基因克隆的相關(guān)質(zhì)粒載體

載體通論（一）基本概念載體：在基因工程中，用于承載、克隆、轉(zhuǎn)移目的基因(DNA片段)，能自我復(fù)制的DNA分子。（二）分類(lèi)

克隆載體表達(dá)載體質(zhì)粒載體噬菌體載體人工染色體按載體功能分按載體性質(zhì)分在基因克隆時(shí)：將目的片段轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制克隆——克隆載體；在基因?qū)胧荏w時(shí)：將目的片段轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中并進(jìn)行使之表達(dá)——轉(zhuǎn)化載體或表達(dá)載體。常用基因工程載體有：細(xì)菌質(zhì)粒(克隆)；λ噬菌體(克隆)；柯斯質(zhì)粒(克隆)；穿梭質(zhì)粒(克隆/表達(dá))；細(xì)菌人工染色體(克隆/表達(dá))；酵母人工染色體(克隆/表達(dá))；Ti質(zhì)粒及其衍生載體(轉(zhuǎn)化)。表達(dá)體載體宿主第一代原核生物表達(dá)體系質(zhì)粒、噬菌體細(xì)菌第二代酵母表達(dá)體系穿梭質(zhì)粒酵母第三代哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)體系病毒、脂質(zhì)體培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞第四代基因直接導(dǎo)入DNA本身生殖細(xì)胞、體細(xì)胞、個(gè)體（三）基因工程載體必須具備的條件：

※（1）有復(fù)制起點(diǎn)

※（2）具有若干個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶的單一識(shí)別位點(diǎn)

※（3）具備合適的篩選標(biāo)記

※（4）具備合適的拷貝數(shù)目（5）分子量要相對(duì)較小（6）在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性要高（7）易分離純化※表示載體必須具備的條件（四）基因工程中常用的載體

基因工程中常用的載體有5類(lèi)：質(zhì)粒（plasmid）單鏈DNA噬菌體M13噬菌體的衍生物柯斯質(zhì)粒（cosmid）動(dòng)物病毒（virus）質(zhì)粒*受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例E.coli環(huán)狀〈8*pUC18/19,T-載體pGEM-3z等λ噬菌體E.coli線(xiàn)狀9-24kbEMBL系列，Λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀〈10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli環(huán)狀100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細(xì)胞線(xiàn)性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類(lèi)細(xì)胞線(xiàn)性染色體〉1000kb病毒載體動(dòng)物細(xì)胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲(chóng)桿狀病毒載體穿梭載體動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒載體的種類(lèi)和特征第一節(jié)質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）是獨(dú)立于染色體以外的能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。存在于細(xì)菌、霉菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。大腸桿菌的質(zhì)粒在大腸桿菌的各種菌體中找到了許多種不同類(lèi)型的質(zhì)粒，其中已經(jīng)作了比較詳盡研究的主要有F質(zhì)粒、R質(zhì)粒和Col質(zhì)粒。

①F質(zhì)粒又叫F因子或性質(zhì)粒（sexplasmid）。它們能夠使寄主染色體上的基因和F質(zhì)粒一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體細(xì)胞中去。

②R質(zhì)粒通稱(chēng)抗藥性因子。它們編碼有一種或數(shù)種抗菌素抗性基因，并且通常能夠?qū)⒋朔N抗性轉(zhuǎn)移到缺乏該質(zhì)粒的適宜的受體細(xì)胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力。

③Col質(zhì)粒即所謂產(chǎn)生大腸桿菌素因子。它們編碼有控制大腸桿菌素合成的基因。大腸桿菌是一類(lèi)可以使不帶有Col質(zhì)粒的親緣關(guān)系密切的細(xì)菌菌株致死的蛋白質(zhì)。（1）分子小：1.質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性1—200kb（2）編碼基因少：2—3個(gè)中等大小的蛋白質(zhì)。（3）環(huán)形狀：雙鏈環(huán)狀DNA。（酵母的“殺傷質(zhì)粒”是RNA）。如抗菌素抗性、代謝特征等，賦予細(xì)菌一些額外的特性（非必須）。1．當(dāng)其兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)時(shí)，稱(chēng)之為共價(jià)閉合環(huán)形DNA（cccDNA），這樣的DNA通常呈現(xiàn)超螺旋的SC構(gòu)型；

2．如果兩條多核苷酸鏈中只有一條保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個(gè)缺口時(shí)，稱(chēng)之為開(kāi)環(huán)DNA（ocDNA），此即OC構(gòu)型；

3．若質(zhì)粒DNA經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切限制酶切割之后，發(fā)生雙鏈斷裂形成線(xiàn)性分子（IDNA），通稱(chēng)L構(gòu)型（4）質(zhì)粒的空間構(gòu)型：（5）質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率在瓊脂糖凝膠電泳中，不同構(gòu)型的同一種質(zhì)粒DNA，盡管分子量相同，仍具有不同的電泳遷移就緒。其中走在最前沿的是SC

DNA，其后依次是LDNA和OCDNASCOCL（1）質(zhì)粒的類(lèi)型：在大腸桿菌中的質(zhì)粒，可以分為：接合型質(zhì)粒:非接合型質(zhì)粒能自我轉(zhuǎn)移不能自我轉(zhuǎn)移2質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移按接合轉(zhuǎn)移功能分類(lèi)主要基因按抗性記號(hào)分類(lèi)非接合型質(zhì)粒自主復(fù)制基因，產(chǎn)生大腸桿菌素基因Col質(zhì)粒自主復(fù)制基因，抗菌素抗性基因R質(zhì)粒(R因子)

