎn)移，適合各種細胞（微生物、動植物）?？焖?、簡便、安全、高效。還可以導(dǎo)入細胞（如內(nèi)生菌）、蛋白、細胞器、細胞核等。DNA1.2m鎢彈頭吸附特制手槍射擊植物裝入（3）.基因槍法（genegun）☆第21頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三原理（略）4.導(dǎo)入動物細胞（1）.磷酸鈣沉淀法在磷酸鈣-DNA沉淀物中，兩種物理上毫無聯(lián)系的DNA分子混合物往往能侵染同一個細胞該方法經(jīng)常用于兩種DNA同時轉(zhuǎn)化一個宿主細胞的過程(也稱為共轉(zhuǎn)化）。在基因工程實驗中,時常需要用沒有選擇表型的質(zhì)粒作轉(zhuǎn)化,然后在宿主菌中篩選出這種質(zhì)粒。這時可采用有選擇標記的另一質(zhì)粒與之共轉(zhuǎn)化,通過后者進行篩選。這項技術(shù)常用于哺乳類細胞的實驗，效率高達15%?！锏?2頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三脂質(zhì)體有商業(yè)試劑盒（如LifeTechnologies）。（2）.脂質(zhì)體（lipofectin）載體法利用脂類包埋DN