常用的分子生物學(xué)技術(shù)原理及科學(xué)應(yīng)用

2023/7/7SuzhouUniversity1第一節(jié)

分子雜交與印跡技術(shù)

MolecularHybridization&Blotting

Technology2023/7/7SuzhouUniversity2定義：核酸分子雜交(nucleicacidybridization)在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理2023/7/7SuzhouUniversity3復(fù)性RNADNA2023/7/7SuzhouUniversity4（一）印漬技術(shù)

Blotting首先由EdwenSouthern在1975年提出。Blotting即“印漬”，指將存在于凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移（印漬）到固定化介質(zhì)，并加以檢測分析的技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于DNA、RNA和蛋白質(zhì)的檢測.2023/7/7SuzhouUniversity5（二）探針技術(shù)

probe將一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或熒光染料對它的末端或全鏈進行進行標記，稱為“探針”然后用于分子雜交，雜交后通過放射自顯影、熒光檢測或顯色技術(shù)，使雜交區(qū)帶顯現(xiàn)出來。2023/7/7SuzhouUniversity61、探針的制備方法探針長度一般以50~300bp為宜。制備方法：1）利用DNA重組技術(shù)2）PCR擴增3）化學(xué)合成2023/7/7SuzhouUniversity72、探針的分類：

據(jù)制備方法及核酸性質(zhì)不同，可分為：（1）基因組DNA探針（2）cDNA探針（3）RNA探針（4）寡核苷酸探針2023/7/7SuzhouUniversity83、合成寡核苷酸探針注意原則：1）長度（10-50bp);2)G:C對含量40%-60%；3）探針內(nèi)避免互補；4）避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)；5）與非靶序列有70%以上同源性或連續(xù)8個以上堿基序列相同，最好不用。Home2023/7/7SuzhouUniversity94、核酸探針的標記

為確定探針是否與相應(yīng)基因組DNA雜交，有必要對探針加以標記，以便在結(jié)合部位獲得可識別的信號。2023/7/7SuzhouUniversity10（1）標記的種類同位素：32P、35S、3H、125I等標記探針非同位素：生物素、地高辛配體、熒光素等作為標記物兩者比較：后者不及前者敏感，但后者保存時間較長，無同位素污染。2023/7/7SuzhouUniversity112023/7/7SuzhouUniversity12（3）一個理想的標記物：1）標記前后探針的基本結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)相同;2）特異性強、本底低、重復(fù)性好；3）操作簡單、節(jié)時；4）安全、無環(huán)境污染。2023/7/7SuzhouUniversity13（4）探針的標記方法1）缺口平移法2）隨機引物標記法3）末端標記法4）生物素光照標記法2023/7/7SuzhouUniversity14NickTranslationOHpOH+PPDNAdNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I32P-dNTPBio-dNTP2023/7/7SuzhouUniversity15隨機引物標記探針5`3`5`5`3`DNA32p-dNTP,Bio-dNTP6bpprimerKlenow,dNTP變性-復(fù)姓2023/7/7SuzhouUniversity163、DNA末端標記2023/7/7SuzhouUniversity17（三）印漬技術(shù)的類別及應(yīng)用

DNA印跡技術(shù)SouthernblottingRNA印跡技術(shù)Northernblotting蛋白質(zhì)印跡技術(shù)Westernblotting斑點印跡Dotblotting原位雜交insituhybridizationDNA點陣DNAarrayDNA芯片技術(shù)DNAchip2023/7/7SuzhouUniversity181、DNA印跡技術(shù)

Southernblotting（1）定義：又稱為Southern雜交，即DNA-DNA雜交分析。是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，主要用于基因組DNA的分析，如在基因組中特異基因的定位及檢測等，亦可用于分析重組質(zhì)粒和噬菌體。在遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價值。2023/7/7SuzhouUniversity192、基本方法將DNA標本用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段；經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和，高鹽下通過毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜上，烘干固定，凝膠中DNA片段的相對位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著。附著在濾膜上的DNA與32P標記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確定探針互補的每條DNA帶的位置，確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。2023/7/7SuzhouUniversity20PaperTowelsSouthernBlottingtissueSDS蛋白酶K酚/氯仿無水乙醇離心2023/7/7SuzhouUniversity21。2023/7/7SuzhouUniversity22真空轉(zhuǎn)膜槽濾紙尼龍膜凝膠蓋子+-真空轉(zhuǎn)膜2023/7/7SuzhouUniversity232023/7/7SuzhouUniversity242023/7/7SuzhouUniversity25（2）RNA印漬技術(shù)

Northernblotting又稱為Northern雜交，即RNA-DNA雜交分析。是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。主要用于檢測某一組織或細胞中已知的特異mRNA的表達水平以及比較不同組織和細胞的同一基因的表達情況。2023/7/7SuzhouUniversity26（3）蛋白質(zhì)印漬技術(shù)

Westernblotting又稱為Western雜交，或免疫印漬技術(shù)，即利用抗原-抗體反應(yīng)，檢測轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的特異性蛋白質(zhì)。應(yīng)用：用于檢測樣品中特異性蛋白質(zhì)的存在、細胞中特異蛋白質(zhì)的半定量分析以及蛋白質(zhì)分子的相互作用研究等。2023/7/7SuzhouUniversity27WesternBlot2023/7/7SuzhouUniversity28Westernblot生物素HRP化學(xué)顯色復(fù)合物ABC復(fù)合物組織抗原抗生物素一抗生物素化二抗抗HRP2023/7/7SuzhouUniversity29三種印跡技術(shù)的比較2023/7/7SuzhouUniversity30DNA印跡技術(shù)(Southernblotting)用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。RNA印跡技術(shù)(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。蛋白質(zhì)的印跡分析(Westernblotting)