接合型質(zhì)粒自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，細(xì)菌染色體區(qū)段F質(zhì)粒（F因子）自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，大腸桿菌素基因Col質(zhì)粒自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，抗菌素抗性基因R質(zhì)粒(R因子)自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，大腸桿菌素基因Ent質(zhì)粒除了帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。如：F質(zhì)粒（性質(zhì)粒、或F因子）：甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體菌中。又叫自我轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒。（1.1）接合型質(zhì)粒不符合基因工程的安全要求。（2）F質(zhì)粒(Fplasmid)又稱(chēng)F因子、致育因子或性因子，是大腸桿菌等細(xì)菌決定性別并有轉(zhuǎn)移能力的質(zhì)粒。分子量約為大小94kb，共編碼19個(gè)轉(zhuǎn)移基因。F質(zhì)粒在寄主細(xì)胞中有三種存在形式：以染色體外環(huán)形雙鏈質(zhì)粒DNA形式存在，不帶來(lái)自寄主染色體的基因或DNA區(qū)段。以染色體外環(huán)形雙鏈質(zhì)粒DNA形式存在，攜帶著細(xì)菌的染色體基因或DNA區(qū)段。以線(xiàn)性DNA形式從不同位點(diǎn)整合到寄主染色體上。F質(zhì)粒結(jié)構(gòu)：tra區(qū)（轉(zhuǎn)移區(qū)，與質(zhì)粒轉(zhuǎn)移和性菌毛合成有關(guān)）oriT（轉(zhuǎn)移起始點(diǎn)）oriS復(fù)制起始點(diǎn)）inc（不相容群）rep（復(fù)制功能）轉(zhuǎn)座因子根據(jù)F質(zhì)粒在細(xì)胞中的存在方式，可把大腸桿菌分成四種不同接合型菌株。（1）F+菌株F+菌株即“雄性”菌株，指細(xì)胞內(nèi)存在一至幾個(gè)F質(zhì)粒，并在細(xì)胞表面著生一至幾條性菌毛的菌株。（2）F-菌株F-菌株即“雌性”菌株，指細(xì)胞中無(wú)F質(zhì)粒、細(xì)胞表面也無(wú)性菌毛的菌株。（3）Hfr菌株（高頻重組菌株）在Hfr菌株（高頻重組菌株）細(xì)胞中，因質(zhì)粒由游離態(tài)轉(zhuǎn)為在核染色體組特定位點(diǎn)上的整合態(tài)，故Hfr菌株與F-菌株相接合后，發(fā)生基因重組的頻率比單純用F+與F-接合后的頻率高出數(shù)百倍。（4）F’菌株當(dāng)Hfr菌株細(xì)胞內(nèi)的F質(zhì)粒因不正常切離而脫離核染色體組時(shí)，可重新形成游離的、但攜帶整合位點(diǎn)鄰近一小段核染色體基因的特殊F質(zhì)粒，稱(chēng)F’質(zhì)粒或F’因子。在合適的條件下，將雄性細(xì)胞和雌性細(xì)胞混合培養(yǎng)，由于性須的作用，就會(huì)形成雌-雄細(xì)胞配對(duì)，這種過(guò)程稱(chēng)為細(xì)菌的接合作用（conjunction）。F因子DNA拷貝，需1分鐘時(shí)間從雄性細(xì)胞轉(zhuǎn)移到雌性細(xì)胞（3）質(zhì)粒DNA的接合轉(zhuǎn)移

①細(xì)胞交配對(duì)的形成雄性細(xì)胞的性須頂端與受體細(xì)胞表面接觸之后，便會(huì)迅速收縮，把給體細(xì)胞與受體細(xì)胞拉在一起。因此，性須在確立配對(duì)細(xì)胞表面間的緊密接觸方面，起著至關(guān)重要的作用。

大腸桿菌雄性細(xì)胞是不會(huì)同其它的亦帶有F質(zhì)粒的細(xì)胞發(fā)生配對(duì)作用的，因?yàn)閠raS和traT編碼的“表面排斥”蛋白質(zhì)，使此種細(xì)胞無(wú)法成為接合作用的受體。這就決定了雄性細(xì)胞只能同不具F因子的雌性細(xì)胞配對(duì)的特異性。

②質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移

F質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移是從轉(zhuǎn)移起點(diǎn)oriT開(kāi)始的。當(dāng)細(xì)胞交配對(duì)建立之后，TraY和TraI蛋白質(zhì)首先在oriT位點(diǎn)作單鏈切割，隨后缺口鏈在其游離的5′-端的引導(dǎo)下轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并作為模板合成互補(bǔ)鏈，形成新的質(zhì)粒分子。于是受體細(xì)胞便轉(zhuǎn)變成為具有F因子的雄性細(xì)胞。2.非接合型質(zhì)粒：雖然帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息，但失去了控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因，因此不能從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。（1）R質(zhì)粒（抗性質(zhì)粒）：帶有一種或數(shù)種抗生素抗性基因，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀（resistance）。符合基因工程的安全要求。帶有控制大腸桿菌素（colicin）合成的基因。（2）Col質(zhì)粒：大腸桿菌素對(duì)不帶Col質(zhì)粒的大腸桿菌有毒。Col質(zhì)?；騌質(zhì)粒如果帶有轉(zhuǎn)移基因，也可以成為接合型質(zhì)粒。

