血清學鑒定實驗

關(guān)于血清學鑒定實驗第1頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三血清學診斷：是指用已知細菌的特異性抗原檢測患者血清中相應(yīng)抗體的方法，以診斷感染性疾病。（用已知抗原檢測血清中的特異性抗體）血清學鑒定：即采用含有已知特異性抗體的免疫血清（診斷血清）與分離培養(yǎng)出的未知純種細菌或標本中的抗原進行血清學反應(yīng)，以確定病原菌的種或型。（用已知抗體鑒定未知的細菌或標本中的抗原）第2頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三微生物抗原成分-----細菌抗原成分菌體抗原:革蘭氏陰性菌的菌體抗原稱O抗原---脂多糖蛋白質(zhì)的復合物鞭毛抗原稱為H抗原表面抗原:不同細菌的表抗原名稱不同.大腸桿菌的表面抗原稱為封套抗原或K抗原,肺炎雙球菌的叫莢膜抗原,傷寒沙門氏菌的表面抗原稱為Vi抗原第3頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三細菌抗原細菌的各種抗原第4頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三

抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)（antigen-antibodyreaction）是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。可發(fā)生于體內(nèi)（invivo），也可發(fā)生于體外(invitro)。體內(nèi)反應(yīng)可介導吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等作用；體外反應(yīng)則根據(jù)抗原的物理性狀、抗體的類型及參與反應(yīng)的介質(zhì)（例如電解質(zhì)、補體、固相載體等）不同，可出現(xiàn)凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補體參與的反應(yīng)及中和反應(yīng)等各種不同的反應(yīng)類型。因抗體主要存在于血清中，在抗原或抗體的檢測中多采用血清作試驗，所以體外抗原抗體反應(yīng)亦稱為血清反應(yīng)（erologicreaction）。第5頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三抗原抗體反應(yīng)條件抗原抗體3.環(huán)境因素：（1）電介質(zhì)：0.85%NaCI；（2）溫度：37或56（3）pH值：7.0（4）振蕩：適當?shù)臋C械振（5）反應(yīng)時間第6頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三抗原抗體反應(yīng)的特點特異性和交叉性若兩種抗原之間含有部分共同抗原時，則發(fā)生交叉反應(yīng)。親緣關(guān)系越近，交叉反應(yīng)的程度也越高。反應(yīng)的可逆性

抗原與抗體的結(jié)合為分子表面的結(jié)合，結(jié)合的適宜溫度為0～40℃、pH在4.0～9.0范圍內(nèi)。如溫度超過60℃或pH降到3.0以下，或加入解離劑臺硫氰化鉀、尿素等，則抗原抗體復合物又可重新解離，解離后的抗原或抗體性質(zhì)不改變。第7頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三抗原抗體反應(yīng)特點最適比和帶現(xiàn)象只有抗原與抗體呈適當比例時，才可出現(xiàn)可見的結(jié)合反應(yīng)。當抗原過多或抗體過多，則抗原抗體的結(jié)合不能形成大的復合物，因而抑制可見反應(yīng)的出現(xiàn)，這一現(xiàn)象稱為帶現(xiàn)象?？贵w過多出現(xiàn)的抑制現(xiàn)象稱前帶現(xiàn)象，而抗原過多出現(xiàn)的抑制現(xiàn)象稱后帶現(xiàn)象。為了克服帶現(xiàn)象，在進行血清學試驗時，需將抗原或抗體作適當稀釋。第8頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三抗原抗體反應(yīng)特點反應(yīng)的二階段性結(jié)合階段-----反應(yīng)發(fā)生快，幾秒鐘至幾分鐘。反應(yīng)階段-----較慢，需幾分鐘、幾十分鐘或更長時間。第9頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三凝集反應(yīng)顆粒性抗原（如細菌、紅血球等）或吸附在乳膠、白陶土、離子交換樹脂和紅細胞的抗原與其特異性抗體結(jié)合后，在有電介質(zhì)存在時，凝聚成肉眼可見的凝集小塊。凝集原——凝集素直接凝集反應(yīng)玻片法試管法抗原抗體反應(yīng)類型-----凝集反應(yīng)第10頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三血清學鑒定