用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。2023/7/7SuzhouUniversity31（4）斑點印跡Dotblotting斑點雜交法是不經(jīng)過電泳，而將被檢標本直接點到膜上，烘烤固定，用于雜交。這種方法耗時短，可做半定量分析，一張膜上可同時檢測多個樣品。

2023/7/7SuzhouUniversity32DNA

樣品

2、應(yīng)用：1）混合樣品DNA鑒定2）基因缺失檢測3）基因表達分析

點樣Probe-32P檢測AB12342023/7/7SuzhouUniversity33（5）原位雜交insituhybridization即組織原位雜交，指組織切片或細胞涂片直接用于雜交分析。先經(jīng)適當(dāng)處理，使細胞通透性增加，讓探針進入細胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。因此原位雜交可以確定探針的互補序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。2023/7/7SuzhouUniversity34第二節(jié)生物芯片（biochip）制備方法及點樣儀器探針的制備：標記方法雜交：雜交液、雜交溫度、洗滌條件的選擇掃描儀:激光

CCD分析軟件的開發(fā)基因芯片的制備雜交檢測數(shù)據(jù)分析2023/7/7SuzhouUniversity35一、定義

指采用光導(dǎo)原位合成或微量點樣等方法，將大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細胞等生物樣品有序地固化于支持物的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標記的待測生物樣品中的靶分子雜交，通過特定的儀器對雜交信號的強度進行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。2023/7/7SuzhouUniversity36二、生物芯片的種類DNA芯片：又稱DNA芯片,是根據(jù)核酸雜交的原理，將大量探針分子固定于支持物上，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布來進行分析。蛋白質(zhì)芯片：利用抗體與抗原特異性結(jié)合即免疫反應(yīng)的原理，將蛋白質(zhì)分子（抗原或抗體）結(jié)合到固相支持物上，形成蛋白質(zhì)微陣列，即蛋白質(zhì)芯片。其它芯片：2023/7/7SuzhouUniversity37三、發(fā)展過程Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray2023/7/7SuzhouUniversity38四、芯片的制備

（一）支持物的預(yù)處理1、實性材料：硅芯片、玻片和瓷片需進行預(yù)處理，使其表面衍生出羥基、氨基活性基團。2、膜性材料：聚丙烯膜、尼龍膜、硝酸纖維膜，通常包被氨基硅烷或多聚賴氨酸2023/7/7SuzhouUniversity39(二)芯片制備方法

（1）原位合成（insitusynthesis）①光導(dǎo)原位合成法

②原位噴印合成③分子印章多次壓印合成（2）點樣法2023/7/7SuzhouUniversity40

原位合成(InSituSynthesis)2023/7/7SuzhouUniversity41合成后交聯(lián)方式：預(yù)先合成DNA或制備基因探針然后打印到芯片上探針的制備：已克隆的基因片段PCR，RT-PCR擴增的基因片段人工合成的DNA片段單鏈、雙鏈、DNA或RNA均可作為探針2023/7/7SuzhouUniversity42五、樣品的準備樣品的分離純化DNA,mRNA擴增PCR,RT—PCR，固相PCR標記等過程熒光標記（常用Cy3、Cy5），生物素、放射性標記2023/7/7SuzhouUniversity43六、分子雜交樣品與DNA芯片上的探針陣列進行雜交。與經(jīng)典分子雜交的區(qū)別：雜交時間短，30分鐘內(nèi)完成可同時平行檢測許多基因序列影響雜交反應(yīng)的因素：鹽濃度、溫度、反應(yīng)時間、DNA二級結(jié)構(gòu)2023/7/7SuzhouUniversity44肽核酸(peptidenucleicacid,PNA)——是一類以氨基酸替代糖-磷酸主鏈的DNA類似物，骨架由重復(fù)的N-甘氨酸通過酰胺鍵相連構(gòu)成，堿基則通過甲叉碳?；c骨架相連。PNA分子內(nèi)不會形成二級、三級結(jié)構(gòu)DNA與PNA雜交不需要鹽離子2023/7/7SuzhouUniversity45七、檢測分析激光激發(fā)使含熒光標記的DNA片段發(fā)射熒光激光掃描儀或激光共聚焦顯微鏡采集各雜交點的信號軟件進行進行圖象分析和數(shù)據(jù)處理2023/7/7SuzhouUniversity46

2023/7/7SuzhouUniversity47DNA測序；雜交測序（SBH）基因表達分析：基因組研究：作圖、測序、基因鑒定、基因功能分析基因診斷：尋找和檢測與疾病相關(guān)的基因及在RNA水平上檢測致病基因的表達藥物研究與開發(fā)：八、DNA芯片技術(shù)的應(yīng)用2023/7/7SuzhouUniversity48cDNAmicroarrayexpressionpatternsofsmall(S)andlarge(L)neurons2023/7/7SuzhouUniversity49基因表達譜（geneexpressionpattern)BiologicalSampleFunctionalInformation紅色上調(diào)黃色不變綠色下調(diào)2023/7/7SuzhouUniversity50基因芯片的優(yōu)點：高通量大規(guī)模高度平行性快速高效高靈敏度高度自動化2023/7/7SuzhouUniversity51第三節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)

PolymeraseChainReaction2023/7/7SuzhouUniversity52PCR技術(shù)polymerasechainreactionPCR即聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，是指利用耐熱DNA聚合酶的反復(fù)作用，通過變性-延伸-復(fù)性的循環(huán)操作，在體外迅速將DNA模板擴增數(shù)百萬倍的一種操作技術(shù)。理論上可在2小時內(nèi)將一個DNA分子擴增到106-109倍，從而大大提高對其進行分析研究的速度。

