大腸桿菌感受態(tài)制備重組dna轉(zhuǎn)化和抗藥性篩選

大腸桿菌感受態(tài)的制備、

重組DNA的轉(zhuǎn)化和抗藥性篩選基因克隆(又名分子克隆，DNA克隆)(genecloning)通過體外重組技術(shù),將一段目的DNA經(jīng)切割、連接插入適當載體，并導(dǎo)入受體細胞，擴增形成大量子代分子的過程?；蚩寺〉暮诵?---體外重組(

bination)

:

人工將一段目的DNA插入一個載體的過程。重組DNA技術(shù)(又名基因工程)(binant

DNA

technology)定義：實現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)的工作統(tǒng)稱為重組DNA技術(shù)，又稱基因工程。廣義的基因工程指按人們意愿設(shè)計，通過改造基因或基因組而改變生物的遺傳特性。如用重組DNA技術(shù)，將外源基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達，使大腸桿菌能夠生產(chǎn)人所需要的產(chǎn)品；將外源基因轉(zhuǎn)入動物，構(gòu)建具有新遺傳特性的轉(zhuǎn)基因動物；用基因敲除手段，獲得有遺傳缺陷的動物等。基因克隆示意圖載載DNA(限限限限限限限限)目目目目＋宿宿宿宿＋重重載已已已目宿宿宿宿陽限陽陽陽繁繁表表分、切接轉(zhuǎn)篩大腸桿菌感受態(tài)的制備及重組體轉(zhuǎn)化1感受態(tài)(competent)宿主細胞處于容易吸收外源性DNA的狀態(tài)，處于感受態(tài)的細胞稱為感受態(tài)細胞.1.1

制備感受態(tài)細胞的原理正常細胞都有細胞膜（細菌還有細胞壁）作屏障，對外源分子選擇性接受。在實驗中通過一定的理化條件使細胞通透性增大，處于感受態(tài)。1、CaCl2轉(zhuǎn)化程序法：傳統(tǒng)方法,轉(zhuǎn)化效率能達到5·106-2·107轉(zhuǎn)化子/mg質(zhì)粒DNA,簡單、快速、重復(fù)性好、菌株適用范圍廣。2、電穿孔轉(zhuǎn)化法；

3、脂質(zhì)體(liposome)法；4、胞核的顯微注射法(microinjection)；5、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染；6、聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。1.2

制備感受態(tài)細胞和轉(zhuǎn)化的常用方法一般受體菌對重組DNA分子的攝取能力很低，難以轉(zhuǎn)化成功。當細菌處于冰冷（0℃）0.05-0.1M的

CaCl2低滲溶液中，菌體的細胞膨脹成球形，細胞膜的通透性增加，對DNA的攝取能力增強，轉(zhuǎn)化效率提高（感受態(tài)細菌）。在轉(zhuǎn)化體系中形成DNA-抗DNase的羥基－磷酸鈣復(fù)合物能粘附于細菌表面，經(jīng)過42℃短時間熱休克（heatshock）處理，細胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生擾動，出現(xiàn)間隙促進感受態(tài)細胞吸收DNA復(fù)合物。在豐富培養(yǎng)基上生長1小時后，球狀細胞復(fù)原并分裂增殖，重組子中的基因在轉(zhuǎn)化細菌中得到表達，在選擇性培養(yǎng)

(selective

culture)平板上即可篩選出所需的轉(zhuǎn)化子。2

CaCl2法制備感受態(tài)細胞和轉(zhuǎn)化的原理0.1mol/LCaCl20℃重組體感受態(tài)細胞受體細胞細胞膜特性改變42

℃短時間熱休克細菌轉(zhuǎn)移到一冰冷的1.5ml的EP管，40C，4000rpm×5min棄上清，沉淀中加入冰冷的0.1mol/L

CaCl2

300μl，重懸菌體，冰浴20min40C，4000rpm×5min棄上清，將管倒置于濾紙上1min，使液體流干凈沉淀中加入冰冷的0.1mol/L

CaCl2

110

μl，重懸菌體。取感受態(tài)細菌100ml轉(zhuǎn)移到一無菌的1.5ml的EP管中每管加入質(zhì)粒5ml輕輕旋轉(zhuǎn)EP管，混勻混合物，在冰浴上放置20min試管放入420C的水浴中，放置90s，不要搖動EP管迅速將試管轉(zhuǎn)移到冰浴，冷卻1~2min取出EP管，每管加入LB培養(yǎng)基800

ml置于370C搖床（100~150r/min），溫和震蕩45min3實驗步驟用無菌彎頭玻璃鋪菌器將200ml菌液鋪于含Amp的瓊脂平板表面室溫放置10min，使液體被吸收倒置平皿，370C培養(yǎng)，12小時可見菌落生長重組DNA的抗藥性篩選重組體克隆的篩選與鑒定由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法得到含有重組