非接合型的質(zhì)粒，由于分子小，不足以編碼全部轉(zhuǎn)移體系所需要的基因，因而不能夠自我轉(zhuǎn)移。但如果在其寄主細(xì)胞中存在著一種接合型的質(zhì)粒，那么它們通常也是可以被轉(zhuǎn)移的。這種由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過(guò)程，叫做質(zhì)粒的遷移作用（mobilization）。

ColE1是一種可以遷移但是屬于非接合型的質(zhì)粒。需要質(zhì)粒自己編碼的兩種基因參與。一個(gè)是位于ColE1DNA上的特異位點(diǎn)bom；另一個(gè)是ColE1質(zhì)粒特有的彌散的基因產(chǎn)物，即mob基因（mobilizationgene）編碼的核酸酶。3質(zhì)粒DNA的遷移作用相容性的兩種質(zhì)粒F和ColE1共存于同一細(xì)菌細(xì)胞中，F(xiàn)質(zhì)粒可以為ColE1質(zhì)粒提供其所缺乏的結(jié)合功能，這樣使得ColE1質(zhì)粒也能夠發(fā)生轉(zhuǎn)移作用。（a）表示位于F-細(xì)胞中的ColE1質(zhì)粒的狀，它的mob基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄，其產(chǎn)物使bom位點(diǎn)發(fā)生單鏈斷裂而出現(xiàn)缺口，于是ColE1DNA便從超盤(pán)旋的的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成為缺口環(huán)狀的構(gòu)型。但ColE1質(zhì)粒缺乏形成性須的能力，無(wú)力進(jìn)行結(jié)合配對(duì)，所以它的DNA也就不能從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。正是由于不能夠發(fā)生轉(zhuǎn)移，這種從超盤(pán)旋到缺口環(huán)狀的構(gòu)型轉(zhuǎn)變過(guò)程，就有可能被回復(fù)，所以就出現(xiàn)這兩種構(gòu)型之間的平衡狀態(tài)。（b）中的細(xì)胞同時(shí)含有F和ColE1兩種質(zhì)粒。F因子能夠?qū)е滦皂毜暮铣?，為其DNA轉(zhuǎn)移提供了轉(zhuǎn)移裝置，因此ColE1可以被轉(zhuǎn)移。而在F質(zhì)粒提供的這種轉(zhuǎn)移裝置被分離掉的情況下，ColE1的mob-突變體便不能夠轉(zhuǎn)移。遺傳分析證明，mob-突變是隱性的，mob基因編碼一種蛋白質(zhì)。而且當(dāng)這種突變體質(zhì)粒被分離出來(lái)時(shí)，并不是以松弛復(fù)合物的形式存在。（c）所示，F(xiàn)質(zhì)粒無(wú)力幫助mob-突變體進(jìn)行轉(zhuǎn)移，其中F性須和轉(zhuǎn)移裝置雖已形成，但ColE1DNA并沒(méi)有發(fā)生缺口。（d）表示另一種具mob+表型并帶有一個(gè)順式顯性突變的ColE1突變體，它缺失了bom位點(diǎn)。在這樣的寄主細(xì)胞中，雖然能夠合成mob蛋白質(zhì)，但由于不能發(fā)生缺口，因此仍然不能夠轉(zhuǎn)移。4質(zhì)粒DNA的復(fù)制類(lèi)型1.低拷貝數(shù)的質(zhì)?？截悢?shù)少，只有1—3份拷貝，也稱(chēng)為“嚴(yán)緊型”復(fù)制控制的質(zhì)粒（stringentplasmid）2.高拷貝的質(zhì)粒拷貝數(shù)多，有10—60份拷貝，也稱(chēng)為“松弛型”復(fù)制控制的質(zhì)粒（relaxedplasmid）（非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型）。根據(jù)寄主細(xì)胞所含的拷貝數(shù)的多少，將質(zhì)粒分為低拷貝數(shù)的質(zhì)粒和高拷貝數(shù)的質(zhì)粒質(zhì)粒拷貝數(shù)：每條細(xì)菌染色體所平均具有的質(zhì)粒DNA分子數(shù)目。質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移能力，同它們的分子大小及復(fù)制類(lèi)型間存在一定的相關(guān)性。接合型質(zhì)粒，分子量大，一般屬?lài)?yán)緊型非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型（1）質(zhì)粒的不親和性現(xiàn)象

所謂質(zhì)粒的不親和性（plasmidincompatibility），有時(shí)也稱(chēng)為不相容性，是指在沒(méi)有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。在細(xì)胞的增殖過(guò)程中，其中必有一種會(huì)被逐漸地排斥（稀釋?zhuān)┑?。這樣的兩種質(zhì)粒稱(chēng)為不親和質(zhì)粒

不親和群（incompatibilitygroup），指具有親緣關(guān)系，但彼此之間是互不相容的質(zhì)粒。

5質(zhì)粒的不親和性（2）質(zhì)粒不親和性的分子基礎(chǔ)