2023/7/7SuzhouUniversity532023/7/7SuzhouUniversity54PCRStep1變性Step2退火2023/7/7SuzhouUniversity55ACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAAStep3:Extension延伸72°CCGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTaqPolymeraseTaqPolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA2023/7/7SuzhouUniversity56一、原理：1)合成待擴增區(qū)域兩端已知序列，與模板DNA互補的寡核苷酸特異性引物，引物的序列決定擴增片段的長度；2)反應(yīng)體系：DNA模板，dNTP，TaqDNA聚合酶，buffer3)反應(yīng)程序：變性(94~95oC)

復(fù)性延伸(37~55

oC)

(70~72oC)72oC延伸10min30-35cycles

DNA擴增100萬倍2023/7/7SuzhouUniversity57PCR擴增2023/7/7SuzhouUniversity58模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶dNTPsMg2+

二、PCR體系基本組成成分2023/7/7SuzhouUniversity591、引物設(shè)計原則1）引物的特異性

2）避開產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)區(qū)

3）長度

寡核苷酸引物長度為15~30bp，一般為20~27mer。

4）G+C含量

一般為40%~60%。Tm=4（G+C）+2（A+T）5）堿基礎(chǔ)隨機分布：3′端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C

6）引物自身，引物之間無二級結(jié)構(gòu)

8）引物的3′端：不可以修飾

9）引物的5′端：可以被修飾，包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛。

10）密碼子的簡并2023/7/7SuzhouUniversity602、Taq酶普通Taq酶PfuTaq酶

Pfu能糾正DNA擴增（PCR）過程中產(chǎn)生的錯誤，而傳統(tǒng)的TaqDNAPolymerase,TthDNAPolymerase及它們的突變體如AmpliTaq,KlenTaq等都不能。它比TaqDNAPolymerase及突變體低10倍，比Vent和Pwo低2-4倍，比UlTma低30倍。

KodTaq酶

是toyobo公司專利產(chǎn)品，世界最高保真水平的PCR酶。長片段Taq酶2023/7/7SuzhouUniversity61三、PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C如何確定PCR循環(huán)參數(shù)？2023/7/7SuzhouUniversity62四、PCR的主要用途（一）目的基因的克隆

PCR技術(shù)是迅速獲得一定量的目的基因以用于基因克隆的有效方法之一。主要采用的方法有：與反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接從組織和細胞的mRNA獲得已知目的基因片段；利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板，獲得已知的目的基因；利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得具有同源性的DNA片段；利用隨機引物從cDNA文庫或基因組文庫中隨機獲得目的基因。2023/7/7SuzhouUniversity63（二）基因的體外突變采用隨意設(shè)計的引物，在體外對基因進行嵌合、缺失、點突變等改造。（三）DNA和RNA的微量分析由于PCR技術(shù)具有高度敏感性，故可用于微量DNA和RNA的分析檢測。（四）DNA序列測定（五）基因突變分析2023/7/7SuzhouUniversity64PCR特點及應(yīng)用：優(yōu)點：（1）特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定可靠、快速；（2）微量的模板DNA即可擴增大量產(chǎn)物。應(yīng)用：（1）基因組DNA分析；（2）遺傳物質(zhì)的鑒定；（3）遺傳病的診斷。缺點：（1）需靶DNA序列的信息；（2）產(chǎn)物短小，DNA復(fù)制不精確。2023/7/7SuzhouUniversity65五、幾種重要的PCR衍生技術(shù)（一）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（二）反向PCR（三）RAPDPCR（四）原位PCR技術(shù)（五）實時PCR技術(shù)2023/7/7SuzhouUniversity66PCR相關(guān)技術(shù)：

1）增效PCR（boosterPCR）

當(dāng)擴增少于1000拷貝的模板DNA時會遇到兩個問題：一是形成引物二聚體，一是非特異擴增.消耗了引物和酶，而特異擴增片段產(chǎn)量降低。

對于這種情況，可設(shè)置二步PCR，先用較低濃度的引物進行初級PCR，此時由于引物少，形成產(chǎn)物二聚體的可能減少，但它并不影響靶序列的擴增，只是由于引物少產(chǎn)量不高。約經(jīng)15~20個循環(huán)后補充引物量，以初級PCR產(chǎn)物為模板進行擴增，靶序列的產(chǎn)量將相應(yīng)增加。2023/7/7SuzhouUniversity672)巢式PCR（nestPCR）

此時也是進行二步PCR，與上面不同的是，第二級PCR需另行設(shè)置反應(yīng)體系，并應(yīng)用另外的PCR引物，此時引物的位置位于初級PCR引物的內(nèi)側(cè)，用初級PCR產(chǎn)物做模板，進行第二步PCR，這樣只有初級PCR中特異的擴增片段才能被二級引物擴增。除了達到增效PCR同樣的目的外，還提高了最終產(chǎn)物的特異性。2023/7/7SuzhouUniversity68在同一PCR體系中加入若干對PCR引物，如果這些引物的退火溫度相近，并且所覆蓋的區(qū)域不重疊，這樣的反應(yīng)體系可同時擴增多個DNA片段。多重PCR常用來檢測同一基因的多個外顯子的缺失，或在檢測缺失設(shè)置內(nèi)對照。3)多重PCR2023/7/7SuzhouUniversity694）RT-PCRRT-PCR是以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速擴增（達ng~μg水平），大大提高mRNA的檢出靈敏度。應(yīng)用于基因表達與調(diào)控的研究。2023/7/7SuzhouUniversity70RT-PCR需注意RACE技術(shù)2023/7/7SuzhouUniversity71RT-PCRcDNA2023/7/7SuzhouUniversity725）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SingleStrandConformationPolymorphism,SSCP）是指單鏈DNA由于堿基序列不同可引起構(gòu)象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不同。據(jù)此，可用于DNA中單個堿基的替代，微小的缺失或插入的檢測。通常與PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，稱為PCR-SSCP技術(shù)。在疑有突變的DNA片段附近設(shè)計一對引物，進行PCR擴增，其產(chǎn)物經(jīng)甲酰胺等變性，并在聚丙烯酰胺凝膠中電泳（中性膠），突變所引起的DNA構(gòu)象差異將表現(xiàn)為電泳帶位置的差異，從而作出判斷。2023/7/7SuzhouUniversity73PCR-SSCP過程2023/7/7SuzhouUniversity746）差異展示反轉(zhuǎn)錄PCR

