野生與栽培甘草藥用成分含量差異形成的基因機(jī)制

5.3.3與野生甘草快速積累藥用成分相關(guān)的基因機(jī)制探討因此，為了能夠更全面的研究野生與栽培甘草藥用成分含量差異的實(shí)質(zhì)，我們從EST的角度出發(fā)，利用抑制性差減雜交技術(shù)，構(gòu)建了野生甘草快速積累藥用成分的SSH-cDNA文庫(kù)，通過(guò)EST測(cè)序和生物信息學(xué)分析，就野生甘草快速積累藥用成分方面的功能做出了初步的推測(cè)。野生甘草根在積累藥用成分的速度上區(qū)別于栽培甘草根的內(nèi)在原因可能和以下這些基因的表達(dá)有關(guān):谷朧甘膚一S一轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferaseGST24)、查爾酮合酶(chalconesynthase,CHS)、富含脯氨酸蛋白(prolinerichprotein).S_腺普甲硫氨酸合成酶、苯丙氨酸解氨酶(PAL),聚酮還原酶(GGPKR2),1,3-}-D葡葡糖普酶、聚泛素蛋白和熱休克蛋白HSP70o谷脆甘膚-S一轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferase,GST)是植物在生物與非生物脅迫中清除活性氧的化合物之一。它可催化親核性的谷朧甘膚與各種親電子外源化合物的結(jié)合反應(yīng)[y2s}。更有研究顯示，GST在高等生物體內(nèi)能夠防御NO對(duì)細(xì)胞的損害y2}}。本文庫(kù)中的ghztathioneS-transferaseGST24參與細(xì)胞色素P450外源物質(zhì)的代謝。(表5-3)而植物細(xì)胞色素P450是高等植物中最大的酶蛋白家族，被人們稱為萬(wàn)能的生物催化劑，其可催化合成菇類、黃酮類、植物激素等多種生物物質(zhì)的合成.我們可以推測(cè)，野生甘草由于長(zhǎng)期受外界不良環(huán)境的影響，glutathioneS-transferaseGST24表達(dá)量增加，進(jìn)而導(dǎo)致其體內(nèi)細(xì)胞色素P450基因表達(dá)量增加，從而催化甘草中主要藥用成分甘草酸和黃酮類等物質(zhì)的積累。目前已有人從甘草中分離得到的基因CYP88D6和CYP72A154，其應(yīng)CYP72A154編碼的P450單加氧酶催化盡香樹(shù)脂醇(,8-amyrin)的C-30氧化反應(yīng)[83]。另外，來(lái)自同一甘草cDNA文庫(kù)的F2H基因(P45。的一種)也已經(jīng)被克隆[[129]其在調(diào)控甘草中黃酮類化合物生物合成中起到重要的作用:在植物體內(nèi)，黃酮類化合物是一類重要的次生代謝產(chǎn)物，在植物的抗紫外線灼傷、抗脅迫和外源基因的表達(dá)等過(guò)程中均起著起著重要的作用。其生物合成途徑起始于苯丙烷代謝途徑[[93]，而查爾酮合酶(chalconesynthase,CHS)則是苯丙烷類合成途徑中的第1個(gè)關(guān)鍵酶和限速酶，它催化3分子的丙二酞輔酶A與1分子對(duì)經(jīng)基苯丙烯酞輔酶A縮合成袖皮素查爾酮，以此為支架從而衍生出其他黃酮類化合物!93,130]。有研究認(rèn)為，CHS也可被脯氨酸誘導(dǎo)而大量表達(dá)[‘川，而脯氨酸是植物蛋白質(zhì)的組分之一，以游離的狀態(tài)廣泛存在于植物體中。在逆境條件下(旱、鹽堿、熱、冷、凍)，植物體內(nèi)脯氨酸的含量顯著增加。植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強(qiáng)的品種往往積累較多的脯氨酸[132,133]。本文庫(kù)得到的contig48和78分別編碼prolinerichprotein和chalconesynthase，由此我們可以推測(cè)，野生甘草極有可能是由于受到干旱的刺激，大量的脯氨酸開(kāi)始積累，并進(jìn)而誘導(dǎo)CHS的表達(dá)量隨之增加，從而導(dǎo)致野生甘草中總黃酮的含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于栽培甘草。甲硫氨酸與ATP在S一腺普甲硫氨酸合成酶的催化下可生物合成S一腺普甲硫氨酸。S-腺普甲硫氨酸是生物體內(nèi)重要的代謝中間物，參與了植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)氨丙基、轉(zhuǎn)甲基和轉(zhuǎn)硫等多種重要的生理過(guò)程，與多胺、乙烯和谷朧甘膚的合成等生化反應(yīng)密切相關(guān)，是多胺、乙烯和谷朧甘膚等生物合成的前體。而多胺、乙烯和谷朧甘膚都參與了多種植物的防御干旱、高鹽以及低溫等逆境脅迫的過(guò)程，如小麥、大豆、花生等[(134,136,136]。而研究顯示，甘草在受這些逆境脅迫的影響，甘草酸等次生代謝物質(zhì)大量積累[66,137]。由此，可以推測(cè)，本文庫(kù)中contig18編碼的S一腺普甲硫氨酸合成酶在甘草植物體內(nèi)可能也有類似的活性，從而最終影響甘草藥用成分的快速積累。