質(zhì)粒不親和性的分子基礎(chǔ)，主要是由于它們?cè)趶?fù)制功能之間的相互干擾造成的。

大多數(shù)質(zhì)粒都會(huì)產(chǎn)生出一種控制質(zhì)粒復(fù)制的阻遏蛋白質(zhì)，其濃度是與質(zhì)粒的拷貝數(shù)成正比的。阻遏蛋白質(zhì)通過(guò)同其靶序列間的相互作用，使雙鏈DNA中的一條鏈斷裂，從而導(dǎo)致質(zhì)粒DNA復(fù)制的啟動(dòng)，并建立起一種調(diào)節(jié)質(zhì)?？截悢?shù)的負(fù)反饋環(huán)（negativefeedbackloop）。當(dāng)質(zhì)粒面臨高拷貝數(shù)和高濃度的阻遏蛋白質(zhì)時(shí)，其復(fù)制活動(dòng)便被抑制；而當(dāng)質(zhì)粒處于低拷貝和低濃度遏蛋白質(zhì)的條件下，它的復(fù)制反應(yīng)便會(huì)繼續(xù)進(jìn)行。

由于每一種質(zhì)粒的復(fù)制速率和拷貝數(shù)控制，都是由一對(duì)不相容質(zhì)粒產(chǎn)生的阻遏蛋白質(zhì)總濃度聯(lián)合調(diào)控的，這種交叉抑制的結(jié)果，使細(xì)胞中質(zhì)?？截悢?shù)，比其單獨(dú)感染狀態(tài)下的正?？截悢?shù)減少許多。同一細(xì)胞中含有兩種不相容的質(zhì)粒，其產(chǎn)生的阻遏蛋白質(zhì)不僅調(diào)節(jié)自身的復(fù)制，也會(huì)調(diào)節(jié)另一種與之共存的不相容質(zhì)粒的復(fù)制一．質(zhì)粒DNA復(fù)制的多樣性不同質(zhì)粒DNA的復(fù)制在如下幾個(gè)方面存多樣性：（i）對(duì)寄生酶的依賴(lài)性

有的完全利用寄主細(xì)胞所提供的核酸酶，有的自身也編碼若干核酸酶，參加DNA復(fù)制（ii）DNA聚合酶的利用

多數(shù)利用polIII,有的質(zhì)粒利用polI（iii）復(fù)制的方向性

有純單向的，純雙向的，有既有單向又又雙向的（iv）復(fù)制的終止

單向復(fù)制，在起點(diǎn)處終止復(fù)制雙向復(fù)制，在復(fù)制叉到達(dá)同一位點(diǎn)時(shí)終止，或有一固定的終止位點(diǎn)（v）復(fù)制型

蝶狀復(fù)制第二節(jié)質(zhì)粒DNA的復(fù)制與拷貝數(shù)的控制ColE1質(zhì)粒DNA的復(fù)制，是從一個(gè)特定的復(fù)制起點(diǎn)（ori）開(kāi)始，并沿著環(huán)DNA分子單向性地進(jìn)行?？刂拼朔N質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)的兩種關(guān)鍵因素RNAI和RNAⅡ兩種RNA分子，都是由ColE1DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的。RNAⅡ也叫做復(fù)制引物。RNAⅡ分子在轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)附近同互補(bǔ)的模板DNA形成一種雜交分子，被RnaseH酶所切割，從而釋放出3′-OH末端，作為供DNA聚合酶Ⅰ合成DNA的引物。RNAⅠ可以通過(guò)同RNAⅡ結(jié)合，以阻止其與模板DNA發(fā)生雜交作用。

從本質(zhì)上講，ColE1質(zhì)粒的復(fù)制啟動(dòng)顯然是受一種負(fù)反饋機(jī)理控制的。根據(jù)這種模型，細(xì)胞中RNAⅠ分子的濃度是隨著質(zhì)粒拷貝數(shù)的多寡而增減的。例如，若細(xì)胞中質(zhì)粒拷貝數(shù)下降到正常數(shù)值以下的水平，RNAⅠ的濃度也就相應(yīng)降低，于是質(zhì)粒的復(fù)制也就受到較少的抑制，結(jié)果導(dǎo)致其拷貝數(shù)的上升。二．ColE1質(zhì)粒DNA復(fù)制的啟動(dòng)三．質(zhì)粒復(fù)制控制的分子模型質(zhì)粒DNA復(fù)制控制機(jī)理的分子模型有兩種：自體阻遏蛋白質(zhì)模型（autorepressormodel）：阻遏蛋白質(zhì)的合成受負(fù)反饋（negativefeedback）機(jī)理調(diào)節(jié)，而且其濃度是恒定的。抑制蛋白質(zhì)稀釋模型（inhibitordilutionmodel）：阻遏蛋白質(zhì)是組成型合成，其濃度同質(zhì)粒的拷貝數(shù)成正比。（1）抑制蛋白質(zhì)稀釋模型質(zhì)粒DNA編碼的抑制蛋白質(zhì)同質(zhì)粒DNA的復(fù)制起點(diǎn)（oir）結(jié)合阻斷起始蛋白質(zhì)Rep的合成細(xì)胞中Cop蛋白質(zhì)的濃度是同質(zhì)粒分子的拷貝數(shù)成正比，它抑制質(zhì)粒DNA復(fù)制活性的作用方式有兩種途徑1.質(zhì)粒DNA的復(fù)制是由一種叫做起始蛋白質(zhì)Rep引發(fā)的Rep蛋白質(zhì)編碼基因rep和自體阻遏蛋白質(zhì)編碼基因atr是屬于同一個(gè)操縱子，它們共轉(zhuǎn)錄成同一個(gè)mRNA分子。自體阻遏蛋白質(zhì)通過(guò)同啟動(dòng)子-操縱基因區(qū)（P/O）的結(jié)合作用，調(diào)節(jié)質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)錄作用，以維持細(xì)胞中Atr和Rep蛋白質(zhì)處于恒定的水平。由Atr蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)產(chǎn)生的Rep蛋白質(zhì)，則是通過(guò)同復(fù)制起點(diǎn)（ori）的結(jié)合，來(lái)引發(fā)質(zhì)粒DNA的復(fù)制2.Rep蛋白質(zhì)是一種具有雙重功能的蛋白質(zhì)既具有自體阻遏蛋白質(zhì)的功能，可同P/O區(qū)結(jié)合而抑制轉(zhuǎn)錄作用又具有起始蛋白質(zhì)的功能，能對(duì)復(fù)制起點(diǎn)（ori）發(fā)生作用，引發(fā)質(zhì)粒DNA進(jìn)行復(fù)制（2）自體阻遏蛋白質(zhì)模型第三節(jié)質(zhì)粒DNA的分離與純化應(yīng)用質(zhì)粒作為基因克隆的載體分子，一個(gè)重要的條件是要獲得批量的純化的質(zhì)粒DNA分子。通常是加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉（SDS）來(lái)促使大腸桿菌細(xì)胞裂解的，絕大部分的染色體DNA分子都將以高分子量的形式釋放出來(lái)，這樣便可以應(yīng)用高速離心的方法使之與細(xì)胞碎片一起被沉淀除去，得到了比較清亮的裂解液。一．氯化銫密度梯度離心法