(differentialdisplayreversetranscriptasePCR，DDRT-PCR)LiangP.(1992)建立此法，用來分離變異細胞中的特異RNA，它可用來由少量mRNA產(chǎn)生cDNA,以鑒別細胞間的表達差異。DDRT-PCR的關(guān)鍵是采用經(jīng)修飾的寡聚dT；引物用于反轉(zhuǎn)錄，即polyA+mRNA在引物的3`端的雙核苷酸的差異退火。

2023/7/7SuzhouUniversity752023/7/7SuzhouUniversity762023/7/7SuzhouUniversity77反向PCR2023/7/7SuzhouUniversity787)real-timePCRA、PCR動力學(xué)曲線和四個階段2023/7/7SuzhouUniversity79B、PCR理論方程2023/7/7SuzhouUniversity80C、起點定量與終點定量2023/7/7SuzhouUniversity81D、什么是CT值？2023/7/7SuzhouUniversity82E、什么是閾值？2023/7/7SuzhouUniversity83F、什么是定量——標準曲線方法2023/7/7SuzhouUniversity84G、CT值對[DNA]0作圖2023/7/7SuzhouUniversity85H、定量PCR的化學(xué)原理2023/7/7SuzhouUniversity86探針信號=DNA拷貝數(shù)2023/7/7SuzhouUniversity87real-timePCR引物的設(shè)計原則擴增產(chǎn)物長度在80-150bp。引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。產(chǎn)物長度一般在15-30堿基之間。

G+C含量在40%-60%之間。堿基要隨機分布。引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。引物5’端可以修飾。引物3’端不可修飾。引物3’端要避開密碼子的第3位。

2023/7/7SuzhouUniversity88SYBRGreen染料2023/7/7SuzhouUniversity892023/7/7SuzhouUniversity90IReal-timePCR方法應(yīng)用絕對定量(AbsoluteQuantification，AQ)

病原體檢測轉(zhuǎn)基因食品檢測基因表達研究相對定量(RelativeQuantification，RQ)

基因在不同組織中的表達差異藥物療效考核耐藥性研究2023/7/7SuzhouUniversity91絕對定量通過標準品定量絕對定量的標準樣品：已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA，做系列稀釋。標準樣品的種類：?含有和待測樣品相同擴增片段的克隆質(zhì)粒?含有和待測樣品相同擴增片段的cDNA?PCR的產(chǎn)物2023/7/7SuzhouUniversity92絕對定量：從熒光到拷貝數(shù)2023/7/7SuzhouUniversity93相對定量通過內(nèi)標定量內(nèi)標（EndogenousControl）通常是β-actin、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)基因等看家基因在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小內(nèi)標定量結(jié)果代表了樣本中所含細胞或基因組數(shù)量2023/7/7SuzhouUniversity94相對定量：參照因子Calibrator2023/7/7SuzhouUniversity95相對定量分析方法-ΔΔCt前提：目標序列和內(nèi)參序列的擴增效率接近100％且偏差在5％以內(nèi)

1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標基因的CT值：

ΔCT（test)=CT（target,test)-CT（ref,test)ΔCT（calibrator)=CT（target,calibrator)-CT（ref,calibrator)2、用校準樣本的ΔCT值歸一試驗樣本的ΔCT值：

ΔΔCT=ΔCT（test)-ΔCT（calibrator)3、計算表達水平比率：

2–ΔΔCT=表達量的比值2023/7/7SuzhouUniversity96ROXTM參比或者校正染料（referencedye，passivedye）常用的是ROXTM參比染料的作用是標準化熒光定量反應(yīng)中的非PCR震蕩，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個穩(wěn)定的基線?，F(xiàn)在很多公司已經(jīng)把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反應(yīng)曲線良好或已經(jīng)優(yōu)化好反應(yīng)體系，也可以不加ROXTM染料校正。

2023/7/7SuzhouUniversity97RnRn（Normalizedreporter）是熒光報告基團的熒光發(fā)射強度與參比染料的熒光發(fā)射強度的比值。

△Rn：△Rn是Rn扣除基線后得到的標準化結(jié)果（△Rn=Rn-基線）。

2023/7/7SuzhouUniversity98第三節(jié)

核酸序列分析

NucleicAcidSequenceAnalysis2023/7/7SuzhouUniversity99核酸序列分析的基本原理化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbert法)DNA鏈的末端合成終止法(Sanger法)2023/7/7SuzhouUniversity100一、化學(xué)裂解法(Maxam-Gilbert法)基本原理基于某些化學(xué)試劑可以使DNA鏈在1個或2個堿基處發(fā)生專一性斷裂的特性，精確地控制反應(yīng)強度，使一個斷裂點僅存在于少數(shù)分子中，不同分子在不同位點斷裂，從而獲得一系列大小不同的DNA片段，將這些片段經(jīng)電泳分離。分析前，用同位素標記DNA的5′末端，經(jīng)放射自顯影即可在X膠片上讀出DNA鏈的序列。2023/7/7SuzhouUniversity101化學(xué)裂解法的示意圖2023/7/7SuzhouUniversity102二、DNA鏈末端合成終止法2023/7/7SuzhouUniversity103目錄2023/7/7SuzhouUniversity104三、DNA自動測序采用熒光替代放射性核素標記是實現(xiàn)DNA序列分析自動化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標記四種雙脫氧核苷酸，然后進行Sanger測序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細管電泳）分離后，通過四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。2023/7/7SuzhouUniversity105DNA自動測序結(jié)果舉例目錄四、高通量測序現(xiàn)有主要高通量測序儀開發(fā)商測序儀品牌技術(shù)原理開發(fā)商Roche454焦磷酸測序RocheIlluminaSolexa邊合成邊測序IlluminaABISOLiD基于磁珠的大規(guī)模并行連接測序ABIHelicos單分子熒光測序HelicosIonTorrent半導(dǎo)體測序ABISMRT單分子實時測序PacificBio高通量測序流程文庫擴增低通量ASanger測序B高通量測序并行測序