甘草屬于喜光植物，其分布區(qū)域的年太陽(yáng)總輻射量一般在120千卡/平方厘米，年日照時(shí)數(shù)多在250。小時(shí)以上[l38]。研究表明，光照可激活苯丙烷代謝途徑，隨光照強(qiáng)度的增加，苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性升高。而PAL是苯丙烷次生代謝途徑合成黃酮類化合物以及木質(zhì)素等多種次生物質(zhì)的關(guān)鍵酶[139,140]aJiang等【14i]報(bào)道，增加紫外輻射可以使玉米葉片中PAL酶活性增加，從而導(dǎo)致總黃酮含量明顯增加。王云生等I}4z}證明光照可能以光信號(hào)或者脅迫信號(hào)引起胞內(nèi)第二信使cAMP和Cat+產(chǎn)生，從而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和苯丙烷次代謝物的積累。Teklemariam等[[i4}}研究證明，紫外線可以誘導(dǎo)PAL活性的提高，并且誘導(dǎo)是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上。本文庫(kù)中contig27編碼PAL的表達(dá)，原因可能是野生甘草生長(zhǎng)年限較長(zhǎng)，接受的光照時(shí)間比較長(zhǎng)，而且其在生長(zhǎng)過(guò)程中分布比較分散，接受的光照面積比較大，從而導(dǎo)致體內(nèi)積累的PAL遠(yuǎn)高于栽培甘草，因此總黃酮的合成量也要高于栽培甘草。Hayashi等[[144]研究光果甘草中發(fā)現(xiàn)了聚酮還原酶(GGPKR2)。研究表明，其可以與查爾酮合酶共同作用產(chǎn)生異甘草素，進(jìn)而在CHI的作用下生成甘草素。此外，1,3-p-D葡葡糖普酶在植物體內(nèi)廣泛存在，是能夠水解結(jié)合于末端非還原性的p-D葡葡糖鍵，同時(shí)釋放出[3-D葡葡搪和相應(yīng)的配基。可以推測(cè)，在本文庫(kù)中，contig40編碼的聚酮還原酶(GGPKR2)，在與查爾酮合酶共同作用下產(chǎn)生異甘草素，進(jìn)而在CHI的作用下生成甘草素。contig52編碼的1,3-}3-D葡葡糖普酶的存在也促進(jìn)甘草普和異甘草普進(jìn)一步裂解，產(chǎn)生其分別對(duì)應(yīng)的普元，即甘草素和異甘草素。從而導(dǎo)致野生甘草中的甘草素和異甘草素均明顯高于栽培甘草。聚泛素蛋白可以介導(dǎo)選擇性地降解冗余的蛋白質(zhì)，在環(huán)境脅迫、胞內(nèi)代謝、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分裂周期旺盛等多種因素的調(diào)節(jié)下會(huì)產(chǎn)生一些誘導(dǎo)型蛋白，當(dāng)逆境消失時(shí)這些蛋白也隨之被降解[yas}熱休克蛋白HSP70作為一組誘導(dǎo)型表達(dá)蛋白。在正常細(xì)胞中并不表達(dá)或表達(dá)量很少，但是在熱應(yīng)激或其他應(yīng)激原的作用下，則表達(dá)迅速增加。受到逆境脅迫后，表達(dá)量升高，促使植物自身產(chǎn)生應(yīng)答或防御反應(yīng)h}l在構(gòu)建的野生甘草快速積累藥用成分的SSH-cDNA文庫(kù)中，通過(guò)對(duì)得到的EST序列與已知植物序列在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行同源性比較，結(jié)合上述甘草主要藥用成分的生物合成途徑，為野生與栽培甘草藥用成分積累速度差異的產(chǎn)生找到分子上的證據(jù)，從而揭示野生甘草與人工甘草質(zhì)量差異的實(shí)質(zhì)。同時(shí)通過(guò)深入挖掘野生甘草快速積累藥用成分的基因共表達(dá)機(jī)制，為優(yōu)質(zhì)甘草培育生產(chǎn)實(shí)踐奠定理論基礎(chǔ)。6.1.3與野生甘草快速積累藥用成分相關(guān)的特異性EST篩選研究為深入探討野生甘草快速積累藥用成分的基因機(jī)制，本研究以相同栽培模式下，繁殖兩年的野生不定根和栽培實(shí)生根為材料，應(yīng)用抑制性差減雜交(SSH)技術(shù)對(duì)二者的差異基因進(jìn)行篩選研究。通過(guò)正向差減文庫(kù)共克隆得到了621條ESTs序列，通過(guò)對(duì)這些ESTs序列進(jìn)行聚類拼接后，共得到168條unigenes，其中包括55條contigs和113條singletons。序列長(zhǎng)度范圍為78}1017bp，平均長(zhǎng)度為278bp。分別對(duì)得到的unigenes進(jìn)行Nr,swissport,COG,GO,KEGG基因注釋和功能分類，初步推測(cè)與野生甘草快速積累藥用成分的基因機(jī)制可能和以下這些基因的表達(dá)有關(guān):谷耽甘膚-S一轉(zhuǎn)移酶(