在細(xì)胞裂解及DNA分離的過(guò)程上，大分子量的細(xì)菌染色體DNA容易發(fā)生斷裂形成相應(yīng)的線(xiàn)性片段，而質(zhì)粒DNA則由于其分子量較小、結(jié)構(gòu)緊密，因此仍能保持完整的狀態(tài)。

氯化銫-EtBr密度梯度離心法，就是根據(jù)這一差別建立的純化質(zhì)粒DNA的經(jīng)典技術(shù)。當(dāng)將含有溴化乙錠（EtBr）的氯化銫（CsCl）溶液加到清亮的大腸桿菌裂解液中時(shí)，EtBr扁平分子便會(huì)通過(guò)在堿基對(duì)之間的嵌入作用而結(jié)合成DNA分子鏈上，并因此導(dǎo)致雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解旋反應(yīng)。線(xiàn)性的或開(kāi)環(huán)的DNA分子，例如大腸桿菌染色體DNA片段，可結(jié)合相當(dāng)大量的EtBr分子。而像質(zhì)粒這樣的共價(jià)閉合環(huán)狀的DNA（cccDNA）分子，EtBr分子的結(jié)合數(shù)量相對(duì)較少。在DNA-EtBr復(fù)合物中，結(jié)合的EtBr分子數(shù)量越多，其密度也就越低。通過(guò)氯化銫密度梯度離心之后，根據(jù)它們的不同密度，就會(huì)平衡在不同的位置，從而達(dá)到純化質(zhì)粒DNA的目的。線(xiàn)性的或開(kāi)環(huán)的DNA分子，可結(jié)合相當(dāng)大量的EtBr分子，密度低共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA（cccDNA）分子，EtBr分子的結(jié)合數(shù)量相對(duì)較少，密度高通過(guò)氯化銫密度梯度離心，根據(jù)它們的不同密度，就會(huì)平衡在不同的位置，從而達(dá)到純化質(zhì)粒DNA的目的。

根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線(xiàn)性染色體DNA片段之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來(lái)的。

通過(guò)加熱，在pH值介于12.0～12.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，連接DNA互補(bǔ)鏈之間的氫鍵會(huì)被斷裂，但由于cccDNA的雙螺旋主鏈骨架的彼此盤(pán)繞作用，互補(bǔ)的兩條鏈仍然會(huì)緊密地結(jié)合在一起。通過(guò)致冷或恢復(fù)中性pH值更會(huì)迅速地復(fù)性，復(fù)性迅速而準(zhǔn)確。

線(xiàn)性的染色體DNA分子，在此過(guò)程中彼此已經(jīng)分離開(kāi)來(lái)的互補(bǔ)鏈之間的復(fù)性作用就不會(huì)那么迅速而準(zhǔn)確。它們聚集形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心分離便會(huì)與變性的蛋白質(zhì)及RNA一道沉淀下來(lái)。仍然滯留在上清液中的質(zhì)粒cccDNA則可用酒精沉淀法收集。二．堿變性法

微量堿變性法具有簡(jiǎn)單快速、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前分子生物學(xué)及基因工程研究工作中最常用的一種分離純化質(zhì)粒DNA的方法

第一步，取1.5毫升含有質(zhì)粒的大腸桿菌過(guò)夜培養(yǎng)物加在微量離心管中，離心收集細(xì)胞沉淀，并用100微升冰冷的溶液I[50mM葡萄糖，25MmTris-HCl（Ph8.0），10MmEDTA，4～5mg溶菌酶/mL]重新懸浮。將反應(yīng)混合物在室溫下靜置5分鐘，讓溶菌酶充分發(fā)揮效力，促使大腸桿菌細(xì)胞變得脆弱而易于裂解。溶菌酶對(duì)反應(yīng)液的pH值有很大的依賴(lài)關(guān)系，TrisHCl緩沖體系和適量的葡萄糖而有利于pH的調(diào)節(jié)。乙二胺四乙酸（EDTA），可抑制酸酶的活性，從而保護(hù)質(zhì)粒DNA免被降解。