高通量無需建立文庫，

兩端加測序接頭PCR擴增IlluminaSolexa合成測序SequencebySynthesize基本原理ClonalSingleMoleculeArrays

單分子克隆~1000moleculesper~1μmcluster

~1000clustersper100μmsquare~40millionclustersperexperimentPrepareDNAfragmentsLigateadaptersAttachsinglemoleculestosurfaceAmplifytoformclusters20micronsSequenceReversibleTerminatorChemistry

可逆終止反應(yīng)OPPPHNNOOcleavagesitefluor3’blockNextcycleIncorporationDetectionDeblock;fluorremovalODNAHNNOO3’O5’free3’endXOHAll4labellednucleotidesin1reactionSequencing-by-Synthesis(SBS)

5’GTCAGTCAGTCAGT3’5’CAGTCATCACCTAGCGTA FirstbaseincorporatedCycle1: Addsequencingreagents Removeunincorporatedbases DetectsignalCycle2-n:Addsequencingreagentsandrepeat1、每輪測序反應(yīng)加入四種帶有熒光標記的dNTP，末端帶有可以被去除的阻斷基團2、每輪反應(yīng)只能整合一個核苷酸，儀器讀取相應(yīng)的熒光信號3、信號讀取結(jié)束，用化學(xué)方法去除阻斷基團，進行下一輪測序反應(yīng)123789456TTTTTTTGT…TGCTACGAT…Theidentityofeachbaseofaclusterisreadofffromsequentialimages根據(jù)每個點每輪反應(yīng)讀取的熒光信號序列，轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的DNA序列BasecallingfromtherawdataSolexa測序WorkflowIlluminaSolexa橋式PCRdioldiol 1stcycledenaturation1stcycleannealingdioldioln=35total1stcycleextensiondioldioldioldiol2ndcycledenaturation2ndcycleannealingdioldioldioldioldioldiol2ndcycleextensionABISOLiD連接法測序SequencebyLigation基本原理文庫制備：微珠單分子克隆1024種8堿基探針4色熒光，4種雙核苷酸，每色熒光有256個探針(4^6)SOLiD利用探針的連接反應(yīng)讀取模板的DNA序列連接法測序

（一）每個探針進行檢測的兩個堿基后面有三個匹配堿基，因此一條測序引物讀取的序列是不完整的測序引物與adapter退火探針連接，檢測熒光切除熒光基團第二輪探針連接，檢測熒光切除熒光基團連接法測序

（二）測序引物沿著Adapter移動5次，確保每個位點都被檢測連接法測序

（三）0位置是Adapter的最后一個堿基，因此只檢測一次，該堿基是進行解碼所必須的。ABISOLiD測序原理454Pyrosequencing基于磁珠的焦磷酸測序：A磁珠制備設(shè)備B454測序儀C454測序原理2023/7/7SuzhouUniversity1245'-磷酰硫酸（APS）454測序流程454測序流程與BaseCalling三種平臺的技術(shù)差異平臺454SolexaSOLiDPCR磁珠乳化PCR橋式PCR磁珠乳化PCR測序載體磁珠玻片玻片測序方式焦磷酸、熒光可逆終止物、熒光連接酶、熒光三種平臺的效能參數(shù)差異平臺讀長通量周期SolexaHiSeq2000Single-end:1x35bpPaired-end:2x50bpPaired-end:2x100bp25Gb/d~1.5d~4d~8dSOLiD5500xlSingle-end:75bpPaired-end:75x35bpMate-pair:60x60bp20–30Gb/d1d/1lane7d/12lane7d/12lane454GSFLX400-600bp400–600Mb/Run10hAdvantage&disadvantage454sequencing讀取長度大，400bp可以對未知基因組進行從頭測序denovosequencing當(dāng)遇到polymer時，如AAAAAA等，熒光強度和堿基個數(shù)不成線性關(guān)系，判定重復(fù)堿基個數(shù)有困難Solexasequencing高度自動化的系統(tǒng)讀取片段多，適合進行大量小片段的測序，如microRNAprofiling基于可逆反應(yīng)，隨反應(yīng)輪數(shù)增加，效率降低，信號衰減，讀取序列較短，給denovosequencing拼接帶來困難SOLiDsequencing每個堿基讀取兩次非常高的準確性，特別是對于SNP的檢測靈活的系統(tǒng)，完善的磁珠編碼系統(tǒng)，可以進行樣品的pooling，分割測序區(qū)域讀取長度受連接反應(yīng)的輪數(shù)限制，給denovosequencing拼接帶來困難高通量測序的應(yīng)用Denovo

測序基因深度測序（genomere-sequencing）轉(zhuǎn)錄組深度測序（transcriptomere-sequencing）DigitalexpressionprofilingChIP-seqMethy-seq2023/7/7SuzhouUniversity131基因文庫