掌握細菌的血清學鑒定法。實驗?zāi)康牡?1頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三實驗原理

根據(jù)抗原抗體反應(yīng)具有高度特異性的特點，用已知抗體來檢測未知抗原（細菌）。第12頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三實驗材料1.菌種待檢細菌2.試劑多價沙門菌O(A-F)診斷血清3.其他載玻片第13頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三沙門氏菌診斷血清（11種）O2O4O7O9HaHbHcHdHiViA-F群多價OA-F群多價O第14頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三O抗原、H抗原和Vi抗原O抗原:是一種沙門氏菌細胞壁表面的耐熱多糖抗原，100℃，2.5h不被破壞，它的特異性依賴于細胞壁脂多糖側(cè)鏈多糖的組成。

H抗原:是一種蛋白質(zhì)性鞭毛抗原，共有63種，60℃加熱30～60min及酒精作用均可破壞其抗原性，但能抵抗甲醛。Vi抗原:是一種N-乙酰-D-半乳糖胺糖醛酸聚合物，60℃加熱1h即破壞其凝集性和免疫原性。第15頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三沙門氏菌的主要抗原組成O抗原：至少58種,

含相同抗原組分歸為一組，引起人類疾病的沙門菌大多數(shù)在A~F組。H抗原：分為Ⅰ、Ⅱ相，Ⅰ相以a、b、c等表示，Ⅱ相以1、2、3等表示。Vi抗原：抗原性弱，不穩(wěn)定，可阻止O抗原與其相應(yīng)抗體的凝集反應(yīng)。第16頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三沙門氏菌菌型的表示方法血清型以數(shù)字和字母表示.

例如:查考夫曼-懷特沙門氏菌屬抗原表.鼠傷寒沙門氏菌:O抗（1，4，[5]，12），第Ⅰ相H抗原（i）第Ⅱ相H抗原(1,2)。它的血清型應(yīng)表示為:鼠傷寒沙門氏菌（1，4，[5]，12：i：1，2）[]內(nèi)的O抗原可能存在或不存在。[]內(nèi)的H抗原可能是罕見的，正常情況下一般不存在。第17頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三沙門氏菌的血清鑒定的方法用O、H和Vi因子血清與待檢的菌株作玻片凝聚試驗。1.先用O因子血清確定菌株所屬的O群及O抗原的各種成分。2.再用H因子血清檢查其第1相和第2相的H抗原以確定血清型。3.必要時還要用Vi血清檢查(目前有3種)。第18頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三1.先用A~F多價O血清檢查，確定菌株是否在A~F六個O群的范圍內(nèi)。2.再用代表六個O群的O因子血清檢查，即O2（A）、O4（B）、O7（C1）、O8（C2）、O9（D）、O3，10（E）、O11（F）。3.確定O群之后，分別用HA(a、b、c、d、i、z10、z29）HB、HC、HD四種多價H血清檢查。4.用3.所確定的多價H血清所包括的所有H因子血清逐一檢查定為第1相或第2相H抗原。5.檢出第1相H抗原而未檢出第2相H抗原，或檢出第2相H抗原而未檢出第1相H抗原的，要用位相變異的方法再檢查其另一個相。單相菌不必作位相變異檢查。6.綜合O和H因子血清以及Vi因子血清的檢查結(jié)果，按照考夫曼-懷特沙門氏菌屬抗原表解判定沙門氏菌的菌型。沙門氏菌的血清型鑒定步驟第19頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三實驗方法