第二步，加入200微升冰冷的溶液Ⅱ[0.2NNaOH,1.0%SDS]，緩緩混勻后，置室溫下5分鐘。SDS的作用在于使細(xì)胞裂解，以釋放質(zhì)粒及染色體的DNA。在高pH值（12.0～12.5）的反應(yīng)體系中，則會(huì)使線(xiàn)性缺口的質(zhì)粒DNA以及線(xiàn)性的染色體DNA片段被選擇性地變性，而共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA則不會(huì)受影響。三．微量堿變性法第三步，加入150微升冰冷的pH4.8的3M醋酸鈉，緩緩震蕩10秒鐘后，放置在冰浴中5分鐘。PH4.8的醋酸鈉溶液降低了反應(yīng)混合物中的pH值，起到中和作用，從而使線(xiàn)性的質(zhì)粒及染色體DNA復(fù)性，并聚集成不可溶的網(wǎng)絡(luò)狀聚合物。同時(shí)高濃度的醋酸鈉亦會(huì)引起蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物和高分子量的RNA分子發(fā)生沉淀。通過(guò)離心處理，便可把網(wǎng)絡(luò)狀的DNA聚合物同變性的蛋白質(zhì)-DNA及RNA等以復(fù)合物形式沉淀出來(lái)，從而使質(zhì)粒DNA得到純化。第四步，將上述離心所得的主要是含有質(zhì)粒cccDNA上的清液，用苯酚抽提數(shù)次除去蛋白質(zhì)污染物，最后按酒精沉淀法收集質(zhì)粒DNA。

按照這種方法制備的質(zhì)粒DNA，其純度完全可以滿(mǎn)足常規(guī)的基因克隆實(shí)驗(yàn)要求。如有必要亦可用凝膠過(guò)濾法作進(jìn)一步的純化。（1）寄主菌株的遺傳背景

大腸桿菌寄主菌株的正確選擇，是獲得高產(chǎn)量質(zhì)粒DNA的重要條件之下。建議使用endA基因發(fā)生突變的（endA1）大腸桿菌寄主菌株，例如DH5α、JM109以及XL1-Blue等。EndA基因突變的結(jié)果，使大腸桿菌寄主細(xì)胞失去了合成具有功能活性的核酸內(nèi)切酶I的能力，從而增進(jìn)了所含有的質(zhì)粒DNA分子的穩(wěn)定性。所以從這類(lèi)寄主細(xì)胞中制備的質(zhì)粒DNA不僅在質(zhì)量上有所改進(jìn)，同時(shí)在產(chǎn)量上也得到了提高。四．影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素（2）質(zhì)粒的拷貝數(shù)及分子大小

細(xì)菌培養(yǎng)物中質(zhì)粒DNA之理論產(chǎn)量，可以根據(jù)公布的質(zhì)粒的拷貝數(shù)和分子量大小（bp）及每毫升培養(yǎng)物中的大腸桿菌細(xì)胞總數(shù)三者相乘得出。質(zhì)粒分子拷貝數(shù)的多寡和質(zhì)粒分子大小是決定其DNA產(chǎn)量的重要因素之一。（1）分子量大，拷貝數(shù)低第四節(jié)質(zhì)粒載體的構(gòu)建1.天然質(zhì)粒的局限性第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子長(zhǎng)9.1kb。但只有一個(gè)EcoRI切點(diǎn)充當(dāng)克隆位點(diǎn)，Tetr作為篩選標(biāo)志。天然質(zhì)粒,是指那些沒(méi)有經(jīng)過(guò)以基因克隆為目標(biāo)的體外修飾改造的質(zhì)粒。在大腸桿菌中，常見(jiàn)的要用于基因克隆的天然質(zhì)粒有ColE1RSF2124和pSC101等。ColE1質(zhì)粒的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素E1（colicinE1）。（2）篩選標(biāo)志不理想可以通過(guò)插入失活篩選。但細(xì)菌群體容易自發(fā)突變出抗colicinE1的細(xì)胞…….colicinE1能殺死不含ColE1質(zhì)粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位點(diǎn)EcoRI正好位于這個(gè)基因的內(nèi)部。ColE1（1）具有復(fù)制起點(diǎn)（ORI）2.質(zhì)粒載體必須具備的基本條件（2）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性?xún)?nèi)切酶的單一位點(diǎn)：是篩選的標(biāo)志。理想的載體應(yīng)該有兩種抗菌素抗性基因。用來(lái)插入外源DNA片斷。且插入后不影響復(fù)制功能。（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。氨芐青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性（Kanr）四環(huán)素抗性（Tetr）鏈霉素抗性（Strr）氯霉素抗性（Cmlr）3.質(zhì)粒的選擇標(biāo)記及其工作原理：（1）選擇標(biāo)記①抗菌素抗性絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性標(biāo)記：在基因克隆中采用的質(zhì)粒載體的選擇記號(hào)，包括有新陳代謝特性、對(duì)大腸桿菌素E1的免疫性，以及抗菌素抗性等多種。

常用抗菌素的抗性工作原理i）氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）青霉素的衍生物。通過(guò)干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成的末端反應(yīng)，殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌。a）抑菌原理b）細(xì)菌抗性原理Ampr基因編碼-內(nèi)酰胺酶，特異地切割氨芐青霉素的-內(nèi)酰胺環(huán)。ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）通過(guò)與50S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌。b）細(xì)菌抗性原理Cmlr