GeneLibrary第四節(jié)2023/7/7SuzhouUniversity132基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)基因文庫(genelibrary)是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。2023/7/7SuzhouUniversity133基因組DNA文庫cDNA文庫2023/7/7SuzhouUniversity134第一輪篩選第二輪篩選第三輪篩選基因組文庫篩選結(jié)果舉例2023/7/7SuzhouUniversity135篩選cDNA文庫1.合成寡核苷酸探針；由于密碼子的兼并性我們無法確定一個肽鏈的cDNA序列，但我們可采取以下策略：（1）.兼并寡核苷酸探針；設(shè)計一組涵蓋可編碼一段給定氨基酸序列所有可能的DNA探針，一般使用最短長度(14~17Nt)（2）.用每個氨基酸最常用的密碼子合成單一的較長的DNA探針(40~60Nt),不使用CpG,因它出現(xiàn)得少。此探針雖不會和cDNA完全配對，但在非嚴格條件下可雜交，并足以檢出靶DNA。2023/7/7SuzhouUniversity1362.抗體探針：

用標記的抗體探針和印有細菌裂解碎片的纖維膜雜交。關(guān)鍵是抗體的質(zhì)量，它必須能識別結(jié)合變性蛋白(即能在Western印跡上產(chǎn)生強信號)3.扣除探針(subtractedcDNAprobe)2023/7/7SuzhouUniversity137抑制扣除雜交(suppressionsubtractionhybridization,SSH)SiebertP.等于1992年建立的，此法作為一種克隆差異表達基因轉(zhuǎn)錄的方法。先啟動過量的驅(qū)動cDNA序列和2個標準的待測cDNA池快速反復(fù)結(jié)合，隨著驅(qū)動-待測雜交反應(yīng)，混合2個待測池2023/7/7SuzhouUniversity1382023/7/7SuzhouUniversity1392023/7/7SuzhouUniversity140全長cDNA邊界序列文庫的構(gòu)建又稱基因鑒別信號(GIS,geneindentifacitionsignature)。SAGE技術(shù)與全長cDNA克隆相結(jié)合，專門分離全長cDNA5’端和3’端各20個堿基序列，建立包含所有cDNA成員未端的多連體GIS文庫。2023/7/7SuzhouUniversity141

SAGESAGE（serialsanalysisofgeneexpression）基因表達系列分析

1995Velculescu及其同事同年創(chuàng)立2023/7/7SuzhouUniversity142SAGE特點：進行轉(zhuǎn)錄物組研究，也就是轉(zhuǎn)錄水平的研究；通過快速和詳細分析成千上萬個EST來尋找出表達豐度不同的SAGE標簽序列，從而接近完整地獲得基因組的表達信息；

SAGE區(qū)別于差異顯示、消減雜交等其它技術(shù)的主要特點是可用于尋找那些較低豐度的轉(zhuǎn)錄物，最大限度地收集基因組的基因表達信息，這使之成為從總體上全面研究基因表達、構(gòu)建基因表達圖譜的首選策略；SAGE可用于在不同環(huán)境、不同生理狀態(tài)及不同生長階段的細胞和組織表達圖譜構(gòu)建，對不同狀態(tài)下基因表達水平的定量或定性比較，特別是對疾病組織與正常組織的比較發(fā)展迅速。

2023/7/7SuzhouUniversity143SAGE技術(shù)的主要理論依據(jù)：首先，一段來自于任一轉(zhuǎn)錄本特定區(qū)域的“標簽”(Tag)，即長度僅10～14bp的短核苷酸序列，就已包含了足夠的信息以特異性地確定該轉(zhuǎn)錄本。例如：一個10堿基的序列能有410=1048576種不同的排列組合，而人類基因組據(jù)估計僅編碼80000種轉(zhuǎn)錄本，因此在理論上每一個10堿基標簽就能夠代表一種轉(zhuǎn)錄本的特征序列。通過簡單的方法將這些標簽串聯(lián)在一起，形成大量多聯(lián)體（concatemer），對每個克隆到載體的多聯(lián)體進行測序，并應(yīng)用SAGE軟件分析，可確定表達的基因種類，并可根據(jù)標簽出現(xiàn)的頻率確定基因的表達豐度（abundance）。CATGSAGETagAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTAverage256basepairs2023/7/7SuzhouUniversity144CATGSAGETag3SAGETag4SAGETag1SAGETag2CATGSAGETag5SAGETag6CATG將短片段兩兩隨機配對，形成雙標簽體(Ditag)，在標簽的種類、數(shù)量極大豐富的情況下，完全相同的雙標簽體出現(xiàn)的概率趨近于零。將這些雙標簽體相互連接、集中形成長的DNA分子，對其進行測序?qū)⒛艿玫酱罅窟B續(xù)的單個標簽，并能以連續(xù)的數(shù)據(jù)形式進行處理。這樣就可對數(shù)以千計的mRNA轉(zhuǎn)錄本進行批量分析。而在數(shù)據(jù)處理時將重復(fù)出現(xiàn)的雙標簽體剔除，即可避免由于PCR反應(yīng)的非均一化擴增而引入的數(shù)據(jù)偏差；同時，各轉(zhuǎn)錄本的表達水平也就可以用特定標簽被測得的次數(shù)來進行精確定量了。2023/7/7SuzhouUniversity1451.將5μg含有oligodT（引物）的磁珠與RNA混合。2.合成雙鏈cDNA。

3.用NlaⅢ(CATG)酶消化形成一條鏈末端有標簽的產(chǎn)物。

4.將樣品分成兩份，連接成含有識別序列的產(chǎn)物(接頭A和接頭B)，以備用BsmF1(GGGAC)消化。5.用MmeI(TCCRAC)切割每一個樣品形成約60bp的標簽。SAGE步驟2023/7/7SuzhouUniversity1466.延伸5秒，連接成約130bp的雙鏈標簽。

7.PCR擴增。8.用NlaⅢ酶切130bp產(chǎn)物釋放34bp雙鏈標簽。9.連接片斷形成串聯(lián)體。

10.克隆到pZErO-1+里，并測序。

2023/7/7SuzhouUniversity147SAGE實例2023/7/7SuzhouUniversity148疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定