DNA的陽性克隆。不含質(zhì)粒的細菌不生長含pUC119-u6的白色菌落混合有氨芐青霉素的平板含pUC119-u6質(zhì)粒的細菌混合有氨芐青霉素的平板基因克隆基本步驟分（分離目的基因）：從生物體復(fù)雜的基因組中分離出所需要的DNA片段，即目的基因切（切割目的基因和基因載體）：用限制性內(nèi)切核酸酶切割目的基因和基因載體，以利于將兩者連接形成重組體。接（連接目的基因和基因載體）：在體外將目的基因連接到能夠自我復(fù)制的載體DNA分子上，形成重組DNA（重組體）。（4）轉(zhuǎn)（轉(zhuǎn)化至宿主細胞）：將重組體引入（轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染）到宿主細胞（受體細胞）中，轉(zhuǎn)化后的細胞進行擴增繁殖，獲得大量的細胞繁殖群體。（5）篩（篩選陽性細胞克?。簭拇罅康募毎敝橙后w中篩選出轉(zhuǎn)化成功（帶有重組體）的陽性細胞克隆。1目的基因的獲取1.1化學(xué)合成法：已知序列1.2基因組DNA文庫：將某種生物的基因組DNA切割成一定大小的片段，并與合適的載體重組后導(dǎo)入宿主細胞，進行克隆。這些存在于所有重組體內(nèi)的基因組DNA片段的集合，即基因組文庫，它包含了該生物的所有基因。用于研究基因在基因組中的情況。1.3cDNA文庫：以組織細胞中的mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄等反應(yīng)合成雙鏈cDNA，各cDNA分子分別插入載體形成重組子，再導(dǎo)入宿主細胞克隆擴增。這些在重組體內(nèi)的

cDNA的集合即cDNA文庫。僅包含正在表達的基因，總量少，易篩選。1.4聚合酶鏈反應(yīng)(PCR):廣泛采用2克隆載體的選擇和構(gòu)建基因工程的載體應(yīng)具有一些基本的性質(zhì)：1）在宿主細胞中有獨立的復(fù)制和表達的能力2）分子量盡可能小3）載體分子中最好具有兩個以上的容易檢測的遺傳標記4）載體本身最好具有盡可能多的限制酶單一切點。DNA克隆常用的載體有：質(zhì)粒載體(plasmid)，噬菌體載體(phage)、柯斯質(zhì)粒載體(cosimid)、單鏈DNA噬菌體載體

(ssDNA

phage)、噬粒載體(phagemid)及酵母人工染色體

(YAC)等。3外源基因與載體的連接①粘性末端連接：GGATCCCCTAGG②平頭末端連接：GTCGACCAGCTG③同聚寡核苷酸末端連接GTCCAGTTT④人工接頭分子連接：CTG+

AAAGACGGATCCCCTAGG四重組DNA導(dǎo)入宿主細胞①轉(zhuǎn)化(transformation)或轉(zhuǎn)染(transfection)：通過特殊的處理方法將外源遺傳物質(zhì)(如質(zhì)粒DNA等)導(dǎo)入原核或真核細胞，引起遺傳性狀變化的現(xiàn)象。②感染(infection)：病毒類侵染宿主菌的過程稱為感染，一般轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率比轉(zhuǎn)化高。五重組體的篩選(1)直接篩選：①抗藥性標志選擇②標志補救:藍白斑篩選(α互補原理篩選重組體)③分子雜交：廣泛用于篩選含有特異DNA順序的克隆。方法是將菌落或噬菌斑“印跡”到硝酸纖維膜等支持物上，變性后固定在原位，然后與標記的核酸探針進行雜交。陽性點的位置就是所需要的克隆。(2)免