編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶，特異地使氯霉素乙?；Щ?。a）抑菌原理a）殺菌原理iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）通過(guò)與70S核糖體結(jié)合，導(dǎo)致mRNA發(fā)生錯(cuò)讀。殺死細(xì)菌。b）細(xì)菌抗性原理Kanr

編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，對(duì)卡那霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體結(jié)合作用。iv）鏈霉素（Streptomycin，Str）a）殺菌原理通過(guò)與30S核糖體亞基結(jié)合，導(dǎo)致mRNA錯(cuò)譯。殺死細(xì)菌。b）細(xì)菌抗性原理Strr

編碼一種氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶對(duì)鏈霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體30S亞基結(jié)合作用。v）四環(huán)素（Tetracycline，Tet）b）細(xì)菌抗性原理a）抑菌原理通過(guò)于30S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌。Tetr編碼特異性蛋白質(zhì)，對(duì)細(xì)菌的膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，組止四環(huán)素通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。②

遺傳標(biāo)記使受體菌發(fā)生遺傳性狀的改變的基因。當(dāng)帶有抗菌素抗性基因的載體進(jìn)入受體菌后，受體菌才能生長(zhǎng)。不帶有抗菌素抗性基因的受體菌不能在含有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長(zhǎng)。（2）抗菌素選擇原理活死抗性基因抗菌素4.人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體的類(lèi)型（1）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體ColE1、pMB1派生質(zhì)粒具有高拷貝數(shù)的特點(diǎn)。而且在沒(méi)有菌體蛋白質(zhì)合成的條件下（蛋白質(zhì)合成抑制劑，氯霉素等存在下）仍能復(fù)制，達(dá)到每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)1000—3000個(gè)！適合大量增殖克隆基因、或需要表達(dá)大量的基因產(chǎn)物。（2）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體

但有特殊用途:由pSC101派生來(lái)的載體特點(diǎn)是分子量小，拷貝數(shù)低。當(dāng)有些被克隆的基因的表達(dá)產(chǎn)物過(guò)多時(shí)會(huì)嚴(yán)重地影響寄主菌的正常代謝活動(dòng)，導(dǎo)致寄主菌死亡時(shí)，就需要低拷貝的載體。pLG338、pLG339、pHSG415等不適合大量擴(kuò)增DNA用。適合于克隆含量過(guò)高對(duì)寄主代謝有害的DNA。（3）失控的質(zhì)粒載體（runawayplasmidvectors）這是一類(lèi)溫度敏感型復(fù)制控制質(zhì)粒。溫度低（低于37oC），拷貝數(shù)很少；溫度增加（>40oC）時(shí)，拷貝數(shù)會(huì)很快增加到1000個(gè)以上。1979年B.E.Uhlin等構(gòu)建。如pBEU1、pBEU2。在這種高溫環(huán)境下，細(xì)胞的生長(zhǎng)蛋白質(zhì)的合成可按正常的速率持續(xù)2～3小時(shí)。這期間編碼在質(zhì)粒載體上的基因產(chǎn)物便超過(guò)了常量。最后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到了抑制，并失去了存活的能力，但在這個(gè)階段質(zhì)粒DNA可累積到占細(xì)胞總DNA的50%。（4）插入失活型質(zhì)粒載體載體的克隆位點(diǎn)位于其某一個(gè)選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部。如pDF41、pDF42、pBR329。抗菌素抗性外源DNA無(wú)抗菌素抗性選用插入失活型質(zhì)粒，將外源DNA片段插入在會(huì)導(dǎo)致選擇記號(hào)基因（如tetr、ampr、cmlr等）失活的位點(diǎn)，就有可能通過(guò)抗菌素抗性的篩選，大幅度地提高獲得陽(yáng)性克隆的幾率。（5）正選擇的質(zhì)粒載體(Directselectionvectors)如pUR2、pTR262等。只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。具有直接選擇記號(hào)并賦予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型。通過(guò)選擇具這種表型特征的轉(zhuǎn)化子，便可大大降低需要篩選的轉(zhuǎn)化子的數(shù)量，從而減輕了實(shí)驗(yàn)的工作量，提高了選擇的敏感性。目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正選擇載體。（6）表達(dá)型質(zhì)粒載體主要用來(lái)使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。如果在大腸桿菌里表達(dá)，必須把所克隆的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄—翻譯信號(hào)控制之下。注意啟動(dòng)子的性質(zhì)，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。使克隆在大腸桿菌中特定位點(diǎn)的外源真核基因的編碼序列置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄-轉(zhuǎn)譯信號(hào)控制之下，并能在大腸桿菌細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆載體特稱(chēng)為表達(dá)載體（expressionvectors）。它分為表達(dá)型質(zhì)粒載體和表達(dá)型噬菌體載體兩種不同的類(lèi)型。復(fù)制起始點(diǎn)ORI、選擇標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)MCS2）大腸桿菌操縱子元件阻遏基因I操縱基因O啟動(dòng)基因P核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（SD）轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)區(qū)。1）普通載體元件①表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)五、重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體