CloningandIdentificationofDiseaseRelativeGenes第五節(jié)2023/7/7SuzhouUniversity149克隆疾病相關(guān)基因的策略（一）功能性克隆(functionalcloning)（二）定位克隆(positionalcloning)（三）非定位候選基因克隆策略(position-independentcandidategeneapproaches)（四）定位候選基因克隆策略(positionalcandidategeneapproaches)2023/7/7SuzhouUniversity1501定義：從對一種致病基因的功能的了解出發(fā)，克隆該致病基因。（一）功能性克隆2應(yīng)用：生化機制已明確、基因表達產(chǎn)物較易得到部分純化的遺傳性疾病。3克隆方式①利用特異性抗體篩選表達型cDNA文庫；②根據(jù)已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探針，篩選cDNA文庫。2023/7/7SuzhouUniversity151（二）定位克隆1、定義從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因。2、系統(tǒng)的定位克隆工作①遺傳學(xué)分析(確定致病基因染色體定位)：交換分析、連鎖不平衡分析②分子生物學(xué)分析：染色體異常(缺失、易位等)分析、基因文庫的篩選與基因克隆2023/7/7SuzhouUniversity152（三）非定位候選基因克隆策略

由于基因組作圖的完成和分子病理學(xué)的發(fā)展，人們可以不依靠染色體定位，直接根據(jù)病理學(xué)變化和對各種基因產(chǎn)物功能的了解，預(yù)測出候選致病基因。2023/7/7SuzhouUniversity153（四）定位候選基因克隆策略當(dāng)致病基因的染色體定位確認后，人們可以利用因特網(wǎng)上的基因網(wǎng)站所提供基因序列數(shù)據(jù)，鑒定出候選致病基因。2023/7/7SuzhouUniversity154第六節(jié)

遺傳修飾動物模型的建立及應(yīng)用TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalModel2023/7/7SuzhouUniversity155轉(zhuǎn)基因技術(shù)（動物）采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精卵細胞或胚胎干細胞，然后將細胞導(dǎo)入動物子宮，使之發(fā)育成個體。

轉(zhuǎn)基因——被導(dǎo)入的目的基因轉(zhuǎn)基因動物(transgenicanimal)——目的基因的受體動物一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)2023/7/7SuzhouUniversity1562023/7/7SuzhouUniversity1572023/7/7SuzhouUniversity1582023/7/7SuzhouUniversity159核轉(zhuǎn)移技術(shù)

即動物整體克隆技術(shù)，將動物體細胞核全部導(dǎo)入另一個體的去胞核的受精卵內(nèi)，使之發(fā)育成個體，即克隆(clone)。二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)2023/7/7SuzhouUniversity160基因剔除技術(shù)也稱基因靶向(genetargeting)滅活，有目的去除動物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。三、基因剔除技術(shù)2023/7/7SuzhouUniversity161四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用建立動物模型①單基因決定疾病模型基因剔除(knockout)獲得性突變(gain-of-functionmutation)過表達(over-expression)、抑制表達(knockdown)、knockin②多基因決定疾病模型2023/7/7SuzhouUniversity162第七節(jié)

生物芯片技術(shù)BiologicalChipTechnology2023/7/7SuzhouUniversity163DNA芯片(DNAchip)cDNA芯片(cDNAchip)是指將許多特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上。一、基因芯片基因芯片(genechip)2023/7/7SuzhouUniversity1642023/7/7SuzhouUniversity165DNA微陣列2023/7/7SuzhouUniversity166是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)2023/7/7SuzhouUniversity167第八節(jié)蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)