50ul血清+待檢菌50ulNS+待檢菌

第20頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三

先用A－F和Vi血清檢測，根據(jù)結(jié)果再進行其他鑒定。注意：第21頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三結(jié)果判斷均勻混濁顆粒狀凝集物＋－第22頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三組別菌型抗原oHA甲型副傷寒沙門菌1,2,12a:-B乙型副傷寒沙門菌德比沙門菌鼠傷寒沙門菌1,4,5,121,4,121,4,5,12b:1,2f,g:-i:1,2C

豬霍亂（或丙型副傷寒）沙門菌6,7,(Vi)c:1,5D傷寒沙門氏菌9,12,Vid:-E鴨沙門氏菌3,10e,h:1,6F阿伯丁沙門氏菌11i:1,2沙門氏菌屬國內(nèi)常見菌型診斷抗原表第23頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三注意事項1.生理鹽水端應(yīng)不出現(xiàn)凝集顆粒。2.沙門菌Vi抗原存在時可阻止O抗原與相應(yīng)抗體發(fā)生凝集，故在做玻片凝集時應(yīng)加注意，需事先加熱破壞Vi抗原，O抗原才得以與相應(yīng)的O診斷血清發(fā)生凝集。第24頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三血清學實驗進程先鑒定A－F和Vi，根據(jù)結(jié)果再進行其他鑒定。

A－F

Vi實驗進程--

為非沙門氏菌屬，不再繼續(xù)鑒定其他抗原成分。+-

初步判斷為沙門氏菌屬，繼續(xù)鑒定其他抗原成分。-+

初步判斷為沙門氏菌屬，但需去除菌體Vi莢膜后再繼續(xù)鑒定其他抗原成分。第25頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三群別菌型抗原oHA甲型副傷寒沙門菌1,2,12a:-B乙型副傷寒沙門菌德比沙門菌鼠傷寒沙門菌1,4,5,121,4,121,4,5,12b:1,2f,g:-i:1,2C豬霍亂（或丙型副傷寒）沙門菌6,7,(Vi)c:1,5D傷寒沙門氏菌9,12,Vid:-E鴨沙門氏菌3,10e,h:1,6F阿伯丁沙門氏菌11i:1,2沙門氏菌屬常見菌型診斷抗原表第26頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三位相變異的解釋將一個雙相沙門氏菌的菌株在瓊脂平板上劃線分離，所得的菌落中，有的有第1相H抗原，有的則有第2相H抗原。若任意挑取一個菌落在培養(yǎng)基上多次傳代，其后代又可出現(xiàn)部分是第1相而另一部分是第2相的菌落。這種兩個相的H抗原可以交相產(chǎn)生的現(xiàn)象稱為位相變異。雙相菌初次分離時，單個菌落的純培養(yǎng)往往只有一個相H抗原，鑒別時常只能檢出一個相，而測不出另一相。此時，可用已知相血清誘導的位相變異試驗來獲得未知的另一個相H抗原。第27頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三位相變異試驗的方法簡易平板法1.配制0.7~0.8%的半固體瓊脂培養(yǎng)基，然后傾注平板烘干表面水分。2.在平板內(nèi)滴上一滴已知的第1相或第2相血清因子，并作好標記。3.待血清吸收到瓊脂內(nèi)，在標記部位的中間點種已知第1相或第2相的新鮮待檢菌株。4.培養(yǎng)后，其已知相細菌的動力受到抑制，解離出另一相的細菌，并向周圍蔓延生長，形成一個大的菌落。5.檢查其菌落的邊緣部分，即可確定該菌株的另一相H抗原。6.該方法通常1~3天內(nèi)可以有結(jié)果。第28頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三位相變異試驗的方法U形管法小玻管法小套管法軟瓊脂斜面法第29頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三59種沙門氏菌的血清列表

O1O2O4O5O7O8O9O10O11O14O15O19O20O27O34O46O3,19HaHbHcHdHfHgHhHiHkHmHnHpHrHsHtHuHvHwHxHyHzHz6Hz10Hz13Hz15Hz28Hz29H2H