1.pSC101第一個(gè)成功地用于克隆實(shí)驗(yàn)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。（1）類(lèi)型天然質(zhì)粒，屬低拷貝型。（2）長(zhǎng)度9.09kb。（3）選擇標(biāo)記四環(huán)素抗性Tetr6個(gè)克隆位點(diǎn)：EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、BamHI、SalI主要使用EcoRI。（其中HindIII、BamHI、SalI3個(gè)位于選擇標(biāo)記Tetr的內(nèi)部）（4）克隆位點(diǎn)2.ColE1（1）類(lèi)型天然質(zhì)粒，屬高拷貝型。（2）長(zhǎng)度6.3kb。（3）選擇標(biāo)記大腸桿菌素（colicin）E1和對(duì)E1免疫的基因（immE1）特點(diǎn)是在培養(yǎng)基中加入氯霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成后，質(zhì)粒仍然能復(fù)制達(dá)到每個(gè)細(xì)胞1000-3000拷貝之多?、賑olicinE1基因的結(jié)構(gòu)ceaimmkil結(jié)構(gòu)基因免疫基因溶菌基因②殺死不含有ColE1細(xì)菌的原因cea+kil基因產(chǎn)物③不被其他細(xì)菌的colicinE1所殺死的原因imm基因EcoRI位于E1內(nèi)部，插入外源DNA會(huì)導(dǎo)致E1失活，使受體菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表現(xiàn)出對(duì)E1免疫型（ImmE1+）。EcoRI（4）克隆位點(diǎn)ColicinE1外源DNA無(wú)Colicin用對(duì)外源colicinE1的免疫性和自身不能合成colicinE1作選擇，操作非常繁雜。對(duì)colicinE1敏感的細(xì)菌群體中自發(fā)突變產(chǎn)生抗colicinE1的頻率很高?。?）ColE1的選擇缺陷ColE1抗colicinE1殺ColE1-仍抗colicinE1不殺ColE1-插入片斷ColE1目前在基因克隆中廣泛使用的一種大腸桿菌質(zhì)粒載體。（1）pBR322質(zhì)粒載體的構(gòu)建縮小基因組的體積移去一些對(duì)基因克隆載體無(wú)關(guān)緊要的DNA片段，限制酶識(shí)別位點(diǎn)，使質(zhì)粒同存在任何易位子統(tǒng)統(tǒng)失去功能。易位子的轉(zhuǎn)移（即易位）有可能導(dǎo)致選擇記號(hào)的喪失，甚至也有可能使克隆的DNA片段喪失或重排。構(gòu)建pBR322質(zhì)粒的還必須通過(guò)體內(nèi)易位或體外重組加入可選擇的抗藥性記號(hào)。3.pBR322：F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工構(gòu)建載體。Ampr來(lái)源Tn3易位8.3kb13.3kb2.6kbEcoRI*活性消化tetr來(lái)源5.3kbTn3易位10.2kbTn3易位8.8kbEcoRI*活性消化4.3kb構(gòu)建關(guān)鍵：體內(nèi)易位或體外重組加入可選擇的抗藥性標(biāo)記；除去非必要的區(qū)段降低分子量。帶控制大腸桿菌素E1合成的基因和Ampr基因帶五個(gè)抗藥性基因和帶Ampr基因的易位子Tn3pMB8:帶控制大腸桿菌素E1免疫性基因和EcoRI單一識(shí)別位點(diǎn)pMB9:帶ColE1質(zhì)粒復(fù)制特性，含對(duì)大腸桿菌素E1免疫性基因，EcoRI單一識(shí)別位點(diǎn)和四環(huán)素抗性基因pBR312：具雙重抗性pBR313：Tn3易位子上的BamHI位點(diǎn)消失，不再易位pBR322質(zhì)粒是由三個(gè)不同來(lái)源的部分組成的：來(lái)源于R7268質(zhì)粒易位子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（ampr）；來(lái)源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（tetr）；來(lái)源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點(diǎn)（ori）.pSP2124質(zhì)粒的Ampr基因pBR322元件來(lái)源①?gòu)?fù)制起點(diǎn)oripMB1系列（來(lái)源于ColE1）的高拷貝型復(fù)制起點(diǎn)②

Ampr基因③Tetr基因pSC101的Tetr基因。（2）長(zhǎng)度4363bp（3）選擇標(biāo)記氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。（4）克隆位點(diǎn)其中9個(gè)會(huì)導(dǎo)致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；3個(gè)會(huì)導(dǎo)致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。24個(gè)克隆位點(diǎn)。（5）pBR322的優(yōu)點(diǎn)①雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記

插入失活，分兩次先后選擇：沒(méi)有獲得載體的寄主細(xì)胞

在Amp或Tet中都死亡。獲得載體的寄主細(xì)胞

在Amp或Tet其中之一中死亡。外源基因BamHIAmp中存活但在Tet中死亡外源基因PstITet中存活但在Amp中死亡氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞可達(dá)1000~3000copy④安全失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過(guò)接合轉(zhuǎn)移。③高拷貝數(shù)②分子小，克隆能力大載體越小越好。>10kb的DNA在純化過(guò)程中容易斷裂。Mob基因已經(jīng)缺失，但保留了轉(zhuǎn)移蛋白（mob）的作用位點(diǎn)。（6）pBR322的缺點(diǎn)能夠被ColK質(zhì)粒編碼的mob蛋白識(shí)別，如果再有F質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移！從生物安全的角度出發(fā)，不希望載體具易位能力及接合轉(zhuǎn)移的功能①刪除mob識(shí)別位點(diǎn)（如質(zhì)粒pBR327、pAT153等）。pAT153：從pBR322上切去HaeI