ResearchTechnologyofInteractionofProtein2023/7/7SuzhouUniversity168蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白復(fù)合物是細胞各種基本功能的主要完成者。幾乎所有的重要生命活動，包括DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分泌、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝等等，都離不開蛋白質(zhì)之間的相互作用。1、蛋白質(zhì)之間相互作用研究的重要性2023/7/7SuzhouUniversity169酵母雙雜交各種親和分析（親和色譜、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選等等2、常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)2023/7/7SuzhouUniversity1701）酵母雙雜交技術(shù)2023/7/7SuzhouUniversity1712）酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用（一）分析已知蛋白之間的相互作用（二）對蛋白質(zhì)功能域的分析（三）分析未知蛋白相互作用（四）繪制蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)圖譜（五）在藥物設(shè)計中的應(yīng)用2023/7/7SuzhouUniversity1722）熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）是比較分子間距離與分子直徑的有效工具。FRET對距離和熒光基團的空間取向有高度敏感性，可以通過熒光能量轉(zhuǎn)移效率的測量，觀察生物分子間相互作用的改變情況，研究各種涉及分子間距離變化的生物現(xiàn)象，在蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用研究、酶活性分析等方面有很重要的應(yīng)用。FRET發(fā)生的基本條件是：供體D和受體A的距離必須達到一定的數(shù)量級（1-10nm）；受體的吸收光譜必須與供體的發(fā)射光譜相重疊；供體和受體能量轉(zhuǎn)移偶極子的方向必須近似平行。2023/7/7SuzhouUniversity1733）噬菌體展示很多重要分子間相互作用是發(fā)生在蛋白質(zhì)(如細胞表面受體)和一種擴散性小分子(如配基)之間,酵母雙雜交顯得無能為力；對這一類受體蛋白cDNA文庫的篩選GeorgeSmith等發(fā)展了一種方法，用M13表達噬菌體衣殼融合蛋白,這種蛋白可以共價連接的方式附著在塑料盤子的底部。由于融合蛋白是在噬菌體的外側(cè)表達的，是否能結(jié)合到塑料盤子上就可將噬菌體分開。2023/7/7SuzhouUniversity174方法：(1)將隨機的多肽DNA彈夾(randompeptideDNAcassette)插入到基因III的編碼序列中，使在噬菌體顆粒的表面出現(xiàn)各種不同的蛋白質(zhì)和多肽，即多肽文庫。(2)然后通過免疫吸附或親和層析分離出特定的目標噬菌體。(3)擴增陽性噬菌體。(4)用ELISAs進行分析鑒定。2023/7/7SuzhouUniversity1752023/7/7SuzhouUniversity1762023/7/7SuzhouUniversity177第九節(jié)報道基因(Reportergenes)通過檢測mRNA轉(zhuǎn)錄本的水平或蛋白質(zhì)的水平來了解基因的表達情況總是不方便的。如通過檢測大量的缺失和點突變及轉(zhuǎn)染細胞來鑒別基因的調(diào)控順序就更不方便。利用報道基因可較容易地達到此目的。報道基因能用來鑒定細胞，組織或順式元件的短暫作用，或它對外來刺激(如激素)的反應(yīng)。2023/7/7SuzhouUniversity1781、報道基因的條件報道告基因編碼的蛋白活性不能和靶細胞中已存在的某種蛋白相似。所編碼的酶的活性測定應(yīng)快速，簡便，靈敏，特異，且重復(fù)性好。報道蛋白的功能不會干擾細胞的正?；钚?，如信號轉(zhuǎn)遞，代謝速率等。2023/7/7SuzhouUniversity1792、體外報道基因分析的方法(1)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)它催化乙?；鶑囊阴］o酶A上轉(zhuǎn)移到氯霉素上，使氯霉素被乙?；Щ?，籍此來保護細菌。幾乎所有的真核細胞中都沒有相似的酶的活性。從轉(zhuǎn)染細胞的提取物中用14C標記的氯霉素溫育轉(zhuǎn)染細胞的提取物和薄層層析可以很容易地分析CAT的活性。但本法用同位素價格昂貴，CAT的穩(wěn)定性也不理想。2023/7/7SuzhouUniversity180pBasicpBasicpAMGpAMGpCMVpCMV巨細胞病毒多克隆位點2023/7/7SuzhouUniversity181(2)熒光素酶(Luciferase,luc)luc基因來自熒火蟲(Photinuspyralia),Luc的底物是熒光素，催化反應(yīng)需ATP，Mg2+。用一種特殊的設(shè)計的發(fā)光計可量度熒光素經(jīng)ATP－依賴性Luc催化發(fā)出的熒光。2023/7/7SuzhouUniversity182

(3)-葡糖醛酸酶(-glucuronidase,GUS)GUS是一種細菌的酶，在植物和哺乳動物細胞中都可用作報道基因，但因大多數(shù)植物缺乏內(nèi)源性葡糖醛酸酶，故更適合用GUS。它不會影響高等植物的生長發(fā)育。GUS的優(yōu)點之一是有多種分析方法：①用X－gluc為底物對表達GUS的細胞和組織進行組織化學(xué)染色。②用4－MUG(4-甲基熒光素－－D－半乳糖苷)作底物進行GUS熒光分析，此法較靈敏。③以金剛烷基1,2-二氧雜環(huán)芳香基葡糖醛酸為底物可進行GUS化學(xué)發(fā)光分析。其靈敏度比②高100倍。2023/7/7SuzhouUniversity183(4)分泌型堿性磷酸酶(SEAP)SEAP編碼人胎盤堿性磷酸酶(PLAP)的一個截短的形式，它缺乏錨順序，因此可從被轉(zhuǎn)染的細胞中分泌出來，故可用少量的培養(yǎng)液進行分析。培養(yǎng)液中檢測到的SEAP的活性水平和細胞內(nèi)SEAPmRNA及其蛋白質(zhì)的濃度變化成正比。

SEPA具有極大的熱穩(wěn)定性和對磷酸酶抑制劑(L-同型精氨酸)有抗性，因此可用65℃預(yù)處理樣品或加抑制劑共溫育來除去內(nèi)源性堿性磷酸酶活性。2023/7/7SuzhouUniversity184SEAP的檢測：①以對硝基苯磷酸為底物進行比色分析；此法快速,簡便,價廉,但靈敏度差，動力學(xué)線性范圍窄；②以D-熒光素-O-磷酸鹽的水解為基礎(chǔ)的SEAP兩步分析法可提高靈敏度；③用化學(xué)發(fā)光的堿性磷酸酶低物(如1,2-二氧雜環(huán)丁烷，CSPD)進行分析最靈敏。CSPD的去磷酸化產(chǎn)生一種持續(xù)的“增長”型熒光，可持續(xù)60分鐘之久，易于用發(fā)光計或閃爍計數(shù)儀檢測。2023/7/7SuzhouUniversity185SEAP的優(yōu)點：①不需制備細胞裂解物；②通過反復(fù)收集同一培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)液很容易進行基因表達的動力學(xué)研究；③被轉(zhuǎn)染細胞在檢測SEAP時不受影響，并保持完好，以備進一步研究用；④培養(yǎng)液中幾乎沒有由內(nèi)源性堿性磷酸酶活性產(chǎn)生的背景⑤樣品的收集和分析能在96孔微量滴定板上自動進行。2023/7/7SuzhouUniversity186(5)人類生長激素(hGH)hGH由垂體前葉的促生長細胞分泌，其表達范圍的局限性適合作為大多數(shù)哺乳動物的報道基因，其優(yōu)點同SEAP，但靈敏度低，并需用同位素，所以hGH的測定常作為內(nèi)部對照，以校正轉(zhuǎn)染效率。2023/7/7SuzhouUniversity187(6)?-半乳糖苷酶這種細菌酶它可使X-gal裂解，產(chǎn)生蘭色的產(chǎn)物，易于鑒別。可用鄰硝基苯-?-D半乳吡喃糖苷(ONPG)進行比色分析；也可用